Введение к работе
Актуальность проблемы. Растения в природе сосуществуют с множеством микроорганизмов, ряд из которых может либо вызывать различные заболевания растений, либо приносить им определенную пользу. Проблема взаимодействия микроорганизмов и растений в последнее время привлекает все большее внимание исследователей в различных областях биологии и сельского хозяйства. Возможность контроля процесса сосуществования микроорганизмов и растений представляется весьма интересной научной и актуальной в практической задачей и сулит немалые перспективы как в повышении продуктивности сельскохозяйственных растений, так и в борьбе с различными эпифитотиями в природе. Это, в свою очередь, предполагает более глубокое изучение различных этапов микробно-растительных взаимодействий, начиная с молекулярно-генетических механизмов распознавания в системе микроорганизм - хозяин, биохимии метаболитов, обеспечивающих этот процесс и заканчивая моделированием искусственных ассоциаций между растениями и бактериями. Бактерии рода Erwinia являются представителями наиболее агрессивных фитопатогенов и способны вызывать различные заболевания у ряда растений. Erwinia carotovora ssp. carotovora, в частности, является возбудителем заболевания, называемого мягкая гниль. Эти бактерии поражают листья и стебли растений картофеля в период вегетации, а также клубни при хранении, чем наносят серьезный экономический ущерб. В связи с этим особую актуальность приобретает возможность контроля процесса патогенеза на разных его стадиях и изучение молекулярных механизмов супрессии патогенности, включая те из них, которые реализуются на уровне регуляции экспрессии генов.
Все имеющиеся на настоящий день подходы в защите растений от возбудителей различных заболеваний или вредителей можно подразделить на три основные группы: химические, биологические и аграрно-технические. Каждый из них имеет свои сильные стороны и недостатки как в плане эффективности борьбы с заболеваниями и вредителям, так и с точки зрения вредного воздействия на окружающую среду, человека и животных. Поэтому вопрос выбора более эффективного и дешевого метода защиты растений с наименьшими негативными последствиями для окружающей среды является актуальным. Достоинством биологических методов является специфичность и
длительность их воздействия на объект и возможность препятствовать размножению патогена. Исходя из этих соображений, внимание и научные интересы множества исследователей сосредоточены на поиске новых, более эффективных способов биологической борьбы с различными заболеваниями растений.
Цели и задачи исследования. Данная работа имела целью поиск, изучение и
структурно-функциональный анализ генетической детерминанты,
ответственной за супрессию патогенности бактерий рода Erwinia. В соответствии с поставленной целью решались следующие экспериментальные задачи:
-
Клонирование фрагментов геномной ДНК непатогенного вида Erwinia herbicola в различных бактериальных векторах и трансформация этими конструкциями клеток фитопатогенной бактерии Erwinia carotovora.
-
Скрининг, функциональная селекция и анализ трансформантов эрвиний.
-
Изучение in vitro и in vivo свойств селектированного штамма эрвиний. Исследование особенностей взаимодействия бактерий, утративших патогенность, с различными растениями.
-
Картирование и структурно-функциональный анализ элементов регуляции транскрипции и трансляции в составе плазмиды, супрессирующей патогенность.
Научная новизна. Результаты, полученные при выполнении данной работы, носят приоритетный характер. Получена плазмида рАМ28, которая супрессирует патогенность бактерий рода Erwinia при её введении в клетки фитопатогена. На плазмиде локализован ранее неизвестный ген speA, являющийся генетической детерминантой супрессии патогенности. Найдены и охарактеризованы регуляторные последовательности для транскрипции и трансляции гена. Обнаружен феномен одновременной инициации трансляции с использованием нескольких потенциальных последовательностей Шайна-Дальгарно и образованием белков разного размера. Впервые показано, что штамм Erwinia carotovora, содержащий плазмиду рАМ28 (штамм S14-13), способен не только колонизировать растения, но также менять их физиологическое состояние и защищать от действия фитопатогена. Практическая ценность работы. Полученные в работе новые данные о структуре промотора и сайтов связывания молекулы мРНК с рибосомой могут
быть применены для дальнейшего развития представлений о молекулярных механизмах регуляции экспрессии генов. Найденный на плазмиде рАМ28 сильный промотор РСН может быть использован для создания новых экспрессионных векторов с целью препаративного получения различных белков в бактериальной системе. При проведении исследований был модифицирован и усовершенствован тест на патогенность эрвиний, позволяющий за короткое время проводить скрининг большого количества трансформированных бактериальных клонов. Обнаруженный защитный эффект штамма эрвиний S14-13 позволяет начать разработку технологии защиты растений на основе их колонизации "обезоруженными " формами фитопатогенов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы. Работа изложена на 166 страницах машинописного текста, содержит 34 рисунка и 10 таблиц. Библиография включает 272 источника.
