Содержание к диссертации
Введение
1 «Аннексины - семейство Са2+/фосфолипидсвязывающих белков» 9
1. Са2+-связывающие белки в регуляции зрительной трансдукции 9
1.1. Общая схема зрительной трансдукции 9
1.2. Регуляция зрительной трансдукции. 14
2. Структура и общие свойства аннексинов 21
2.1. Номенклатура 21
2.2. Тканевая и внутриклеточная локализация 22
2.3. Гены и первичная структура 27
2.4. Вторичная и третичная структуры 31
2.5. Димеризация и четвертичная структура 39
2.6. Связывание с мембранами и агрегация клеточных мембран 40
2.7. Взаимодействие с лигандами нелипидной природы 47
3. Функциональная активность аннексинов 54
3.1. Участие в транспорте и организации клеточных мембран 55
3.2. Регуляция проводимости и образование ионных каналов 59
3.3. Участие в клеточной пролиферации и дифференцировке, 61
3.4. Аннексины в крови и межклеточном пространстве 62
4. Аннексинопатии 65
2 Материалы и методы 67
1. Реактивы 67
2. Выделение НСП из сетчаток быка и получение экстракта НСП 67
3. Очистка аннексина А4 (р32) из НСП и печени быка 68
4. Получение отмытых мочевиной фоторецепторных мембран. 69
5. Получение поликлональных моноспецифических антител против аннексина А4 из печени быка 70
6. Получение фракции белков НСП, способных Са -зависимым образом взаимодействовать с иммобилизованным аннексином А4 70
7. Определение концентрации белков 71
8. SDS-электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) 71
9. Иммуноблотгинг. 71
10. Масспктрометрический анализ белковых препаратов 72
11. Иммунофлуоресцентное окрашивание срезов сетчатки и печени 73
12. Связывание аннексина А4 с отмытыми мочевиной фоторецепторными мембранами 74
13. Агрегация отмытых мочевиной фоторецепторных мембран в присутствии аннексина А4 75
3 Результаты и их обсуждение 76
1. Выделение и очистка фоторецепторного белка р32 и его идентифика ция как аннексина А4 77
1.1. Получение и характеристика фракции фоторецепторных "Са -зависимых" белков 77
1.2. Выделение и очистка фоторецепторного белка с кажущейся молекулярной массой 32 кДа (р32) 78
1.3. Доказательство способности гомогенного р32 взаимодействовать с фоторецепторными мембранами Са2+-зависимым образом 81
1.4. Идентификация р32 как аннексина А4 83
1.5. Изучение локализации аннексина А4 в сетчатке быка 85
2. Изучение функциональных свойств фоторецепторного аннексина А4 90
2.1. Взаимодействие аннексина А4 с фоторецепторными мембранами 92
2.1.1. Са +-зависимое связывание аннексина А4 с фоторецепторными мембранами 92
2.1.2. 2п2+-зависимое связывание аннексина А4 с фоторецепторными мембранами 98
2.2. Аннексии А4-зависимая агрегация фоторецепторных мембран 102
2.2.1. Аннексии А4-зависимая агрегация фоторецепторных мембран в присутствии ионов кальция 103
2.2.2. Аннексии А4-зависимая агрегация фоторецепторных мембран в присутствии ионов цинка 105
3. Поиск потенциальной белковой мишени (мишеней) для аннексина А4 в фоторецепторной клетке 110
3.1. Выявление растворимых белков НСП, связывающихся с иммобилизованным аннексином А4 Са2+-зависимым образом 111
3.2. Идентификация потенциальных белковых мишеней аннексина А4 112
Выводы 123
- Структура и общие свойства аннексинов
- Функциональная активность аннексинов
- Очистка аннексина А4 (р32) из НСП и печени быка
- Выделение и очистка фоторецепторного белка с кажущейся молекулярной массой 32 кДа (р32)
Введение к работе
Ионы кальция служат универсальным регулятором самых разнообразных процессов, протекающих в живой клетке. Одним из таких процессов является передача светового сигнала (фототрансдукция) в фоторецепторных клетках позвоночных животных. Воздействие Са2+ на систему фототрансдукции у позвоночных животных опосредовано Са -связывающими белками. Эти белки сами по себе каталитической активностью не обладают; их функция состоит в придании различным клеточным мишеням чувствительности к ионам кальция. Одним из важнейших свойств фоторецепторных Са2+-связывающих белков яв-ляется их способность Са -зависимым образом взаимодействовать с фосфолипидными мембранами.
