Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 7
1.1. История создания тритикале 7
1.2. Классификация тритикале 8
1.2.1. Первичные тритикале 9
1.2.1.1. Гексаплоидные тритикале 9
1.2.1.2. Октаплоидные тритикале 10
1.2.2. Вторичные тритикале 11
1.2.2.1. Гексаплоидные тритикале 11
1.2.2.2. Октаплоидные тритикале 12
1.2.2.3. Тетраплоидные тритикале 13
1.3. Замещения хромосом у тритикале 14
1.4. Транслокации хромосом у тритикале 23
1.5. Дополнения хромосом у тритикале 26
1.6. Цитогенетические методы идентификации хромосом 28
1.6.1. Дифференциальное окрашивание и его использование для идентификации хромосом 29
7.6.1.1. Методы окрашивания хромосом с применением флуорохромов 30
1.6.1.1. Методы окрашивания на основе красителя Гимза
1.6.1.2. Использование методов дифференциального окрашивания в цитогенетических исследованиях злаков 32
1.6.2. Флуоресцентная in situ гибридизация 35
1.7. Использование молекулярных маркеров для идентификации хромосом 39
1.7.1. RFLP-маркеры 41
1.7.2. STS-маркеры 43
1.7.3. RAPD-маркеры 44
1.7.4. AFLP-маркеры 46
1.7.5. SSR-маркеры 47
1.7.6. ISSR-маркеры 50
ГЛАВА II. Материалы и методы 52
П.1. Растительный материал 52
II.2. Методы исследований 55
И.2.1. Приготовление хромосомных препаратов для процедур С-бэндинга и геномной in situ гибридизации 55
И.2.2. Процедура дифференциального С-окрашивания 56
хромосом
И.2.3. Выделение ДНК из растительного материала 57
И.2.4. ПЦР-анализ 58
11.2.5. Геномная in situ гибридизация 59
ГЛАВА III. Результаты и обсуждение 61
III. 1. Идентификация хромосомного состава линии яровой гексаплоидной тритикале 131/7 62
Ш.1.1. Разработка стратегии поиска генетического материала D-генома в геноме яровой тритикале 63
Ш.1.2. Идентификация ржано-пшеничной транслокации 76
Ш.1.2.1. Последовательное совмещение 76
дифференциального окрашивания и геномной in situ гибридизации на линии 131/7
Ш.1.2.2. Картирование точки рекомбинации 83
Ш.2. Цитогенетическая характеристика линий и образцов яровой тритикале 90
111.2.1. Выявление генетического материала генома D в линиях яровой тритикале 91
111.2.2. Идентификация замещений хромосом у тритикале с использованием геномной in situ гибридизации 93
111.2.3. Идентификация 2Ы/2П-замещения у линий яровой тритикале 99
Ш.2.3.1. Полиморфизм хромосомы 2D среди образцов яровой тритикале 100
Ш.2.3.2. Связь хромосомного состава с проявлением признаков у тритикале 102
Выводы 104
Рекомендации и предложения 105
Список использованной литературы 106
- История создания тритикале
- Дифференциальное окрашивание и его использование для идентификации хромосом
- Приготовление хромосомных препаратов для процедур С-бэндинга и геномной in situ гибридизации
- Разработка стратегии поиска генетического материала D-генома в геноме яровой тритикале
Введение к работе
Актуальность темы. Яровая тритикале обладает высоким потенциалом продуктивности и в сочетании с высоким качеством зерна может быть использована в различных направлениях. Недостаточная селекционно-генетическая проработка этой культуры препятствует широкому внедрению этой культуры в производство. Об этом, в частности, свидетельствуют данные о присутствии в Государственном реестре селекционных достижений, допущенных к использованию в 2007 г. лишь двух сортов этой культуры.
Для яровой тритикале показано широкое использование хромосомных замещений и транслокаций с уменьшением доли генетического материала ржи (Zillinsky, 1980; Gustafson, Lukaszewsky, 1984). Замещения и транслокации хромосом позволяют решать проблемы, характерные для яровой тритикале, как показано в отношении признаков хлебопекарных качеств зерна, высоты растений, продолжительности вегетационного периода, устойчивости к прорастанию на корню и другие (Rybka, 2003; Oracka, Lapinski, 2006; Wos et al, 2006). Оптимальный хромосомный состав, создаваемый на основе гомеологов А, В, D и R геномов или их плеч и отдельных участков, может служить основой для создания новых ценных форм тритикале с уникальными наборами хромосом и с определенными характеристиками в зависимости от направления использования и места выращивания (Mergoum, 2004).
