Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 Структура и функции гормонов суперсемейства инсулина позвоночныхживотных
1.1.1. Семейство инсулина
1.1.2. Семейство ифр-и 18
1.1.3. Семейство ифр-и 22
1.1.4. Семейство релаксина 25
1.1.5. Сигнальные пути действия гормонов инсулинового суперсемейства 29
1.2. Иисулиноподобные пептиды нервной системы беспозвоночных животных 31
1.2.1. Структурно-функциональная организация ипп беспозвоночных 32
1.2.2. Клетки нервной системы, продуцирующие ипп 42
Глава 2. Материалы и методы 45
2.1. Экспериментальные животные 45
2.2. Выявление инсулин-иммунореактивных клеток в ганглиях моллюска иммуногистохимическим методом 45
2.3. Сравнительный компьютерный анализ мрнк ипп различных видов беспозвоночных 46
2.4. Подбор праимеров и амплификация мрнк моллюска с помощью пцр-анализа 46
2.5. Выделение и очистка рип из нервной ткани моллюска 47
2.6. Получение фракции плазматических мембран печени крыс 48
2.7. Получение гетерогенной фракции клеточных мембран мозга крыс 49
2.8. Определение специфического связывания рип моллюска с рецепторами инсулина и ифр-1 49
2.9. Определение активности аденилатциклазы и гтф-связывания в мышечной и нервной тканях 50
Глава 3. Результаты 53
3.1. Иммуногистохимическая идентификация в ганглиях моллюска нейронов, содержащих пептиды, родственные инсулину 53
3.2. Амплификация участков мрнк, предположительно кодирующих рипмоллюска 54
3.3. Выделение и очистка родственных инсулину пептидов моллюска 56
3.4. Оценка способности рип моллюска взаимодействовать с рецепторами инсулина и ифр-1 59
3.5. Влияние рип моллюска на активность аденилатциклазы и гтф-связываыияо-белков 65
Глава 4. Обсуждение 69
4.1. Клетки, синтезирующие родственные инсулину пептиды в ганглияха cygnea 71
4.2. Природные варианты гормонов инсулинового суперсемейства как отражение структурного полиморфизма пептидов 72
4.3. Плейотропыость действия нейропептидов беспозвоночных как признак дивергенции функций 74
Заключение 78
Выводы 80
Список литературы 82
- Семейство релаксина
- Клетки нервной системы, продуцирующие ипп
- Определение активности аденилатциклазы и гтф-связывания в мышечной и нервной тканях
- Оценка способности рип моллюска взаимодействовать с рецепторами инсулина и ифр-1
Введение к работе
Актуальность проблемы. Обнаружение инсулина, инсулиноподобных факторов роста (ИФР), релаксина и их рецепторов в ЦНС позвоночных привело к изменению представлений о происхождении и роли гормонов инсулинового суперсемейства (Бондарева и др., 1988; Бондарева, Лейбуш, 1997; Havrankova et al., 1978а; Baskin et al., 1988; McKelvie et al., 1992; Sytze van Dam et al, 2004). Однако, несмотря на идентификацию и выявление экспрессии генов инсулиноподобных пептидов (ИПП) в нервной ткани, их биологические свойства и функции изучены недостаточно. Таким образом, установление природы и роли ИПП, синтезируемых нервной тканью, остается одной из актуальных проблем современной нейроэндокринологии.
Известно, что обнаруженные в нервной ткани гормоны инсулннового суперсемейства регулируют утилизацию глюкозы по аутокринному и паракринному типу, а также осуществляют в ЦНС нейромодуляторные и нейромедиаторные функции (Schwartz et al., 1992; Schwartz, 2000). В их компетенцию также входят некоторые анаболические и анти-апоптотические функции, контроль процессов роста, дифференцировки нейронов и синаптогенеза, участие в регуляции пищевого поведения и ряда когнитивных функций (Баркан и др.,1992; Schechter et al, 1999; Woods et al., 2000; Park, 2001; Carro et al., 2003; Bondy, Cheng, 2004; MeGowan et al., 2005). Что касается нейрокринной продукции гормонов инсулинового суперсемейства, то она показана для ИФР и релаксина, тогда как сведения, позволяющие однозначно ответить па вопрос о синтезе инсулина в ЦНС позвоночных до сих пор отсутствуют (Plisetskaya et al., 1993). Синтез инсулина у позвоночных показан только в эмбриональной нервной ткани (Schechter et al., 1990; Devaskar et al., 1994).
