Введение к работе
~
Актуальность проблемы. Ионы кальция служат универсальным регулятором самых разнообразных процессов, протекающих в живой клетке. Одним из таких процессов является передача светового сигнала (фототрансдукция) в фоторецепторных клетках позвоночных животных. Воздействие Са+ на систему фототрансдукции у позвоночных животных опосредовано Са2+-связывающими белками. Эти белки сами по себе каталитической активностью не обладают; их функция состоит в придании различным клеточным мишеням чувствительности к ионам кальция. Одним из важнейших свойств фоторецепторных Са2+-связывающих белков является их способность Са2+-зависимым образом взаимодействовать с фосфолипидными мембранами. Некоторые из фоторецепторных Са2+-связывающих белков в настоящее время выделены и охарактеризованы, это - кальмодулин, рековерин, SlOO-белки и активаторы гуанилатциклазы-1, -2 и 3. Все перечисленные белки относятся к обширному семейству EF-hand-содержащих Са2+-связывающих белков, т.е. содержат в своем составе специальную структуру(ы) для связывания Са2+, получившую название EF-hand. Еще одно семейство Са+-связывающих белков - аннексины; это семейство включает в себя более двадцати представителей, сходных между собой по структуре и биохимическим свойствам. Аннексины, хотя и не содержат EF-hand-структур, однако способны Са2+-зависимым образом взаимодействовать с фосфолипидными мембранами. Актуальность настоящей работы обусловлена тем, что интенсивные исследования аннексинов, проводимые в последние годы, позволили обнаружить эти белки в клетках различных типов и выявить их участие в самых разнообразных биологических процессах: от транспорта и организации клеточных мембран до передачи внутриклеточных сигналов. Тем не менее конкретная функция аннексинов в большинстве клеток так и остается неустановленной. Это утверждение особенно актуально для фоторецепторных клеток позвоночных животных, для которых какие-либо исследования аннексинов до сих пор вообще не проводились.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучение аннексина А4 из фоторецепторных клеток быка. В соответствии с этой целью в работе решались следующие задачи:
-
Выделение, очистка и идентификация фоторсцепторного аннексина А4.
-
Исследование локализации аннексина А4 в сетчатке быка.
-
Изучение связывания аннексина А4 с фоторецепторными мембранми и аннексии А4 -зависимой агрегации фоторецепторных мембран.
-
Поиск и идентификация потенциальных белковых мишеней аннексина А4 в фоторецепторной клетке.
З І POU НАЦИОНАЛЬНА»* і
Научная новизна и практическая значимость работы, В процессе выполнения настоящей работы впервые выделен, очищен и идентифицирован Са2+-связывающий белок аннексии А4 из фоторецепторных клеток быка. Установлена локализация аннексина А4 в наружных и внутренних сегментах фоторецепторных клеток. Продемонстрирована способность аннексина А4 связываться с фоторецепторными мембранами, а также агрегировать их в присутствии ионов кальция или цинка. Обнаружено, что потенциальными белковыми мишенями аннексина А4 в фоторецепторной клетке являются рековерин, митохондриальная креатинкиназа и аннексины А2 и А6. Настоящая работа - первое исследование одного из представителей семейства аннексинов в фоторецепторных клетках.
С учетом физиологической важности ионов кальция и Са2+-связывающих белков как регуляторов фототранедукции, изучение Са2+-связывающего белка аннексина А4, впревые обнаруженного нами в фоторецепторной клетке, необходимо для выяснения молекулярных основ зрения. Кроме того, исследование аннексинов в различных тканях важно для установления молекулярных механизмов "аннексинопатии" — нарушений экспрессии и свойств аннексинов, которые сопровождают сердечно-сосудистые и раковые заболевания. Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на XIII и XIV зимних международных молодежных научных школах "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2001 и 2002), III съезде Всероссийского биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002) и на 6-ой Международной конференции по молекулярной биологии памяти ВА. Энгельгардта (Санкт-Петербург- Москва, 2003). Структура и объём работы. Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Материал иллюстрирован 34 рисунками и 6 таблицами. Библиографический указатель включает 199 цитированных работ.