Важным этапом в работе с линиями яровой тритикале, несущими замещения и транслокации является четкая идентификация замещения или транслокации с определением вовлеченных хромосом. Идентификация хромосом и их участков может быть выполнена с использованием различных методов - дифференциального окрашивания, молекулярного маркирования, геномной гибридизации in situ. Применение комплексного подхода с использованием разных методов позволяет осуществлять надежную идентификацию хромосомных наборов тритикале.
Цель и задачи. Цель исследований состояла в комплексном молекулярно-цитогенетическом анализе линий яровой гексаплоидной тритикале из коллекции кафедры генетики РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, характеризующихся по ряду хозяйственно-ценных признаков.
Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:
Цитогенетическое изучение линии яровой тритикале 131/7, несущей пшенично-ржаную транслокацию, методами дифференциального окрашивания и геномной in situ гибридизации.
Разработка комплексной методики идентификации и генетического картирования ржано-пшеничной транслокации на примере линии тритикале 131/7.
Определение геномного состава линий и образцов яровой тритикале PI-587512, Л-22, S-17, Л-24, к-1433, Л-8-4, Л-8-6, Л-26, S-17-4, Л-8-1, Л-8-3,Л-12,Л-13,Л-15.
Выявление замещений у отобранных линий и образцов с использованием микросателлитных маркеров и геномной гибридизации in situ.
Скрининг данных отобранных линий и образцов на наличие хроматина D-генома с помощью микросателлитных маркеров и их цитогенетическое изучение с помощью геномной in situ гибридизации.
Научная новизна результатов исследования. Впервые с помощью комплексного подхода, включающего микросателлитный анализ, дифференциального окрашивания и геномной in situ гибридизации проведен анализ 15 образцов яровой гексаплоидной тритикале. Модифицирован метод совмещения дифференциального окрашивания и геномной гибридизации in situ для идентификации ржано-пшеничных транслокаций. Разработана и апробирована методика быстрого скрининга коллекции тритикале на наличие генетического материала генома D на основе хромосом специфичных микросателлитных маркеров. Впервые установлено наличие замещения 2B/2D и 2RS.2RL-2BL-TpaH^OKauHH у линии 131/7. Впервые установлено наличие
2R/2D замещения у 7 образцов яровой тритикале. Показано наличие четырех вариантов по микросателлитным маркерам хромосомы 2D.
Практическая значимость. Методика скрининга коллекции на присутствие генетического материала D-генома на основе отобранных микросателлитных маркеров может быть использована для быстрого поиска замещенных и транслоцированных форм тритикале с участием этого генома. Оптимизированный метод совмещения дифференциального окрашивания и геномной гибридизации in situ рекомендуется для идентификации ржано-пшеничных транслокаций.
Выявленные формы с 2К/20-замещением могут быть использованы в качестве исходного материала в селекционном процессе яровой тритикале.
История создания тритикале
По предположению Вавилова (1935), рожь вошла в культуру, будучи сорняком пшеницы, которую возделывали в горах Кавказа. Несмотря на то, что эти два вида длительное время произрастают вместе, в природе не возникло плодовитых амфидиплоидов, хотя спонтанные гибриды иногда встречаются (Куркиев, 1974). Первые сведения о получении пшенично-ржаных гибридов появились в конце прошлого столетия - в 1875 г. в Шотландии Вильсон получил первый искусственный стерильный гибрид между пшеницей и рожью (Ригин, Орлова, 1977). Среди имеющихся четырех групп плоидности тритикале первыми были получены октаплоидные формы, которые возникли в результате спонтанного удвоения числа хромосом у пшенично-ржаных гибридов. Первое сообщение о них Римпау было сделано в 1891 г. (Сечняк, Сулима, 1984). Начиная с 1918 г. обширные работы по получению пшенично-ржаных гибридов были развернуты на Саратовской сельскохозяйственной опытной станции Мейстером (1936). Параллельно с ними в Швеции в 30-е годы начинаются интенсивные работы Мюнтцинга по созданию тритикале. Цитологическое изучение плодовитых форм тритикале показало их амфидиплоидную природу, что впервые было продемонстрировано Левитским и Бенецкой (1930). Позднее было установлено, что и тритикале Римпау, которое поддерживается в ботанических садах до нашего времени, также имеет удвоенное число хромосом (Lindshau, Oehler, 1935). Открытие