Значительные успехи в изучении проблемы достигнуты в исследованиях на беспозвоночных, у которых основным местом синтеза ИПП является нервная ткань. С помощью методов молекулярной биологии расшифрованы гены, кодирующие ИПП,
7 установлена первичная структура этих пептидов у представителей нескольких типов беспозвоночных, включая круглых червей, моллюсков и членистоногих (Robitzki et al.,
1989; Hetru et al., 1991; Kondo et al., 1996; Smit et al., 1998; Floyd et al., 1999; Brogiolo et al.,
2001; Li et al., 2003; Krieger et al., 2004). Принципиальное сходство структурной организации ИПП беспозвоночных с инсулином позволило включить эти молекулы в иисулиновое суперсемейство. Однако, в силу особенностей аминокислотной последовательности, неиропептиды беспозвоночных выделены в отдельную группу, и степень родства данных пептидов с другими членами суперсемейства инсулина еще предстоит выяснить.
Особенностью ИПП беспозвоночных является полиморфизм генов, кодирующих множественные изоформы, что практически не встречается у позвоночных. Число изоформ пептидов, синтезируемых нейронами отдельных видов, может колебаться от 2 (моллюск Aplysia californica) до 38 (нематода Caenorhabditis elegans). Различия аминокислотных последовательностей между изоформами могут превышать 50 %, что предполагает разнонаправленность их действия. Немногочисленные данные свидетельствуют о проявлении метаболических и рост-стимулирующих эффектов ИПП нервной ткани беспозвоночных, однако, регуляторная роль большинства известных пептидов во многом остается не выясненной (Claeys et al., 2002).
В данной работе впервые выявлена локализация инсулиноподобных пептидов в ганглиях пресноводного двустворчатого моллюска Anodonta cygnea, показана способность нейронов к их синтезу, проведены выделение и очистка из ганглиев пептидов, обозначенных нами как родственные инсулину пептиды (РИП), оценена способность полученных РИП связываться с рецепторами инсулина и ИФР-І, а также влияние пептидов на активность аденилатциклазной сигнальной системы, реализующей действие гормонов инсулинового суперсемейства.
8 Цели и задачи исследовании
Целью настоящей работы явилось обнаружение и характеристика родственных инсулину пептидов в нервной ткани моллюска Anodonta cygnea.
В соответствии с этим в конкретные задачи входило:
Установить локализацию клеток, синтезирующих инсулиноподобньте пептиды в ганглиях с помощью иммуногистохимического метода и показать присутствие мРНК, кодирующих пептиды моллюска.
Выделить с помощью ионообменной и высокоэффективной жидкостной хроматографии родственные инсулину пептиды из трех видов нервных ганглиев моллюска.
Дать сравнительную характеристику функциональных свойств выделенных пептидов, оценив их способность связываться с рецепторами инсулина и ИФР-І тканей позвоночных, а таюке по регуляторному эффекту пептидов на внутриклеточный аденилатциклазный сигнальный каскад.
Основные положения, выносимые на защиту
Обнаружение в нервных ганглиях моллюска A. cygnea клеток, содержащих пептиды, взаимодействующие с антителами к инсулину позвоночных, позволяет констатировать, что в нейронах этого вида присутствуют субстанции родственные инсулину.
Выделение РИП из ганглиев A. cygnea по оригинальной схеме получения инсулина и последующая ВЭЖХ очистка подтверждает присутствие в нервной ткани этого вида моллюска пептидов, сходных с инсулинами позвоночных.
Оценка способности РИП, полученных из ганглиев A. cygnea, взаимодействовать с рецепторами инсулина и ИФР-І в специфичных радиолигандных тест-системах дает основание считать исследуемые пептиды функционально близкими к гормонам инсулинового суперсемейства. В тоже время, низкое относительное сродство
9 РИП моллюска к обоим типам рецепторов свидетельствует о значительньж отличиях их структур от стандартных инсулина свиньи и ИФР-І человека.
4. Способность РИП моллюска стимулировать активность аденилатциклазы и
ГТФ-связывагощей активности G-белков, оказывая сопоставимые с инсулином и ИФР-І эффекты, указывает на возможность осуществления их регуляторных эффектов через аденилатциклазную сигнальную систему.
Научная новизна
Впервые выявлена локализация родственных инсулину пептидов в нервной системе моллюска A. cygnea
Впервые из нервной ткани представителя беспозвоночных, двустворчатого моллюска A cygnea, выделены и очищены родственные инсулину пептиды.
Впервые проведена оценка биологических и функциональных свойств родственных инсулину пептидов, присутствующих в клетках ганглиев моллюска A. cygnea.
