Введение к работе
Актуальность проблемы. Пектины представляют собой сложные гетерополисахариды, относящиеся к классу їликаногалактуронаноз, кислых растительных полисахаридов (Оводов, 2009). Пектиновые вещества инкрустируют стенки растительных клеток и входят в состав межклеточного пространства высших наземных растений, морских трав и ряда пресноводных водорослей (Popper, 2008). Пектины образуют матрикс, связующий микрофибриллы целлюлозы; обеспечивают ионный транспорт и водный режим, влияют на прорастание семян, рост и развитие растения, выполняют защитную роль во взаимоотношениях растения с фитопатогенами (Cabrera et al, 2008). В этой связи, структура пектиновых веществ зависит от многих параметров и может существенно изменяться в процессе роста и развития растения. Динамичность структуры пектинов обеспечивается нерегулярным блочным характером строения углеводной цепи, которая содержит различные макромолекулярные фрагменты линейной и разветвленной областей (Voragen et al., 2009).
Широкое распространение, относительная легкость выделения и высокая физиологическая активность сделали привлекательным практическое применение пектинов. Поэтому, в настоящее время проводится интенсивное изучение связи между структурой и активностью пектиновых полисахаридов. Исследование действия пектинов на иммунитет заслуживает особого внимания в связи с чрезвычайно важной ролью, которую играет иммунная система в жизнеобеспечении организма. Пектины являются перспективными кандидатами для разработки средств иммуномодулирующей терапии. Представляется актуальным выяснение изменений иммунной реактивности при пероральном введении пектинов в зависимости от их строения, что является ключевым подходом в выяснении молекулярных основ регуляции резистентности организма посредством влияния на иммунную систему желудочно-кишечного тракта.
Составляющими компонентами пектинов являются следующие структурные элементы: гомогалактуронан, рамногалактуронан-1 (RG-I), ксилогалактуронан и апиогалактуронан (Round et al., 2010). Очевидно, что данные полисахариды; существенно отличающиеся своим строением, могут оказывать различное физиологическое действие. Поэтому, итоговый результат действия на иммунитет определяется, в первую очередь, соотношением пектиновых полисахаридов. Однако особенности иммуномодулирующего действия фрагментов пектиновых макромолекул ранее не изучались. Кроме того, сами пектиновые полисахариды отличаются у различных растений: гомогалактуронан - степенью метилэтерифицирования и молекулярным весом; фрагмент RG-I - тонким
строением боковых цепей, состоящих из остатков арабинозы, галактозы и ряда других нейтральных моносахаридов; ксило- и апиогалактуронаны -степенью разветвленное и.т.д. В зависимости от сырья, метода выделения и полноты очистки в составе пектинов могут присутствовать различные примеси, которые могут сами по себе оказывать действие на иммунную систему. В настоящее время нет достаточных сведений для анализа зависимости иммуномодулирующего действия пектинов от особенностей их строения и наличия сопутствующих примесей.
Сравнение активности пектинов с различным типом построения углеводной цепи представляется целесообразным подходом для решения указанной проблемы. Однако исследования физиологической активности проводятся с использованием коммерческих пектинов, главным образом, цитрусового и яблочного, при этом не учитывается структурное разнообразие пектинов, встречающихся в природе. В этой связи представляют интерес пектины растений европейского Севера России, среди которых обнаружены пектины, имеющие строение, характерное для всех пектинов, а также пектины с уникальными чертами строения (Оводов и др., 2009). Всестороннее изучение пектинов растений европейского Севера России предоставляет возможность выявления структурных особенностей пектиновой макромолекулы, важных для проявления иммуномодулирующей активности. Большое прикладное значение этих исследований заключается в том, что они открывают перспективу создания новых подходов в иммунотерапии и в создании лечебных и профилактических препаратов.
Цель исследования - установить вклад структурных элементов макромолекулы в иммуномодулирующее действие пектинов.
Задачи исследования:
Выявить пектины, обладающие иммуномодулирующим действием.
Определить зависимость иммуномодулирующего действия от содержания остатков галактуроновой кислоты в пектине.
Исследовать влияние пектинов с различной степенью метилэтерифицирования на активность фагоцитов.
Установить особенности иммуномодулирующего действия пектинов, содержащих участки разветвленного галактуронана.
Сравнить иммуностимулирующее действие пектинов, отличающихся строением разветвленной области макромолекулы.