Некоторые из фоторецепторных Са2+-связывающих белков в настоящее время выделены и охарактеризованы, это - кальм одулин, ре-коверин, SlOO-белки и активаторы гуанилатциклазы-1, -2 и 3. Все перечисленные белки относятся к обширному семейству EF-hand-содержащих Са -связывающих белков, т.е. содержат в своем составе специальную структуру(ы) для связывания Са2+, получившую название EF-hand. Еще одно семейство Са2+-связывающих белков - аннек-сины; это семейство включает в себя более двадцати представителей, сходных между собой по структуре и биохимическим свойствам. Ан-нексины хотя и не содержат EF-hand-структур, однако способны Са -зависимым образом взаимодействовать с фосфолипидными мембранами. Интенсивные исследования аннексинов, проводимые в последние годы, позволили обнаружить эти белки в клетках различных типов и выявить их участие в самых разнообразных биологических процессах: от транспорта и организации клеточных мембран до передачи внутриклеточных сигналов. Тем не менее, конкретная функция аннексинов в каждом случае остается не установленной.
Исследования аннексинов в фоторецепторных клетках позвоночных животных до сих пор не проводились. В настоящей работе мы впервые показали присутствие одного из представителей семейства аннексинов, аннексина А4, в наружных сегментах фоторецепторных клеток быка, и получили данные, указывающие на функцию аннексина А4 в этом виде клеток.
Структура и общие свойства аннексинов
Аннексины - семейство структурно родственных Са +-связывающих белков, способных Са2+-зависимым образом связываться с фосфолипидами. Основным признаком аннексинов является наличие в их первичной структуре четырех (в случае аннексина А6 — восьми) консервативных 70-звенных аминокислотных повторов, составляющих протяженный С-концевой участок, и гипервариабельного N-концевого участка, отвечающего за различия в свойствах этих белков. К настоящему моменту аннексины найдены во множестве организмов, начиная от млекопитающих и заканчивая простейшими. Аннексины вовлечены во многие биологические процессы, такие как регуляция транспорта через мембрану, регуляция активности трансмембранных каналов, ингибирование коагуляции, ингибирование фосфо-липазной активности, согласование взаимодействий между клетками и межклеточным матриксом. Тем не менее, несмотря на обилие данных, полученных в последние 10 лет, конкретные биологические функции аннексинов к настоящему моменту не установлены. Далее рассмотрим особенности строения и функционирования наиболее изученных представителей семейства аннексинов, среди которых аннексии А4 - объект исследования настоящей работы. 2.1. Номенклатура. Название "аннексины" произошло от греческого "annex" - при-соединяться - из-за способности этих белков Са -зависимым образом связываться с клеточными мембранами. В 70-80-х годах прошлого века названия аннексинов производили от биохимических свойств отдельных белков, например, синексин (белок, способный агрегировать везикулы), хромобиндины (белки, связывающийся с хромафинными гранулами), кальцимедины (белки, регулирующие сигналы Са2+), липокортины (ингибиторы липаз), калпактины (белки, связывающие ионы Са , фосфолипиды и актин). В конце 80-х номенклатура претерпела первые изменения с появлением термина "аннексии" [52]: по мере обнаружения представителям семейства присваивались порядковые номера (аннексины I - XIII). Однако выделение белков семейства аннексинов из организмов, отличных от млекопитающих, равно как и прочтение генов большинства аннексинов, снова потребовало изменения номенклатуры. Последняя номенклатура аннексинов, введенная в 2002 году, учитывает вид организма, из которого выделен белок (например: аннексии IV -аннексии А4; А - позвоночные животные). В табл. 1 приведены два последних варианта номенклатуры аннексинов по данным [53]. 2.2. Тканевая и внутриклеточная локализация.