Теоретическое и практическое значения работы
Выявление в нервной ткани моллюска A. cygnea пептидов, обладающих свойствами, как инсулина, так и ИФР-І, является вкладом в развитие представлений об эндокринной функции нервной ткани и представляется важным для понимания генезиса и эволюции регуляторных систем, продуцирующих инсулиноподобные пептиды.
Характеристика биологических свойств РИП, полученных из ганглиев A. cygnea в тест-системах млекопитающих позволяет приблизиться как к пониманию природы и роли этих субстанций, так и проиллюстрировать структурно-функциональную дивергенцию гормонов суперсемейства инсулина в филогенезе.
10 Обнаружение у моллюсков пептидов, обладающих свойствами инсулина и ИФР-І, в практическом плане может быть использовано для гормональной стимуляции роста и развития в процессе выращивания марикультур беспозвоночных.
Апробация работы
Результаты исследования доложены на Седьмой региональной конференции международного общества нейробиологии беспозвоночных (Калининград-Светлогорск-Отрадное, 2003); Международной научной конференции «Современные проблемы физиологии и биохимии водньк организмов (Петрозаводск, 2004); Двадцать второй конференции европейских сравнительных эндокринологов (Уппсала, Швеция, 2004); Седьмой Всероссийской конференции «Нейроэндокринология-2005» (С-Петербург, 2005).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 6 научных статей в рецензируемых российских и иностранных журналах и 5 тезисов докладов.
Личный вклад автора
Все экспериментальные данные, приведенные в диссертационной работе, получены лично автором или при его непосредственном участии.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, результатов, обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 105 страницах, включая 20 рисунков и 6 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 212 ссылок.
Семейство релаксина
Первичная структура. АК последовательность ИФР-П установлена для 34 видов позвоночных (см. Табл. 2). Гормоны этого семейства имеют высокую инвариантность участков первичной структуры, отвечающих за проявление биологической активности (Колычев, 2000).
Пространственная структура Архитектоника молекулы ИФР-П сходна с соответствующими областями ИФР-L Существенные структурные различия между ИФР-П и ИФР-І выявляются в С-конце молекулы и начале третьей спирали - области, модулирующией сродство к рецептору ИФР-П (Torres et aL, 1995). Область связывания с рецептором. ИФР-П включает несколько сайтов, ответственных за связывание с различными рецепторными молекулами. Сайт для взаимодействия ИФР-П с ИФР-связывающими белками включает остатки Glu6, Phe48, Arg49, Ser50. Эти остатки взаимодействуют с N-концевым доменом ИФР-связывающего белка-3 (Hashimoto et aL, 1995; 1997). С этим сайтом частично перекрывается область взаимодействия с рецептором ИФР-И. При взаимодействии с рецепторами инсулина и ИФР I, но не рецептора ИФР-И или ИФР-связывающих белков, важную роль играет остаток Туг27. Этот остаток располагается на противоположной стороне от области, вовлеченной во взаимодействие с ИФР-связывающими белками (Terasawa et aL, 1994). Организация генов. Структура гена ИФР-П сходна с геном ИФР-L Ген ИФР-П человека, мыши и крысы состоит из 9-ти экзонов и сцеплен с геном инсулина в хромосоме II, однако не было показано, имеет ли такое расположение генов функциональную или эволюционную значимость (Chan et aL, 1992). Экзоны 1-6 кодируют различные 5 нетранслируемые последовательности. Экзон 7 кодирует сигнальный пептид и часть В 24 домена. Экзон 8 кодирует оставшуюся часть В-домена, С, А, D-домены и N-концевую область Е-домена. Экзон 9 кодирует оставшуюся часть Е-домена и З -нетранслируемую область (LeRoith et al., 1995). Физиологическая роль. ИФР-ІІ играет фундаментальную роль в эмбриональном развитии, тогда как его функция в послеродовой период менее важна, поскольку его можно заменить на ИФР-І (Baker et al., 1993). Это утверждение не абсолютно, поскольку приоритет эмбрионального синтеза ИФР-П у грызунов не подтверждается фактами одинаково высокой продукцией этого гормона в различных органах и тканях человека в течение всей жизни. Удаление отцовского инпринтингового гена IGF-II, который обычно экспрессируется в трофобласте, приводит к его плацентарному недостатку и низкому эмбриональному весу животных (Constancia et al., 2002). ИФР-П-связывающие белки. В настоящее время известно, что для транспортировки