Определить зависимость иммуномодулирующего действия от молекулярной массы пектинов.
Установить влияние примесей на иммуномодулирующее действие пектинов.
Изучить способность пектинов снижать гиперактивацию лейкоцитов.
9. Выявить область макромолекулы, обуславливающую иммуноадъювантное действие, и определить механизм усиления иммунного ответа лемнаном. Основные положения, выносимые на защиту:
Пектины при пероральном введении оказывают иммуномодулирующее действие, характер и направленность которого зависят от строения линейных и разветвленных областей макромолекулы.
Способность снижать иммунную реактивность более распространена среди пектинов, чем иммуностимулирующее действие, так как обусловлена областью галактуронана, образующего главную углеводную цепь всех пектинов.
Иммуностимулирующая активность проявляется только при определенном строении боковых цепей в разветвленной области пектиновой макромолекулы.
Существует несколько механизмов взаимодействия пєктиноб с иммунной системой. Часть из них приводит к усилению, а часть к снижению функциональной активности лейкоцитов.
В результате перорального введения пектинов происходит как системное, так и локальное изменение функциональной активности лейкоцитов.
Научная новизна. Впервые выявлены области пектиновой макромолекулы, обуславливающие стимулирующее или подавляющее действие на иммунную реактивность. Теоретически обоснован и впервые применен оригинальный методологический подход к изучению зависимости физиологической активности от строения пектиновых веществ. Он Еклкнаег в себя сочетание сравнительного анализа физиологической активности пектинов с установленным строением и изучение активности фрагментов пектиновой макромолекулы, полученных с помощью кислотного и ферментативного гидролиза.
Впервые проведено сравнительное комплексное изучение иммуномодулирующей активности пектинов всех видов, с которыми может взаимодействовать иммунная система человека. А именно, изучено действие на иммунитет пектинов, выделенных из растений, не употребляемых в пищу, пектинов из клеточных культур, из ряда съедобных растений, а также коммерческих пектинов, применяемых в пищевой промышленности. При этом в качестве мишени воздействия пектинов определена функциональная активность основных звеньев иммунитета - фагоцитоза, антиген-специфического клеточного и гуморального иммунного ответа. В результате скрининговых исследований выявлены растения европейского Севера России, содержащие физиологически активные пектины. Установлены
особенности действия на иммунитет пектинов, имеющих необычное химическое строение.
Впервые охарактеризовано иммуномодулирующее действие пектинов при их пероральном введении. Найдены новые виды физиологической активности пектинов: ингибирование токсического действия липополисахарида (ЛПС), защитное действие на стенку толстой кишки и усиление иммунного ответа на перорально введенный антиген. Выявлены особенности противовоспалительного действия пектинов, в частности, его превентивный характер. Обнаружено, что механизм иммуностимулирующего действия связан с увеличением проницаемости кишечной стенки под действием пектинов. На основании множественности и разнонаправленности иммуномодулирующего действия сформулирована концепция о регуляции иммунитета млекопитающих пектинами, поступающими в составе растительной пищи.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследования вносят вклад в понимание общебиологических принципов регуляции иммунной устойчивости млекопитающих. Расширены представления о механизме противовоспалительного и противовопухолевого действия пищевых волокон. Выявленные особенности позволяют отличить иммуномодулирующее действие пектинов от эффекта других биологически активных соединений в составе многокомпонентных средств фитотерапии и растительной пищи.
На основе выявленной зависимости активности от строения разработаны рекомендации по усовершенствованию методов выделения пектинов с заданными свойствами. Приоритет конкретных технологических решений подтвержден двумя патентами РФ на изобретения. Получено экспериментальное обоснование применения биотехнологических подходов для получения физиологически активных полисахаридов. Высокомолекулярные галактуронаны можно рассматривать в качестве нового класса биомаркеров, определение содержания которых в продуктах питания, перспективно для оценки рациона питания.
Предложено новое направление в иммуномодулирующей терапии, основанное на многофункциональности пектиновых полисахаридов. Результаты исследования открывают перспективу создания новых лекарственных препаратов, биологически активных добавок к пище и функциональных продуктов питания для лечения и профилактики воспалительных заболеваний и эндотоксинемий. Пектины, стимулирующие иммунный ответ на совместно вводимый с ними белковый антиген, могут представлять интерес в качестве иммуноадъювантов для пероральных вакцин.