полиплоидизирующего эффекта колхицина дало новые возможности для создания разных форм тритикале. В тридцатые годы прошлого века Лебедевым (1933) были выделены тетраплоидные тритикале, а Державиным (1938) и гексаплоидные - с участием тетраплоидной пшеницы и многолетней ржи. В середине двадцатого века во многих странах проводились интенсивные работы по созданию и изучению тритикале. Так, в Советском Союзе Писарев с сотрудниками проводил широкие исследования по созданию, в том числе, зимостойких сортов гексаплоидного тритикале на основе лучших по зимостойкости сибирских сортов-популяций ржи (Писарев, 1947, 1972; Писарев, Жилкина, 1963, 1967; Федорова, 1976, 1985). Параллельно велась интенсивная работа в Украинском институте растениеводства, генетики и селекции группой под руководством Шулындина, в Главном ботаническом саду АН СССР Махалиным и др., в Институте цитологии и генетики Сибирского отделения АН СССР Хвостовой и Шкутиной и во многих других научно-исследовательских центрах (Куркиев, 1974; Максимов, 1982; Махалин, 1963, 1979, 1986, 1992; Шулындин, 1970, 1981). Наиболее ценным этапом в селекции тритикале оказался синтез трехвидовых форм, объединяющих геномы мягкой и твердой пшениц из октаплоидной и гексаплоидной тритикале. Именно эти работы положили начало зернофуражной культуре - озимой зерновой и кормовой тритикале (Шулындин, 1976; Махалин, 1992).
Результатом разработанной программы в Канаде, начатой в 1954 г. в университете Манитоба, были первые коммерческие сорта тритикале Рознер (1970) и Уэлш (1977) (Сечняк, Сулима, 1984). Огромная работа с яровыми тритикале осуществляется международным центром по селекции кукурузы и пшеницы (CIMMYT). С 1969 г. данный центр осуществляет координацию работ по испытанию тритикале (Махалин, 1992; Varughese, 1996; Schlegel, 1996).
Наряду с работами по селекции проводятся обширные цитогенетические исследования тритикале по выяснению причин низкой плодовитости, морщинистости зерна, цитологической нестабильности и др.
Анализ имеющейся литературы свидетельствует, что к настоящему времени сложилась следующая система (Oettler, 1998; Пыльнев и др., 2005): первичные тритикале: о гексаплоидные, о октаплоидные; вторичные тритикале: о гексаплоидные, о октаплоидные, о тетраплоидные. Рассмотрим подробнее характеристики каждой из этих групп.
Тритикале, полученные от скрещивания разных видов пшеницы с рожью с последующим удвоением числа хромосом, а также при скрещивании этих тритикале (одного уровня плоидности) между собой, называются первичными.
Гексаплоидные тритикале (2п=6х=42) получают скрещиванием тетраплоидных пшениц с диплоидной рожью и дальнейшим удвоением числа хромосом. Именно эти формы тритикале широко используются в селекционных программах. Первый пшенично-ржаной гибрид был получен с участием T.dicoccoides Вильсоном более 100 лет назад (Gupta, Reddy, 1997). Амфидиплоид между тетраплоидной пшеницей и диплоидной рожью впервые был синтезирован Державиным (1938), который использовал S. montanum. Первый амфидиплоид с участием культурной ржи был получен О Мага (1948). Скрещиваемость тетраплоидных пшениц с рожью может колебаться от 0 до 60 процентов (Krolow, 1975; Сечняк, Сулима, 1984; Balatero, Darvey, 1993). При сравнительно высоком проценте завязываемости гибридных зерновок наблюдается низкая их жизнеспособность. Для сохранения гибридных зародышей часто применяются методы эмбриокультуры (Immonen, Varughese, 1991).
Дифференциальное окрашивание и его использование для идентификации хромосом
Основные методы, с помощью которых выявляется сегментация хромосом по длине, были разработаны в 60-70-е годы прошлого века и совершенствуются в настоящее время. Рассмотрим основные методики дифференциального окрашивания и механизмы проявления исчерченности хромосом.
Q-окраска. Препараты фиксированных хромосом без каких-либо предварительных обработок окрашивают акрихином, наблюдения проводят с помощью флуоресцентного микроскопа; препараты долго не хранятся (Восток, Самнер, 1981). Локализация и степень свечения сегментов в индивидуальных хромосомах достаточно постоянны. Бэнды обладают желтым свечением, для некоторых сегментов характерно более интенсивное бриллиантовое свечение (Прокофьева-Бельговская, 1986). Дополнительное окрашивание актиномицином D, дистамицином А, изменение значения рН могут влиять на размер и яркость Q-бэндов (Charleen, Robert, 2001).