ИФР-П в кровотоке гормоном используются один высокоаффинный и один низкоаффинньтй ИФР-связывающие белки, проявляя в сравнении с ИФР-І более низкую избирательность (Baxter, 1994). Рецептор ИФР-ІІ. ИФР-ІІ/маннозо-6-фосфат (ИФР-ІІ/М6Ф) рецептор является многофункциональным одноцепочечным трансмембранным гликопротеином, регулирующим интернализацию и деградацию внеклеточного ИФР-П. ИФР-П/МбФ рецепторы, расположенные на поверхности клетки, также участвуют в захвате и активации/деградации внеклеточных М6Ф-переносящих лигандов. Мутанты по гену рецептора ИФР-П имеют увеличенные уровни циркулирующего ИФР-П наряду с увеличенным весом при рождении, органомегалией, и перинатальной смертностью. Рецептор ИФР-П не связывает инсулин, а аффинность ИФР-І к этому трансмембранному гликопротеину в 500 раз ниже. Полагают, что большинство биологических эффектов ИФР-ІІ осуществляет через рецептор ИФР-І (Hawkes, Кат, 2004). Механизм связывания ИФР-П с рецептором. Путь, которьш ИФР-П оказывает действие на клетки-мишени, остается предметом дискуссии. Имеются данные, что изоформа А инсулинового рецептора является высокоаффинной для ИФР-П. В то время как ИФР-І функционирует прежде всего, активизируя собственный рецептор, ИФР-П, по-видимому, действует или через рецептор ИФР-І или через изоформу А рецептора инсулина (Dupont, Holzenberger, 2003; Denley et al., 2004). 1.1.4. Семейство релаксина Релаксин - двуцепочечный пептид с молекулярной массой около 6 кДа, состоящий из 56-60 АКО был открыт в 1926 году (Hisaw, 1926). Общая структурная организация релаксина и топология дисульфидных мостиков сходны с инсулином, но степень гомологии составляет лишь 30% (Schwabe, McDonald, 1977; Bedarkar et al, 1977) (Рис 1г, стр. 12). А- и В-цепи релаксина человека длиннее с N-конца на 2-4 и 3-7 АКО соответственно, а с С-конца на 1 и 5 АКО короче, в сравнении с инсулином человека. Релаксин является полифункциональным пептидом, реализующим многочисленные регуляторные эффекты. Локализация синтеза релаксина отличается у различных видов (Schwabe, Bullesbach, 1994). У млекопитающих релаксин, синтезируемый репродуктивной системой, является основной формой циркулирующего в крови гормона: у крыс, мышей и свиней он продуцируется яичниками, у кроликов и хомяков - плацентой (Sherwood, 2004). В последние годы были также выявлены несколько пептидов, имеющих значительную гомологию с релаксином и названные релаксиноподобными факторами или инсулиноподобные пептиды позвоночньж (INSL). Данная группа пептидов синтезируется преимущественно в репродуктивных тканях и включает 5 представителей (INSL3-INSL7), DSTSL7 также называют релаксином 3 (Chassin et al., 1995; Conklin et al, 1999; Lok et al., 2000; Ivell, Bathgate, 2002; Ivell et al, 2005b; Ferlm, JForesta, 2005). Физиологическая роль релаксиноноподобных факторов в настоящее время мало изучена. Релаксин синтезируется в виде одноцепочечного полипедтида, состоящего из участка сигнальной последовательности, В-цепи, С-пептида, содержащего дополнительный сайт эндопротеолиза, и А — цепи. В ходе процессинга активная форма гормона образуется после отщепления сигнального пептида и двух фрагментов С - пептида. Релаксин крысы 1(R1), релаксин мыши 1(М1), релаксин свиньи 1 (Р1) и релаксин человека 2 (Ы2) - единственные известные в настоящее время формы релаксина, секретируемые в кровяное русло (Sherwood, 2004). Первичная структура. Известна структура релаксина более 25 видов животных (Табл. 3). Двенадцать аминокислотных остатков в первичной структуре релаксинов являются высококонсервативными. Среди них 6 инвариантных цистеиновых остатков, ArgB16 и ArgB20, три остатка глицина, обеспечивающих гибкость молекулы, и 11еВ23, допускающий редкие замены на гидрофобные остатки с длинными боковыми цепями, такие как валин в релаксине свиньи (Schwabe, Bullesbach, 1994). Пространственная структура релаксина во многом сходна с инсулином. Две полипептидные цепи гормона удерживаются двумя межцепочечными дисулъфидиыми связями. Внутри А-цепи располагается дополнительная связь. А-цепь представляет собой две а-спирали, располагающиеся практически напротив друг друга и разделенные участками с вытянутой структурой. Наличие агрегатов релаксина в настоящее время не доказано. Однако характер секреции гормона, а именно накопление его в секреторных гранулах, подразумевает присутствие ассоциированных форм - димеров и гексамеров (Bryant-Greenwood, Schwabe, 1994).