Как видно из табл. 1, тринадцать основных аннексинов (А1 -А13) обнаружены у млекопитающих, четыре представителя семейства присутствуют у насекомых (В9-В12), пять аннексинов экспрессиру-ются в грибах и дрожжах (С1-С5), еще двадцать пять аннексинов обнаружены в растениях (D1-D25). Кроме этого, три представителя семейства аннексинов обнаружены у простейших (Е1-ЕЗ) [53]. У млекопитающих аннексины локализованы во множестве тканей, при этом некоторые представители семейства могут составлять более 2 % от суммарного белка в клетке. В качестве примера можно привести данные о присутствии аннексинна А6 в тканях крысы (табл. 2) [54]. Полное имму но гистохимическое сканирование человеческих тканей с испльзованием антител против аннексинов А1, А2 и А4 показало присутствие этих белков в различных клетках дыхательной, пищеварительной и репродуктивной систем, печени, почек, эндокринных органов, лимфатических узлов, кожи, скелетных мышц и сердца [55]. Кроме этого, аннексии А1 обнаружен в лимфоцитах и моноцитах [55], а также в костной и хрящевой тканях [56, 57]. Есть данные о присутствии аннексинов А1, А2 и А4 в тканях нервной системы. Так, все три белка присутствуют в нервных клетках и сплетениях [55]. Внутриклеточная локализация различных аннексинов отличается, однако общим является присутствие этих белков на поверхности мембран различных типов [58]. Так, аннексии А1 локализован на эн-досомальных и фагосомальных мембранах в макрофагах; в нейтрофи-лах аннексии А1 транслоцируется из цитоплазмы на поверхность фа-госомалыюй и плазматической мембран; в клетках почек аннексии А1 присутствует в примембранном слое плазматической мембраны и на мембране эндосом; аннексии А1 обнаружен на поверхности инсулинсодержащих везикул в Р-клетках поджелудочной железы, а также на цитосклетных структурах кератиноцитов. Кроме этого, в эндотели-альных клетках аннексии А1 выявлен в их ядре [59]. Аннексии А2 во многих случаях колокализован с аннексином А1 [55]. Кроме этого, аннексии А2 входит в состав субмембранного цитоскелета. Интересно, что аннексии А2 не распределяется равномерно по поверхности плазматических мембран, а концентрируется в дискретных областях [58]. Такая локализация аннексина А2 характерна для поляризованных клеток (энтероциты, эпителиальные клетки молочной железы), а также для макрофагов, где белок концентрируется в тех областях плазматической мемебраны, в которых наблюдаются мембранные неоднородности и утолщения. Такая же картина наблюдается и в эндосомах. Аннексии А2 локализуется на поверхности различных секреторных везикул. Например, в хромаффинных клетках надпочечников аннексии А2 является основным компонентом хрома-финных гранул, а в гипофизарных клетках этот белок локализован на стыках мембран секреторных везикул и плазматической мембраны.
Интересно, что локализация аннексина А2 зависит от концентрации внутриклеточного кальция. Например, культивирование клеток эпителия почек в среде с пониженной концентрацией Са24" приводит к транслокации аннексина А2 с поверхности плазматической мембраны в цитоплазму. Также показано, что связывание аннексина А2 с белком SlOO-семейства, S100A11, приводит к закреплению комплекса на поверхности цитоскелета [58]. Заметим, что аннексии А2 так же, как и аннексии А1 обнаружен в клеточном ядре [60]. Внутриклеточная локализация аннексина A3, впервые выделенного из плаценты [61], в основном, изучена для нейтрофилов и макрофагов. Здесь аннексии A3 присутствует на поверхности плазматической мембраны, а также на поверхностях внутриклеточных гранул и фагосом. Кроме того, показана транслокация цитоплазматического аннексина A3 к поверхности фагосомальных мембран во время фагоцитоза [58]. Аннексии А4 локализован на поверхности плазматической мембраны эпителиальных клеток различных тканей [55,58], таких, как например, легкие [62, 63], матка [64], почки [65] и печень [66]. Кроме того, этот белок обнаружен на поверхности эндосом в макрофагах [67]. В фибробластах аннексии А4 присутствует в ядре [68]. Аннексии А5 - еще один представитель семейства аннексинов, который локализован на