Н-окраска. Окрашивание проводят производным бензимидазола Hoechst 33258, яркость свечения которого обусловлена насыщенностью ДНК АТ-основаниями; при этом четкость свечения участков хромосом хуже, чем при использовании акрихина. Сочетание в исследовании обоих флуорохромов позволяет судить о нуклеотидном составе ДНК индивидуальных сегментов гетерохроматина (Прокофьева-Бельговская, 1986).
Среди других флуоресцентных красителей, вызывающих дифференциальное окрашивание хромосомы, используют DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол), DIPI (6-(2-имидозолин)-2-[4-2(имидозолин) фенил] индол) совместно с дистамицином А, специфичном для АТ-участков, а также с митрамицином, специфичном для ГЦ-участков (Прокофьева-Бельговская, 1986, Charleen, Robert, 2001).
G-окраска. Препараты хромосом после предварительной щелочной обработки (или без неё) инкубируют в стандартном солевом растворе (2xSSC) и затем окрашивают красителем Гимза на фосфатном буфере при рН=6.8 (Charleen, Robert, 2001). Результатом этой окраски является четкая дифференциация хромосом на темноокрашенные и неокрашенные сегменты, строго специфичная для индивидуальных хромосом (Прокофьева-Бельговская, 1986).
R-окраска. В результате инкубации препаратов хромосом в буферном растворе (рН=6.5) при высокой температуре (87С) или при определенном значении рН с последующей обработкой красителем Гимза выявляется сегментация хромосом, обратная G-сегментации. Вместо красителя Гимза можно использовать флуоресцентный краситель акридиновый оранжевый (Прокофьева-Бельговская, 1986; Босток, Самнер, 1981).
Т-окраска. Это вариант R-окраски, в котором окрашенные сегменты, как правило, появляются преимущественно в районах теломер (Босток, Самнер, 1981).
С-окраска. Хромосомные препараты после гидролиза в 0,2 N соляной кислоте и дегидратации в 96% или 100% этаноле подвергают воздействию щелочей (Ва(ОН)2, NaOH), что приводит к денатурации ДНК. Затем препараты помещают в солевой раствор (2 SSC) при температуре до 65С, что необходимо для ренатурации ДНК (Бадаева, 2000). При этом разрушаются структуры, лежащие в основе G-бэндов. Окрашивание проводят красителями Гимза, Лейшмана, Райта и др. (Прокофьева-Бельговская, 1986). Краситель Гимза представляет собой сложный компаунд трёх красителей - производных тиазина: метиленового синего, продуктов его окисления - азура А и азура В, и эозинатов, являющихся трициклическими соединениями без боковых цепей. Анализ процесса окрашивания хромосом этим красителей показал, что компоненты красителя взаимодействуют исключительно с ДНК хромосомы: циклические молекулы метиленового синего и эозина взаимодействуют между собой, в результате чего и образуется красящий комплекс, сформированный двумя циклическими молекулами (Zhang, Chen, 1980; Прокофьева-Бельговская, 1986).
Приготовление хромосомных препаратов для процедур С-бэндинга и геномной in situ гибридизации
Проращивание семян. Семена замачивали в стакане водопроводной воды при комнатной температуре приблизительно на сутки, а затем переносили в чашки Петри на влажную фильтровальную бумагу и оставляли в холодильнике. Для синхронизации клеточных делений и стимуляции прорастания семян использовали режим чередующихся температурных циклов: днем материал держали в холодильнике, а на ночь переносили в термостат при температуре 24С или же оставляли на столе при комнатной температуре. Использовали молодые проростки с корешками длиной 1,5 - 2,5 см.
Предобработка корешков для накопления метафазных пластинок. Перед фиксацией семена вынимали из холодильника и оставляли при комнатной температуре на 16 ч. Работу с материалом начинали утром или в первой половине дня.
Семена или корешки обрабатывали 0,05%-ным водным раствором колхицина ("Sigma", кат. № С 9756) в течение 2,5 ч, после чего корешки обрезали и переносили в воду со льдом на 30 мин.
Фиксация. Корешки фиксировали 45%-ной уксусной кислотой в течение 4 ч в холодильнике при температуре 4С. Смену фиксатора производили через 15 мин. и через 1,5 ч с момента начала фиксации.