Клетки нервной системы, продуцирующие ипп
Материал этого раздела касается описания иейросекреторных структур беспозвоночных у которых обнарркены ИПП. Детально дано описание нервной системы объекта наших исследований моллюска A. cygnea.
В четырех парах медиальных иейросекреторных клеток мозга A. convolvuli локализованы транскрипты генов, кодирующих ИПП. Эти клетки гомологичны таковым бомбиксин-продуцирующим нейросекреторным клетках В. mori (Iwami et al., 1996).
У D. melanogaster имеется кластер из семи медиальных иейросекреторных клеток расположенных билатерально в медиальной области мозга личинки. Эти клетки имеют аксонные терминали подходящие к эндокринной железе и аорте, чрез которую выделяемые нейрогормоны могут попадать в цжркуляторную систему. Предполагают, что нейросекреторные клетки, экспрессирующие ИПП дрозофилы соединены в кольцевую железу, которая включает клетки кардиальных тел. Сложный характер экспрессии ИПП предполагает наличие комбинированного нейросекреторного и аутокрииного/паракринного механизмов контроля (Brogiolo et al., 2001). ИПП моллюска L. stagnalis продуцируются в Light green cells (LGC), представляющих собой типичные нейросекреторные клетки. Парный медиальный губной нерв является нейрогемальной зоной для этих нейронов. Существуют данные, что LGC регулируют различные процессы, связанные с ростом, такие как рост мягких частей тела и раковины, метаболизм гликогена и ориитин декарбоксилази. Еще одним источником синтеза ИПП моллюска являются канопиевы клетки. Эти нейроны локализованы в латеральных долях, небольших ганглиях присоединенных к церебральным ганглиям (van Minnen et al., 1979). Имеются данные, что латеральные доли вовлечены в контроль синтеза и высвобождения LGC. Предполагают, что канопиевы клетки являются специализированными LGC, передающие сигнал группам LGC клеток (Smit et al., 1988). ИПП A. californica синтезируются в нейросекреторных клетках составляющих верхний слой F и С-кластеров располагающихся на дорсальной поверхности церебрального ганглия. «Bag» нейроны - группа клеток, играющих ключевую роль в репродуктивном поведении (инициируют процесс откладки яиц) (Conn, Kazmarek, 1989). С помощью антител к синтетическому бомбиксину 2, у малярийного комара А. gambiae были выявлено иммуноцитохимическое окрашивание в паре латеральных и 8-10 медиальных нейросекреторных клетках в дорсальной области мозга. Окрашивание также наблюдалось в аксонах медиальных нейросекреторных клеток, которые пересекались иа небольшом расстоянии от тел клеток и спускаясь по дуге через мозг подходили к кардиальным телам, являющимся нейрогемальными органами. У некоторых самок окрашивались аксоны, подходящие к кардиальным телам, которые ветвились и подходили к прилежащим телам, являющихся источником ювенильных гормонов. У всех самок окрашенные парные аксоны тянулись из кардиальных тел к кардиальному клапану, где они ветвились вдоль передней части средней кишки и останавливались не доходя до задней части средней кишки (стоматогастрическая нервная система). Ни одни другие клетки нервной системы, средней кишки яли стенок тела не оіфашивалжсь антителами к бомбиксину (Chan, Brown, 2001). Строение нервной системы Anodonta cygnea. На строении нервной системы двустворчатого моллюска Anodonta cygnea отразилась редукция головных органов чувств и упрощение ротового аппарата: церебральные и плевральные узлы, закладывающиеся в эмбриогенезе самостоятельно, у дефинитивных особей сливаются в один (Zs.-Nagy, 1966). Таким образом, у A. cygnea имеются три пары ганглиев: цереброплевральные, педальные и висцеропариетальные. Цереброплевральные ганглии- небольшие округлые образования (диаметр около 2 мм) лежат по обеим сторонам от ротового отверстия и соединены между собой комиссурой, проходящей над глоткой. Эти ганглии также соединяются коннективами с педальными ганглиями. Педальные ганглии расположены в средней части ноги; узлы сильно сближены и разделены слегка заметной перетяжкой. В совокупности они образуют вытянутую в латеральном направлении фигуру, напоминающую крылья бабочки размером 2x2 мм. Висцеропариетальные ганглии располагается в каудальной части тела на нижней поверхности мускула-замыкателя. Они представляют вытянутые в латеральном направлении округлые образования размером 3x4 мм. Ганглии и нервы моллюсков окружены эпиневрием, включающим элементы нейроглии и мышечные клетки. Тела нейронов образуют корковый слой; их сходящиеся к центру узла отростки формируют нейропиль, который образован из аксонов, собранных в пучки и частично покрытых глией. Особого порядка в расположении клеточных тел установить не удается. Количество нейронов в цереброплевральньгх ганглиях A. cygnea около 20000, в висцеральном узле около 30000. Нейроны моллюска имеют желто-оранжевую пигментацию или бесцветны.
