Введение к работе
Актуальность темы. Острые кишечные инфекции (ОКИ) - чрезвычайно широко распространенные в современном мире инфекционные заболевания человека. Существенный удельный вес среди возбудителей ОКИ занимают патогенные Escherichia coli (Малый, 2011).
В последние несколько десятилетий наибольшую медицинскую и эпидемиологическую актуальность приобрела группа энтерогеморрагических эшерихий. Заболевание, вызванное энтерогеморрагическими эшерихиями, протекает тяжело и чревато развитием серьезного осложнения, представляющего реальную угрозу для жизни больного, - гемолитического уремического синдрома (ГУС). При развитии ГУ С острая почечная недостаточность наблюдается в 55-70% случаев, при этом смертность может составлять 3-7% (Banatvala et al., 2001). Энтерогеморрагические эшерихий представлены различными серогруппами, наибольшее эпидемиологическое значение из которых имеет 0157 серогруппа. Ассоциированные с этой группой возбудителей заболевания регистрируются по всему миру, включая Россию (Степаншин и др., 2005; Effler et al., 2001; Allison, 2002; Gillespie et al., 2005).
Отличительной чертой энтерогеморрагических эшерихий является продуцирование веротоксинов (шига-токсинов Stxl и Stx2), являющихся основными факторами патогенности возбудителей данной группы (Rowe, 1993). При этом показано, что при заражении штаммами, продуцирующими только Stx2, развивается более тяжелая форма заболевания, чем при заражении штаммами, продуцирующими Stxl или оба токсина одновременно (Kleanthous et al., 1990).
В настоящее время для идентификации энтерогеморрагических эшерихий 0157 серогруппы на территории Российской Федерации используются различные методы исследования, в том числе бактериологические и серологические. Бактериологический метод идентификации Е. coli 0157:Н7 основан на отсутствии у возбудителя фермента бета-Б-глюкуронидазы и неспособности ферментировать сорбитол в течение 24 часов.
Серологическая идентификация предусматривает выявление "О"- и "Н"-антигенов в реакции агглютинации на стекле с поликлональными эшерихиозными сыворотками или латекс-агглютинации с использованием латексных частиц, также приготовленных на основе поликлональных сывороток (МУК 4.2.992-00, 2001).
Однако интенсивность выделения возбудителя от больных постепенно снижается в течение болезни, достигая 50% и более низкого уровня через 5-8 дней от начала заболевания (Begue, 1998). Гемолитический уремический синдром обычно развивается спустя, как минимум, одну неделю после первых признаков диареи, и вероятность выделения возбудителя к этому времени путем простого высева на дифференциально-диагностические среды существенно уменьшается.
Кроме того, необходимо отметить, что Е. coli 0157 серогруппы имеют антигенное родство с другими эшерихиями, что в ряде случаев затрудняет их серологическую идентификацию при использовании диагностикумов на основе поликлональных сывороток.
Также необходимо отметить, что схема идентификации Е. coli 0157:Н7/Н- в настоящее время построена в основном на использовании диагностических
препаратов производства зарубежных фирм (МУК 4.2.2963-11, 2011), что затрудняет их широкое применение в сети практических лабораторий.
Из всего выше сказанного можно сделать заключение, что на данный момент существует потребность в разработке современных отечественных препаратов для выделения и идентификации энтерогеморрагических эшерихий, разработанных на основе более стандартных и высокоспецифичных реагентов.
Повысить эффективность обнаружения, выделения и идентификации Е. coli 0157 серогруппы можно путем предварительного селективного концентрирования микробных клеток возбудителя с помощью иммуномагнитной сепарации, а для разработки современных методов иммуноанализа в качестве альтернативы поликлональным сывороткам - использовать моноклональные антитела (МКА).
Наравне с использованием моноклональных антител одним из перспективных направлений в области создания высокочувствительных диагностических тест-систем является применение в качестве специфических диагностических лигандов аптамеров - одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот, специфически связывающихся с мишенью за счет образования вторичных структур.
Анализ научно-технической и патентной литературы показал, что наиболее эффективным подходом к созданию высокочувствительных тест-систем на основе аптамеров является иммуно-аптамерная ПЦР (полимеразная цепная реакция), один из вариантов иммуно-ПЦР. Комбинация моноклональных антител и аптамеров, используемая в данном диагностическом методе позволяет выявлять целевой микроорганизм или его антигены с высокой специфичностью, а детекция с помощью ПЦР в режиме реального времени - существенно увеличить чувствительность анализа по сравнению с классическим иммуноферментным анализом (ИФА).
В настоящее время зарубежными исследователями активно ведутся работы по получению аптамеров, специфичных к различным мишеням, в том числе к возбудителям инфекционных заболеваний (Camille et al., 2008; Cao et al., 2009; Duan etal., 2012; Lee etal, 2012).
В России исследования по получению мишень-направленных аптамеров для диагностики возбудителей инфекционных заболеваний до настоящего времени не проводились, в то же время развитие данного направления может являться важным дополнением к разрабатываемым технологиям высокочувствительной экспресс-диагностики.
Цель работы. Получение моноклональных антител и ДНК-аптамеров, перспективных для использования в качестве специфических лигандов в составе высокоэффективных отечественных диагностических тест-систем для выявления и идентификации энтерогеморрагических эшерихий 0157 серогруппы и секретируемого фактора патогенности - шига-токсина 2.
Задачи исследования:
1. Получение МКА к диагностически значимым антигенам Е. coli
0157 серогруппы, отбор антител, перспективных для разработки
иммунодиагностических тест-систем.
2. Изучение свойств отобранных МКА, оценка их диагностической значимости
с использованием различных форматов иммуноанализа: непрямого ИФА, «сэндвич»-
ИФА, дот-блот анализа, латекс-агглютинации, а также системы селективного
концентрирования микробных клеток возбудителя с использованием магнитных частиц.