Отмывка. Кислоту отмывали шестью сменами холодной дистиллированной воды, выдерживая по 10 мин. в каждой смене. Во время первой отмывки воду меняли три раза до исчезновения резкого запаха уксуса.
Насыщение и гидролиз (только для процедуры дифференциального окрашивания). После отмывки корешки помещали в холодную 0,2 N НС1 на 20 мин. для насыщения. Одновременно в водяной бане нагревали бюкс с соляной кислотой для гидролиза. Гидролиз проводили в 0,2 N НС1 при 60С 5 мин., после чего корешки быстро переносили в воду со льдом.
Отмывка и обработка ферментом. Кислоту отмывали дистиллированной водой три раза, выдерживая по 10 мин. Кончики корешков (непрозрачную часть длиной 1,5-2 мм, соответствующую зоне деления) обрезали и помещали в пробирки с водным раствором целлюлизина ("Calbiochem", кат. № 219466). Для мацерации одного образца использовали 150 - 200 мкл 0,2 - 0,3%-ного раствора целлюлизина (активность фермента 10,000-12,400 у.е./г при рН=4). Обработку проводили в термостате при 26С в течение ночи.
Приготовление хромосомных препаратов. Корешки промывали от ферментов тремя - пятью сменами холодной дистиллированной воды. Затем корешок помещали на предметное стекло, осторожно подсушивали с помощью фильтровальной бумаги и заливали большим объемом 45%-ной уксусной кислоты. Через 1,5-2 мин. излишек кислоты удаляли, добавляли каплю свежей кислоты, и корешок измельчали лезвием бритвы 2-3 мин. до получения однородной суспензии. Препарат накрывали покровным стеклом 18 х 18 мм, подсушивали фильтровальной бумагой и раздавливали. Покровное стекло снимали после замораживания на сухом льду и ставили препараты в 95% этиловый спирт на ночь или дольше.
Препараты сушили на воздухе от получаса до нескольких суток. Сухие препараты обрабатывали насыщенным раствором Ва(ОН)2 6 мин. при комнатной температуре, споласкивали в IN НС1 10-15 сек. и промывали струей проточной воды. Препараты подсушивали горячим воздухом, инкубировали в растворе 2 SSC при 60С в течение 1 ч, промывали в проточной воде не менее 15 мин. и сушили. Окрашивание проводили 4%-ным раствором Гимза в 0,125М Tris-HCl буфере (рН=6,8) под контролем микроскопа.
Для окраски использовали краситель «Giemsa-Merck» (кат. № 9204). Раствор красителя тщательно смывали струей проточной воды. Препарат сушили горячим воздухом. Сухие стекла споласкивали в мета- или пара-ксилоле, на препарат наносили каплю энтеллана ("Merck", кат. № 7960) и накрывали покровным стеклом 22x22 мм или 24x24 мм. Из-под покровного стекла осторожно удаляли пузырьки воздуха и препараты сушили на ровной горизонтальной поверхности в течение суток (Бадаев и др., 1983; Badaev et al., 1990).
ДНК выделяли из молодых листьев и корешков по методу Bernatzky и Tanksley (1986) с некоторыми модификациями. Молодые корешки (листья) растирали в буфере для экстракции (0.35 М сорбитол, 100 мМ трис-HCl, 5мМ ЭДТА, рН 7) на холоду. Центрифугировали 10 мин. 14000 об/мин. Сливали надосадочную жидкость, добавляли буфер для экстракции, интенсивно встряхивали. Лизировали при 65С в буфере для лизиса (1 М трис- НС1 рН 7.5, 0.5 ЭДТА, 5 М NaCl, 2% СТАВ) с добавлением 5 % саркосила. После лизиса, производили очистку смесью хлороформ-изоамиловый спирт (24:1) и центрифугировали при 14 000 об/мин. в течение 10 мин. Отбирали надосадочную жидкость и осаждали ДНК в одном объеме изопропанола. Центрифугировали в 14 000 об/мин. в течение 10 мин., осадок высушивали и растворяли в MQ-воде. Размер выделенной ДНК и степень загрязненности РНК оценивали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле.