Данные о нарушении нормальной иммунной толерантности цитрусовым пектином должны учитываться при медико-биологической оценке безопасности пищевых продуктов. Использование в пищевой промышленности пектинов, содержащих примеси глюкозы, должно получить оценку с точки зрения доктрины о продовольственной безопасности России.
Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе в Сыктывкарском государственном университете.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены лично в виде устных и стендовых докладов на 20-ом Международном симпозиуме по углеводам (г. Гамбург, Германия, 2000 г.), Международной конференции «Иммунофармакология и иммунотерапия» (г.Флоренция, Италия, 2000 г.), 11-ом Европейском симпозиуме по углеводам (г.Лиссабон, Португалия. 2001 г.), Международном симпозиуме «Функциональные продукты питания. Научные и глобальные перспективы» (г. Париж, Франция, 2001 г.), Второй международной школе по мукозальной иммунологии (г.Неаполь, Италия, 2002 г.), 10-ом Братиславском симпозиуме по углеводам (г.Смоленице, Словакия, 2002 г.), Международной конференции по новым функциональным ингредиентам и продуктам питания (пКопенгагек, Дания, 2003 г.). 5-ом и 7-ом Международных симпозиумах по химии природных соединений (г.Ташкент, Узбекистан, 2003 и 2007 гг.), Международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (г. Алматы, Казахстан, 2003 г.), Международной летней школе по гаикологии (г. Вагенинген, Нидерланды, 2004 г.), 3-ей и 4-ой Международных конференциях общества по изучению природных веществ (г.Нанкин, Китай, 2004 г.; г. Лейзин, Швейцария, 2006 г.), Международной конференции «Иммуностимуляторы в современных вакцинах» (г.Малага, Испания, 2005 г.), Международных конгрессах общества по изучению лекарственных растений (г. Хельсинки, Финляндия, 2006 г.; г. Грац, Австрия, 2008 г.), Международном симпозиуме по фармакологии природных веществ «Фапронатура 2006» (г.Варадеро, Куба, 2006 г.), IV-ой Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (г.Сыктывкар, 2006 г.), IV-ом Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (пНовосибирск, 2008 г.), Научной конференции «Иммуномодуляторы природного происхождения» (г.Владивосток, 2009 г.), Всероссийской научной конференции «Химия и медицина» (г.Уфа, 2010 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 68 научных работ, в том числе две монографии, два патента Российской Федерации, 11 статей в зарубежных и 11 статей в Российских рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, четырёх глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов), выводов и списка литературы. Работа изложена на 247 страницах машинописного текста, содержит 37 таблиц и 44 рисунка. Список литературы включает 380 источников, в том числе 318 зарубежных авторов.
Работа выполнена в лаборатории молекулярной физиологии и иммунологии Отдела молекулярной иммунологии и биотехнологии УРАН Института физиологии Коми НЦ УрО РАН в рамках плановых тем НИР «Физиологическая активность полисахаридов в зависимости от структуры (ГР № 01.200 107401) и «Физиологическая активность пектиновых полисахаридов,, модифицированных в условиях искусственной гастроэнтеральной среды» (ГР № 0120.0 602858).
Частично работа получила финансовую поддержку Министерства науки и образования в рамках ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы" (госконтракты №№ 02.512.11.2190 и 02.512.12.0014), Российского фонда фундаментальных исследований (№№ 00-04-48063,03-04-48136,06-04-48079), Программ фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и «Фундаментальные науки медицине», Программы интеграционных проектов фундаментальных научных исследований, выполняемых в УрО РАН совместно с ДВО РАН.
Сокращения и условные обозначения. ГЗТ -гиперчувствительность замедленного типа, Ил-ір - интерлейкин-1р\ Ил-10 - интерлейкин-10, ИФА - иммуноферментный анализ, ЛПС -липополисахарид, МПО - миелопероксидаза, ПОЛ - перекисное окисление липидов, СМ- степень метилэтерифицирования, ФБР - фосфатно-буферный раствор, ФНО-а - фактор некроза опухолей- a, XT -холерный энтеротоксин, АР - яблочный пектин, OVA- овальбумин, PC - цитрусовый пектин, РМА - форболовый эфир миристиновой кислоты, RG-I - рамногалактуронан-1.