Определение активности аденилатциклазы и гтф-связывания в мышечной и нервной тканях
Родственные инсулину пептиды выделены из ганглиев моллюска A. cygnea по стандартной для получения инсулина схеме с использованием катионообменника КУ-23, что позволяет уже на этом этапе достигать 70 - 85%-ной чистоты препаратов (Rusakov et al., 1990; Conlon et al., 1995; Rusakov et al., 1998). Последующая очистка - освобождение от балластных белков при помощи изоэлектрических осаждений и кристаллизация доводит этот показатель до 90%, а ВЭЖХ повышает до 98 - 99%. При выделении инсулиноподобных субстанций из внепанкреатических тканей эти величины, как правило, меньше, тем не менее, с некоторыми модификациями метод выделения инсулина с помощью сульфокатионита КУ-23 оказался успешным применительно к нервной ткани беспозвоночных (Бондарева и др., 1988; Русаков и др., 1991). ВЭЖХ очистка выделенных из ганглиев моллюска РИП позволила получить 19 пептидных изоформ, различающихся по времени удержания на колонке. Высокий уровень их гомогенности подтвержден картиной рехроматографии каждой из изоформ. Общая картина элюции РИП из отдельных ганглиев моллюска оказалась во многом сходной. Во всех случаях отмечено наличие нескольких пиков, имеющих широкий диапазон относительной гидрофобности. Анализ хроматограмм свидетельствует о существенных отличиях отдельных изоформ по физико-химическим характеристшсам от инсулина. Так, если в условиях обратнофазной хроматографии при элюировании с колонки Диасорб С[бТ, «гидрофобность» стандартного инсулина свиньи соответствует 39 %-ному содержанию апетонитрила в элюате, то аналогичная характеристика для каждого из девятнадцати нейропептидов моллюска находилась в зоне от 30 % до 50 % концентраций ацетонитрила. Среди исследованных пептидов непосредственно в зоне выхода стандартного инсулина элюировались РИП4 (38,35% ацетонитрила) из цереброплевральных ганглиев и РИП15 (38.94 % ацетонитрила) из висцеропариетальных ганглиев. Среди пептидов педальных ганглиев наиболее близко к этой зоне располагался РЙШО (40 % ацетонитрила). По результатам сравнения зон выхода пептидов относительно инсулина выявило пять групп, которые имели близкие зоны выхода (РИП5 и РИШО; РИП6, РИП 11 и РИПІ 6; РИП7, РИПІ2 и РИП 18; РИП9 и РИП 14; РИП 13 и 19) (см. рис.9). Эти данные предполагают, что в разных ганглиях A. cygnea может продуцироваться меньшее число изоформ. Подтвержением такого предположения могут служить данные о количестве изоформ ИПП у других видов моллюсков: у L. stagnalis обнаружено 5 изоформ, а у A. californica только две (Smit et al.5 1998; Floyd et al., 1999). Хроматографическое распределение полученных нами пептидов указывает на их структурное разнообразие, что согласуется с известными данными о полиморфизме генов, кодирующих ИПП беспозвоночных (Kondo et al., 1996; Smit et al., 1998; Brogiolo et al., 2001; Li et al., 2003; Krieger et al., 2004). При этом, если изоморфизм природных вариантов гормонов позвоночных проиллюстрирован немногочисленными примерами (Lomedico et al., 1979; Soares et al., 1985; Wentworth et al., 1986), то в отношении инсулиыоподобных субстанций беспозвоночных множественность генов скорее закономерность, чем исключение (Claeys et al., 2002; Li et al., 2003). Значимость такого феномена известна в молекулярной эволюции, когда в процессе образования новых функций, востребованных на более высоком уровне филогенеза, происходит фиксация освобожденных от прессинга естественного отбора белковых структур. С другой стороны, можно предполагать присутствие в нервной ткани моллюска A.cygnea широкого спектра родственных инсулину пептидов разнонаправленного действия. Основу банка данных известных аминокислотных последовательностей инсулиноподобных пептидов составляют гормоны, формирующие, так называемое, суперсемейство инсулина. Более низкий уровень, определяющий в молекулярной классификации место конкретных гормонов базируется не только на структурной гомологии, но и на функциональном сходстве. В иисулиновом суперсемействе выделяют четыре основных семейства: инсулины, ИФР-І, ИФР-И, а также релаксины и релаксинододобные факторы. Наряду с этим к настоящему времени структурно охарактеризовано более 100 ИПП