Разработка стратегии поиска генетического материала D-генома в геноме яровой тритикале
Линия яровой тритикале 131/7 отобрана в 1993 г. путем отбора из поколения F5 потомства от скрещивания гибридов Fj (мягкая пшеница сорт Воронежская х яровая рожь сорт Селенга) х яровая тритикале. Она характеризуется высотой растения до 70 см, продуктивным колосом (1,7 - 1,9 г), устойчивостью к бурой листовой ржавчине и стеблевой ржавчине. В течение нескольких лет изучения у этой линии не было обнаружено проросших в колосе зерен, что является крайне ценным признаком для тритикале. Она имеет сравнительно непродолжительный период вегетации (100 дн.), что особенно важно для яровой тритикале в условиях Центра России. Эта линия превосходит лучшие образцы из коллекции кафедры по показателям массы зерна с колоса, устойчивости к прорастанию на корню и устойчивости к ржавчинам (Соловьев, 2000).
С помощью геномной in situ гибридизации показано, что линия 131/7 имеет транслокацию пшеничной хромосомы в ржаную. Транслоцированная хромосома состоит из короткого плеча и прицентромерной области, представленными генетическим материалом ржи, и длинного плеча -генетическим материалом пшеницы. Геномная формула данной линии - 28П +12Р + 2Р/П (П - пшеница, Р - рожь, Р/П - рекомбинантная хромосома рожь/пшеница) (Карлов и др., 2000). Однако геномный состав линии 131/7 и хромосомы, вовлеченные в эту транслокацию, не известны.
Анализ мейоза показал наличие бивалентной конъюгации всех хромосом. Практически все микроспороциты в метафазе I имели 21 закрытый бивалент. В анафазе I наблюдалось нормальное расхождение хромосом, без каких-либо нарушений. Эти данные подтверждают, что созданная линия является мейотически стабильной (Соловьев, 2000). На основании этих данных мы выдвинули гипотезу: участок пшеничного хроматина в транслокации принадлежит хромосоме D-генома. В противном случае при прохождении мейоза наблюдался бы ряд нарушений, так как одно из плеч хромосомы пшеничных геномов находилось бы в экстра дозе.
Исходя из всего вышеизложенного, линия 131/7 была выбрана нами для разработки модели по поиску хроматина D-генома в геномной среде гексаплоидных тритикале, а так же модели комплексной идентификации транслокаций и замещений у гексаплоидных тритикале.
В настоящее время для изучения и характеристики генома злаков интенсивно используются молекулярные маркеры. Среди различных типов маркеров (RAPD, RFLP, ISSR) наиболее подходящими являются SSR-, или микросателлитные маркеры ввиду высокого уровня полиморфизма, кодоминантности, методической простоты, и специфичности (Ribero-Carvalho et al., 2001; Khlestkina et al, 2004; Малышев и др., 2005).
На основании литературных данных мы подобрали микросателлитные маркеры локализованные во всех хромосомах D-генома. Были подобраны по два SSR-маркера на короткое и длинное плечо соответственно для каждой хромосомы (Roder et al., 1998, Somers, Isaac, 2004). По наличию либо отсутствию фрагмента амплификации соответствующей длины, характерной для определенного маркера, делали вывод о присутствии в геноме хромосомы или ее фрагмента, на котором картирован данный маркер.
Отобранные нами микросателлитные маркеры удовлетворяли прежде всего следующим условиям: строго специфичны только для хромосомы, на которой они картированы, и не дают амплификацию в R-геноме. Это связанно с тем, что в геноме гексаплоидной тритикале содержатся геномы А, В и R, и перекрестная амплификация могла дать искажение полученных результатов. Кроме того, в родословной этой линии 131/7 присутствуют неизвестные образцы тритикале, в связи с этим не было возможности использовать высокий полиморфизм SSR-маркеров для идентификации локусов родительских растений в геноме линии.
Рекомендуемыми условиями проведения ПЦР при амплификации SSR маркеров являются (Roder et al., 1998, Somers, Isaac, 2004): 1 цикл: 3 минуты денатурация при 94 С; 45 циклов: 1 минута денатурация при 94 С, 1 минута отжиг праймеров при температуре, специфичной для каждого маркера, 2 минуты элонгация 72 С; 1 цикл: 10 минут конечная элонгация при 72 С.
Однако при таких условиях амплификации практически на всех маркерах, наблюдали высокий уровень отжига неспецифических продуктов. Так же отжигались неспецифические продукты на отрицательный контролях, не содержащих D-геном, яровая рожь, озимая рожь, твердая пшеница и т.д., которые не содержали D-генома (рис 1).
Похожие диссертации на Идентификация хромосомных транслокаций и замещений у некоторых форм яровой тритикале