поверхности плазматических и эндосомаль-ных мембран различных клеток [58]. Аннексии А5 обнаружен в эндо-плазматическом ретикулуме глиальных клеток и саркоплазматиче-ском ретикулуме клеток скелетных мышц. Как и в случае других аннексинов, показана транслокация цитоплазматического аннексина А5 на поверхность плазматической мембраны, однако этот процесс не всегда является Са -зависимым. Например, в тромбоцитах такая транслокация индуцируется тромбином. Кроме того, продемонстрирована ассоциация аннексина А5 с везикулами, содержащими альбумин, во время эндоцитоза последнего в дендритах. Аннексии А5 обнаружен как в цитоплазме, так и в ядре эндотелиальных и эпителиальных клеток, а также фибробластов [68]. Внутриклеточная локализация аннексина А6 гораздо шире, чем других представителей семейства [58]. Например, этот белок обнаружен на поверхности плазматической мембраны лимфоцитов и гепато-цитов, в митохондриях клеток печени, в саркоплазматическом ретикулуме клеток скелетных мышц, в фагосомах макрофагов и на поверхности эндосомальных мембран в клетках печени. Аннексии А7, впервые обнаруженный в хромаффинных клетках надпочечников, локализован в цитоплазме этих клеток и на поверхности хромаффинных гранул. Кроме того, этот белок присутствует в ци-тозоле, на плазматической мембране и на поверхности микротрубочек в мышечных клетках [58]. Аннексии All в фибробластах присутствует в ядре, причем такая локализация определяется присутствием в молекуле белка длинного N-концевого участка.
Функциональная активность аннексинов
В последние годы накоплено большое количество данных, касающихся функции аннексинов внутри клеток и в межклеточном пространстве. Большинство этих данных указывают на участие аннексинов в самых разнообразных процессах, происходящих в живой клетке: в транспорте и организации клеточных мембран, в проводимости ионных каналов, в клеточной пролиферации и дифференцировке, а также в межклеточных контактах и во взаимодействиях клеток с межклеточным матриксом. Аннексины А1, А2, A3, А6, А7, А11, А13 и В7 принимают непосредственное участие в экзоцитозе [53]. Как известно, при экзоцитозе секреторные гранулы, содержащие вещества, которые необходимо вывести из клетки, транслоцируются к внутренней поверхности плазматической мембраны, где сливаются между собой и с плазматической мембраной, и выбрасывают содержимое в межклеточное пространство. Как правило, все перечисленные события являются Са2+-зависимыми. Рассмотрим участие аннексинов в экзоцитозе на примере аннексина А2. Введение очищенного препарата аннексина А2 в хромаф-финные клетки надпочечников замедляет выключение Са2+-зависимого секреторного ответа, составными частями которого являются агрегация хромаффинных гранул между собой и слияние образующихся агрегатов с плазматической мембраной [53,155]. Участие аннексина А2 в секреторном ответе хромаффинных клеток подтверждается еще и тем, что гетерокомплекс, состоящий из двух молекул аннексина А2 и димера S100A10, локализуется в участках контактов между плазматической мембраной и секреторными гранулами, а также в местах контактов между самими гранулами. Тем самым аннексии А2 образует мостики между мембранами и, как следствие, способствует их агрегации и последующему слиянию [53]. Показано, что для того, чтобы аннексии А2 мог стимулировать экзоцитоз, его N-концевой участок должен быть предварительно фос-форилирован протеинкиназой С [156]. Интересно, что при стимуляции экзоцитоза в хромаффинных клетках аннексии А2 секретируется в межклеточное пространство. Происходит это потому, что при образовании контактов между плазматической мембраной и хромаффинны-ми гранулами молекулы аннексина А2 оказываются внутри этих грапул и выбрасываются из клетки [157]. Добавим, что аннексии А2-индуцируемый экзоцитоз показан не только для хромаффинных клеток, но и для клеток легочных альвеол [158] и эндотелиальных клеток легочной артерии [159]. Аннексины АЦ А2 и А6, по-видимому, принимают участие в эндоцитозе [53]. Рассмотрим механизм эндоцитоза рецептора эпидер-мального фактора роста, индуцируемого аннексином А1 (рис. 8).