беспозвоночных, формирующих внутри инсулинового суиерсемейства несколько отдельных семейств (бомбиксины, МИП, ИПП нематоды, ИПП дрозофилы и другие). Однако для классификации пептидов беспозвоночных необходимо, но недостаточно иметь гомологию первичных структур стандартным гормонам позвоночных. Только знание биологических свойств ИПП позволит определить их точную таксономическую принадлежность к определенному семейству. В этом контексте закономерен второй раздел наших исследований, направленный на функциональную характеристику выделенных и очищенных РИП моллюска. Полученные нами данные о слабой конкурентноспособности отдельных изоформ РИП моллюска в радиорецепторных тест-системах с мечеными инсулином и ИФР-І указывают на низкое структурное соответствие области связывания их молекул с рецептором плазматических мембран печени и мозга крыс. Наши данные согласуются с результатами единственной работы по взаимодействию с рецепторами инсулина млекопитающих инсулииоподобного пептида INS6, синтезированного ыа основе данньж пуклеотидной последовательности из генома нематоды С. elegans (Hua et aL, 2003). ІТептид бьш способен связываться с рецептором инсулина с относительным сродством 0,6 % от активности гомологичного системе гормона человека. В экспериментах по стимуляции автофосфорилирования рецептора инсулина, для достижения соответствующего уровня фоефорилирования требовалась концентрация INS6 на три порядка большая, чем инсулина. Исходя из величины относительного сродства, тестированные нами РИП можно разделить на две группы. Первая группа;, включающая 8 пептидов, имеющих относительное сродство связывания с рецепторами более 1 %, что позволяет говорить об «инсулиноподобности» данных изоформ. Пептиды второй, более многочисленной группы, проявившие крайне слабую аффинность к рецепторам инсулина и ИФР-І, можно считать не взаимодействующими и не являющимися инсулиноподобными, поскольку величины их сродства находятся в пределах ошибки метода. В свою очередь пептиды первой группы можно разделить на взаимодействующие только с рецептом ИФР-І - РИПІ, РИГО, РИП6, РИП 11 и РЙП17, и пептиды способные взаимодействовать с обоими типам рецепторов, так называемые «функциональные гибриды». Эта подгруппа включает 3 пептида РИПЗ, РИП4 и РИП5, среди которых РИП4 является уникальным, обладающим одинаковым сродством к репторам инсулина и ИФР-І. Таким образом, можно говорить о присутствии в ганглиях моллюска Acygnea пептидов функционально близких ИФР-L Подгруппа «гибридных» изоформ в таком случае могла бы дать начало семейству пептидов, занимающему промежуточное положение между семействами инсулина и ИФР-L В тоже время использование ограниченного набора тест-систем не позволяет однозначно определить группу пептидов, не обладавших достоверным сродством к рецепторам позвоночных как пептиды неинсулиновой природы. Для получения полной характеристики следует оценить функциональные свойства РИП моллюска в тест-системах других гормонов инсулинового суперсемейства. Необходимо учитывать, что такого рода «сортировка» достаточно условна, и, во всех случаях, является свидетельством относительной гомологии РИП стандартному инсулину млекопитающих.
Оценка способности рип моллюска взаимодействовать с рецепторами инсулина и ифр-1
В аспекте изучения инсулиноподобных пептидов нервной ткани A. cygnea, представляют интерес, проведенные ранее в лаборатории исследования (Pertseva et al., 1995) по сравнительному изучению влияния инсулина и инсулиноподобных пептидов, выделенных из висцеральных органов A. cygnea (Русаков и др., 1991) на активность аденилатциклазы в гладких мышцах моллюска. Было выявлено, что ИПП A.cygnea активизируют АЦ дозозависимым способом. При сравнении этого эффекта с аналогичным действием инсулина млекопитающих на АЦ гладких мышц моллюска, обнаружена меньшая эффективность инсулина. При исследовании влияния пептидов моллюска на АЦ в скелетных мышцах крыс инсулин был эффективнее пептидов моллюска.
Учитывая всю совокупность данных и закономерности выявленные ранее в лаборатории, аденилатциклазная сигнальная система явилась адекватной тест-системой для изучения функциональных характеристик выделяемых из ганглиев моллюска A. cygnea родственных инсулину пептидов.