-
Получение аптамеров, специфичных в отношении микробных клеток Е. coli 0157 серогруппы, изучение их свойств.
-
Разработка диагностической тест-системы на основе иммуно-аптамерной ПЦР с использованием полученных моноклональных антител и аптамеров.
-
Разработка эффективной технологии отбора аптамеров к секретируемому фактору патогенности энтерогеморрагических эшерихий - шига-токсину 2.
-
Получение аптамеров, специфичных в отношении секретируемого фактора патогенности энтерогеморрагических эшерихий - шига-токсина 2 с применением разработанной технологии, изучение их свойств.
Научная новизна:
-
Впервые в мире предложена универсальная технология отбора аптамеров к рекомбинантным белкам на основе сконструированного химерного белка, содержащего целевой белок-мишень, последовательность глютатион-8-трансферазы для связывания белка на магнитных частицах с иммобилизованным глютатионом, и пептидный субстрат, содержащий уникальный сайт расщепления протеазой (летальным фактором Bacillus anthracis).
-
Определены первичные и вторичные структуры полученных ДНК-аптамеров, специфичных в отношении Е. coli 0157 серогруппы и шига-токсина 2.
Практическая значимость:
1. Получены и депонированы в Государственную коллекцию патогенных
микроорганизмов и клеточных культур («ГКПМ-Оболенск») гибридомы-продуценты
высокоспецифичных МКА к О-антигену энтерогеморрагических Е. coli
0157 серогруппы.
-
Изготовлены экспериментальные образцы тест-системы в формате латекс-агглютинации для выявления и идентификации энтерогеморрагических Е. coli 0157 серогруппы, проведены их межлабораторные и комиссионные испытания.
-
Получены ДНК-аптамеры, высокоспепифичные в отношении микробных клеток Е. coli 0157 серогруппы, а также секретируемого фактора патогенности энтерогеморрагических эшерихий - шига-токсина 2.
4. Оформлена заявка на Патент «Способ специфического отбора
высокоаффинных молекул ДНК (ДНК-аптамеров) к рекомбинантным белкам»
№ 2012141216/10 (066419) от 27.09.2012.
Методы исследования. В исследовании использовались микробиологические (культивирование используемых в работе микроорганизмов, в том числе штаммов Е. coli — продуцентов рекомбинантных белков), биотехнологические (получение и культивирование гибридом, наработка МКА в асцитических жидкостях), иммунологические (ИФА, дот-блот анализ, латекс-агглютинация) и молекулярно-генетические (методы ПЦР, конструирование экспрессионных векторов) методы.
Положения, выносимые на защиту:
1. Полученные МКА высокоспецифичны в отношении О-антигена
энтерогеморрагических Е. coli 0157 серогруппы.
-
Диагностические тест-системы на основе полученных МКА обладают высокой специфичностью и чувствительностью определения; максимальная чувствительность анализа (1x10 м.к./мл) достигается при использовании системы селективного концентрирования микробных клеток возбудителя и последующей их детекцией в непрямом ИФА.
-
Полученный в результате отбора на микробные клетки Е. coli 0157:Н7 ДНК-аптамер характеризуется высокой специфичностью в отношении мишени.
4. Разработанная тест-система на основе иммуно-аптамерной ПЦР
обеспечивает специфическую детекцию микробных клеток Е. coli 0157 серогруппы с
чувствительностью до 1x10 м.к./мл.
-
Разработанная технология отбора аптамеров к рекомбинантным белкам позволяет избежать неспецифического отбора последовательностей, связывающихся с твердой фазой, таким образом, повышая эффективность отбора.
-
ДНК-аптамер, полученный с применением разработанной технологии, характеризуется высокой специфичностью в отношении секретируемого фактора патогенности энтерогеморрагических эшерихий - шига-токсина 2 и может применяться в качестве специфического лиганда в составе диагностических тест-систем.
Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве, главным образом, с к.б.н. А.В. Козырь, к.б.н. А.В. Колесниковым, к.б.н. Е.В. Беловой, д.б.н., проф. И.Г. Шемякиным. В исследованиях также принимали участие к.б.н. P.M. Шайхутдинова, А.Е. Хлынцева, О.Н. Красавцева. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на: Научно-практической конференции МУиС Роспотребнадзора, ФГУН ГНЦ ПМБ, «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 2009); Десятой юбилейной научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, СПбМАПО, 2010); Научно-практической школе-конференции МУиС научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2010); VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» (Москва, 2010); IV Международной научной заочной конференции «Научные достижения биологии, химии и медицины в сфере экологии, здоровья и качества жизни человека» (Москва , 2012), III Международной научно-практической конференции «Современная медицина и фармацевтика: анализ и перспективы развития» (Москва, 2012); 12-ой Международной конференции «Nutrition & Diagnostics» (Прага, 2012), V Международной научно-практической конференции «Современная медицина и фармацевтика: анализ и перспективы
развития» (Москва, 2012), 5-й Международной конференции «Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates» (Суздаль, 2012).
План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Ученого совета ГНЦ ПМБ 28 января 2010 г., протокол № 1., с изменениями, утвержденными Ученым советом от 19 ноября 2012 г., протокол №11.
Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного научного семинара ГНЦ ПМБ 9 ноября 2012 г., протокол № 26.
Публикации. Основное содержание работы отражено в 11 научных публикациях, в том числе в одной статье, опубликованной в рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК, и в одном Патенте РФ на изобретение (Заявка № 2012141216/10 (066419) от 27.09.2012).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования с их обсуждением, заключение, выводы, список сокращений, список литературы, включающий 22 работы отечественных и 228 - зарубежных авторов, и благодарности. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 16 таблицами.