Аннексии А1, по-видимому, может существовать в клетке в виде двух форм — полноразмерной и укороченной за счет протеолиза его N-концевого участка. При эндоцитозе рецептора эпидермального фактора роста на поверхности формирующихся эндосом (так называемые "ранние" эндосомы) обнаружены полноразмерные молекулы аннекси-на AI. Эти молекулы могут образовывать комплексы с димерами S100A11 и тем самым индуцировать агрегацию и слияние мембран, которые играют ключевую роль при образовании эндосомы. В то же время, в составе "поздних", уже сформировавшихся эндосом обнаружен аннексии А1 с удаленным N-концевым участком. Сигналом к удалению N-концевого фрагмента аннексина А1 является фосфорили-рование этого белка по остатку тирозина-20 под действием протеин-киназной активности рецептора эпидермального фактора роста. Про-теолиз N-концевого домена аннексина А1 лишает его способности агрегировать мембраны, поскольку приводит к удалению участков связывания с димером белка S100A11 (как было сказано выше в комплексе с димером S100A11 две молекулы аннексина А1 способны связывать мембранные поверхности при их агрегации). В итоге одна из укороченных молекул аннексина А1 попадает в состав образовавшейся "поздней" эндосомы. Есть целый ряд указаний на участие аннексинов в такой разновидности эндоцитоза, как фагоцитоз [58]. Практически все аннексины обнаружены на поверхности фагосом различных макрофагов (см. раздел 2.2.). Более того, в случае аннексина А4 показано, что его количество на поверхности фагосом увеличивается в процессе их созревания [160]. Помимо участия в экзо- и эндоцитозе аннексины могут выступать в роли структурных белков в процессах организации клеточных мембран. Например, аннексины способны взаимодействовать с так называемыми рафт-структурами - мембранными микродоменами, богатыми холестерином и сфинголипидами. В рафт-структурах присутствуют различные белки, среди которых найдены аннексины А2, А6 и А13 [135,161]. Аннексии А2 в клетках различных типов способен взаимодействовать с рафт-структурами как Са +-зависимым, так и Са +-независимым образом; в последнем случае, связывание определяется количеством холестерина, входящего в состав мембран. Такая двойная регуляция возможна благодаря характерной структуре аннексина А2: его N-концевой гипервариабельный домен участвует в холе-стеринзависимом связывании, а Са2+-связывающий С-концевой фрагмент - в Са2+-зависимом взаимодействии аннексина А2 с рафт-структурами. В отсутствие ионов кальция аннексии А2 способен взаимодействовать с рафт-структурами, по-видимому, участвуя в их стабилизации. В присутствии Са2+ количество аннексина А2, связанного с мембранами, увеличивается, за счет чего у него появляется возможность присоединять другие мембраны или взаимодействовать с цитоскелетом.