Касаясь вопроса о сходном действии в аденилатциклазной системе двух пептидов, значительно различающихся по данным радиолигандного анализа по сродству к рецепторам позвоночных можно увидеть противоречие. С другой стороны можно видеть что в этом кроется еще одно подтверждение того, что пептиды из группы со слабым сродством, тем не менее обладают инсулиновой природой, то есть могут являться инсулиноподобными по крайней мере на уровне суперсемейства, и возможно используют одни и те же сигнальные системы.
Из результатов настоящей работы следует, что, как и у других видов беспозвоночных, нервная ткань моллюска способна синтезировать РИП, которые
обнаруживаются в клетках коркового слоя ганглиев. Неупорядоченное расположение этих клеток в отличие от более высокоорганизованных беспозвоночных позволяет говорить о присутствии у данного вида начального этапа развития системы синтезирующей инсулиноподобные пептиды.
С использованием хроматографических методов, из ганглиев A. cygnea было выделено 19 изоформ РИП. Полученные РИЛ проявили способность связываться с рецепторами инсулина и ИФР-І млекопитающих, что предполагает присутствие на данном этапе филогенеза инсулиноподобных молекул, обладающих ростовыми и метаболическими функциями. Однако более высокое сродство РИП к рецепторам ИФР-І свидетельствует о преобладании у нейропептидов моллюска ростовой активности. Для дальнейшей характеристики выделенных пептидов было показано участие адеиилатциклазной системы, в передаче гормонального сигнала РИП. Отдельные пептиды оказали дозозависимое стимулирование активности АЦ и ГТФ-связывания G-белков сходным с инсулином и ИФР-І образом, что свидетельствует о консервативности механизмов передачи сигнала кодируемого ИПП в разных филетических линиях.
Становится все более очевидным, что молекулярная эволюция относительно небольших инсулиноподобных молекул и систем, обеспечивающих их функционирование, происходили в крайне детерминированных условиях, ограничивающих вариации структуры этих пептидов. Филогенетические изменения гормонов инсулинового суперсемейства можно условно разделить на «макро-» и «микроэволюционные». Макроуровень отражает изменения структуры пептидов, связанные с приобретением новых функций и затрагивающие не только гормон, но и структуры обеспечивающие передачу гормонального сигнала, что в конечном итоге приводит к появлению из общего пептида-предшественника инсулина, ИФР и релаксина. Микроуровень оперирует изменениями, как иравило, не затрагивающими участки молекулы гормона, ответственные за связывающие места с рецептором, что позволяет пептиду сохранять принадлежность к определенному семейству.
Макро- и микроэволюционные модификации инсулиноподобных гормональных молекул и обеспечивающих их функционирование систем, прослеживается на примере исследованных нами РИЛ моллюска A. cygnea. В первую очередь, на это указывает множественность пептидных изоформ, обладающих инсулиновой и ИФР-подобной активностью, что можно считать свидетельством в пользу существования на ранних этапах филогенеза белка-предшественника общего для гормонов инсулииового суперсемейства.
Выявленная способность множественных изоформ РИЛ моллюска взаимодействовать с рецепторами инсулина и ИФР-І говорит о принципиальной возможности осуществления сходных с гормонами позвоночных эффектов, что свидетельствует о консервативности конкретных функциональных свойств, сохраненных в процессе эволюции.
Дальнейшее изучение функций и установление структуры РИЛ моллюска могут оказаться существенными как для понимания регуляторной роли этих нейропептидов, так и эволюции гормонов инсулииового суперсемейства.
В переброплевральных, педальных и висцеропариетальных ганглиях пресноводного моллюска Anodonta cygnea выявлены нейроны, содержащие пептиды, способные взаимодействовать с антителами к инсулину позвоночных. Расположение инсулин иммуиореакгивных клеток не имело упорядоченности, характерной для более высокоорганизованных беспозвоночных животных. Результаты ШДР-анализа по выявлению мРНК, кодирующих родственные инсулину пептиды моллюска, показали различия в экспрессии ПЦР-продуктов в отдельных видах ганглиев.
Родственные инсулину пептиды выделены из ганглиев моллюска A. cygnea с применением оригинального метода ионообменной хроматографии используемого для получения инсулина. Очистка пептидов с помощью двуступенчатой высокоэффективной жидкостной хроматографии выявила 19 пептидных изоформ, различающихся по величине относительной гидрофобности (30-50 % концентрации ацетонитрила в сравнении с 39% инсулина), что косвенно отражает различия первичных структур отдельных изоформ.
Полученные РИП моллюска при тестировании в видоспецифичной радиолигандной системе инсулина проявили принципиальную способность взаимодействия с рецептором инсулина позвоночных, при этом отдельные пептидные изоформы значительно различались по степени сродства к рецептору инсулина (ІС50 17-1700 нМ).
