Введение к работе
Актуальность темы
ДНК-лигазы являются одними из ключевых ферментов метаболизма ДНК и принимают участие в процессах репликации, репарации и рекомбинации. Они присутствуют у эукариот, бактерий и архей, и могут быть разделены на два семейства в соответствии с используемыми кофакторами, - АТФ-зависимые ДНК-лигазы (ЕС 6.5.1.1) и НАД -зависимые лигазы (ЕС 6.5.1.2). ДНК лигазы катализируют присоединение 5'-Р донорного конца к З'-ОН акцепторному концу в результате трех последовательных реакций переноса. АТФ-зависимые ДНК-лигазы найдены в бактериофагах, археях, эукариотах и эукариотических вирусах, в то время как НАД -зависимые ДНК-лигазы встречаются в основном у бактерий. Все известные в настоящее время эукариотические и архейные ДНК лигазы, а также лигазы из бактериофагов и вирусов, являются АТФ-зависимыми и содержат специфические мотивы в их аминокислотных последовательностях.
Археи являются одноклеточными организмами, обитающими, как правило, в экстремальных условиях окружающей среды, характеризующихся высокой или низкой температурой, экстремальными значениями рН и т.п. Одной из важнейших эволюционно древних групп архей являются термофилы. Основные пути метаболизма у архей и соответствующие ферменты сходны с бактериальными, в то время как аппарат репликации и экспрессии генетической информации, включая ДНК-лигазы, более близок к эукариотическому. Таким образом, ДНК-лигазы архей, в особенности гипертермофильных, представляют собой модель для изучения ДНК-лигаз эукариот, в частности, в качестве объектов структурных исследований.
ДНК-лигазы архей могут использовать в качестве кофактора АТФ, но, в отличие от ДНК-лигаз эукариот, некоторые лигазы гипертермофильных архей могут также использовать и НАД . Эти данные
позволяют предположить, что некоторые архейные ДНК-лигазы могут представлять неспециализированные предковые ферменты, являющиеся эволюционными предшественниками специализированных ДНК-лигаз бактерий и эукариот. Таким образом, ДНК-лигазы термофильных архей, являющихся эволюционно-древними организмами, представляют собой интересную модель для изучения фундаментальных проблем эволюции семейства ДНК-лигаз.
Наконец, важной особенностью ДНК лигаз термофильных архей является устойчивость этих ферментов к высоким температурам, открывающая, как и случае термостабильных ДНК-полимераз, перспективы их практического применения в молекулярной диагностике и генетической инженерии.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы является выделение и характеристика новых ДНК-лигаз из двух эволюционно удаленных друг от друга гипертермофильных архей, - эуриархеи штамма 1519 и кренархеи штамма Acidilobus aceticus 1904. Для этого в работе решались следующие задачи:
Молекулярная идентификация и определение филогенетического положения штамма термофильных архей 1519.
Выделение и секвенирование генов ДНК-лигазы LigThl519 из штамма 1519 и ДНК-лигазы LigAcl904 из Acidilobus aceticus 1904.
Создание штаммов Escherichia coli - продуцентов рекомбинантных ДНК-лигаз LigThl519 и LigAcl904, выделение и очистка ферментов.
Проведение биохимической характеристики рекомбинантных ДНК-лигаз, включающей определение зависимости активности от температуры и значения рН, концентрации солей, термостабильности, определение используемых нуклеотидных кофакторов.
Научная новизна и практическая значимость работы
Идентифицированы и охарактеризованы две новые ДНК-лигазы гипертермофильных архей, - кренархеи Acidilobus aceticus и эуриархеи Thermococcus sp 1519. Созданы системы экспрессии этих лигаз в клетках Е. coli, позволяющие получать рекомбинантные ферменты для функциональной характеристики и структурных исследований. Установлено, что обе ДНК-лигазы являются АТФ-зависимыми и, в отличие от всех ранее охарактеризованных ДНК-лигаз архей рода Thermococcus, не способны использовать в качестве «энергетического» кофактора НАД+.
Практическая значимость работы обусловлены перспективами применения термостабильных ДНК-лигаз для молекулярно-биологических исследований в самых различных областях деятельности, от медицины до криминалистики. Так, наряду с ПЦР, для детекции и амплификации специфических последовательностей ДНК, в том числе полиморфизмов ДНК, используется метод лигазной цепной реакции (ЛЦР). Этот метод известен уже давно и активно применяется в диагностической практике, например в США, в России он практически не используется, в значительной степени из-за отсутствия термостабильных ДНК-лигаз на Российском рынке. Новая ДНК-лигаза LigAcl904 является перспективной для использования в ЛЦР. Другой областью использования термостабильных лигаз является их использование для «сборки» синтетических генов из олигонуклеотидов проводимой при повышенной температуре для снижения вероятности образования неспецифических продуктов лигирования. Для этого может быть использована ДНК-лигаза LigThl519. Апробация работы
Полученные в диссертации результаты были представлены на следующих международных и российских конференциях: международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва,
2007), международной конференции "Thermophiles-2007" (Берген,
Норвегия, 2007), Международной конференции BioMicroWorld2007
(Севилья, Испания, 2007).
Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и
теоретических исследований. Основные результаты работы получены
лично автором при его непосредственном участии в планировании и
проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих
публикациях.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК. Получено 2 патента РФ на изобретения. Объем и структура диссертации
Материалы диссертации изложены на 114 страницах машинописного текста и включают 46 рисунков и 5 таблиц. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Цель и задачи работы", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", "Выводы", "Список публикаций по теме диссертации", "Список цитируемой литературы", который содержит 3 отечественных и 140 иностранных источника.