Добавим, что аннексии А6 так же, как и аннексии А2, способен Са24"-зависимым образом взаимодействовать с рафт-структурами, одновременно образуя контакты с филаментами цито-скелета. По-видимому, взаимодействие аннексинов с рафт-структурами, важно не только для поддержания структуры клеток, но и для различных сигнальных событий, происходящих в клетке. В случае аннексина А13 способность этого белка взаимодействовать с рафт-структурами используется в экзоцитозе [161]. Авторы этой работы показали, что аннексии А13 связываяется с мембранами транс-Гол ьджи и принимает участие в образовании экзосом, после чего, по-видимому, переносится с экзосомами к плазматической мембране и присоединяет их к рафт-структурам в составе фосфолипидного бислоя. В заключение настоящего раздела добавим, что аннексины способны не только принимать участие в транспорте и организации фос-фолипидных мембран, но и, взаимодействуя с ними, изменять физико-химические свойства фосфолипидного бислоя. Так, связывание молекул аннексина А4 на поверхности фосфолипидного бислоя повышает плотность внешнего слоя мембраны и тем самым уменьшает проницаемость мембраны для воды и протонов [162]. К настоящему времени получено множество экспериментальных указаний на способность аннексинов регулировать ионные потоки через мембрану. Как уже обсуждалось в разделе 2.6., аннексины могут как присоединяться к поверхности мембраны (это свойство характерно для большинства аннексинов), так и встраиваться в структуру фосфолипидного бислоя. Соответственно, предполагается, что аннексины участвовуют в транспорте различных ионов через мембрану либо связываясь на поверхности мембран и тем самым регулируя активность трансмембранных каналов, либо встраиваясь в фосфолипид-ный бислой и образуя трансмембранные каналы. Экспериментальные подтверждения способности аннексинов регулировать проводимость различных ионных каналов получены для аннексинов А2 [163], А4 и Аб[1б4]. На наш взгляд, наиболее убедительны доказательства способности аннексина А4 регулировать проводимость СГ-канала, локализованного в плазматической мембране клеток толстого кишечника [165, 166]. Перечислим эти доказательства, которые, следует подчеркнуть, получены в условиях in vivo. 1. Аннексии А4 локализован в апикальной части плазматической мембраны, где находятся СГ-каналы. 2. Введение очищенного препарата аннексина А4 в цитоплазму этих клеток ингибирует проводимость Са2+-зависимых СГ-каналов. 3. Введение в клетку антител против аннексина А4 или антисенсовых олигонуклеотидов против мРНК этого белка способствуют активации проводимости СГ-канала. 4. Активация проводимости, наблюдаемая в присутствии антител против аннексина А4, блокируется с помощью синтетического пептида, который ингибирует фосфорилирование СГ-канала кальмодулинзависимой протеинкиназой II. Перечисленные экспериментальные данные можно проиллюстври-ровать схемой, представленной на рис. 9.
Очистка аннексина А4 (р32) из НСП и печени быка
Все процедуры выделения аннексина А4 (р32) из НСП проводили при +4 (за основу был взят метод, описанный ранее [177]). Замороженный препарат НСП суспендировали в буфере Б с добавлением 1 мМ меркаптоэтанола и 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторида, а также 2 мМ СаСЬ и 100 мМ NaCl. Далее суспензию центрифугировали (100 000 g, 60 мин) и полученный осадок мембран отмывали от растворимых белков сначала этим же буфером, затем буфером Б с добавлением 0,5 мМ СаСЬ и 100 мкМ GTP и еще дважды — буфером Б, содержащим только 0,5 мМ СаС12. В каждом случае мембраны после отмывания собирали центрифугированием в течение 60 мин при 100000 g. После чего белки, связавшиеся с фоторецепторными мембранами в присутствии Са2+} экстрагировали буфером А, который содержал 2 мМ ЭГТА, и экстракт диализовали против 25 мМ Hepes-буфера, рН 7,3 (буфер В) в течение ночи. Полученный раствор наносили на колонку Mono-Q HP 5/5, уравновешенную буфером В. Хроматографию проводили на хроматографе FPLC (Amersham Pharmacia Biotech) при скорости элюции 1 мл/мин, сначала элюируя белки буфером В, затем градиентом (0 — I М) NaCl в этом же буфере. Основная доля р32 была найдена во фракциях, элюировавшихся с колонки при концентрации соли 195-200 мМ. Аннексии А4 из печени получали согласно процедуре из работы [178], которая включала Са -зависимую экстракцию белков из гомо-гената печени с последующей хроматографией на фенилсефарозе, а затем - на Q-сефарозе. После этого препарат белка диализовали против буфера В, содержащего 2 мМ СаСЬ и наносили на колонку НіТгар Heparin, уравновешенную тем же буфером. Хроматографию проводили с помощью прибора GradiFrac (Amersham Pharmacia Biotech), элюируя аннексии А4 буфером В, содержащим 5 мМ ЭГТА. Полученный гомогенный препарат белка хранили при -20. 4. Получение отмытых мочевиной фоторецепторных мембран. Все процедуры по получению фоторецепторных мембран, отмытых мочевиной, проводили при температуре 4 С на красном свету согласно методу, описанному в работе [179]. Осадок НСП гомогенизировали в 10-кратном объеме раствора 5 М мочевины в 20 мМ Трис-НС1 буфере, рН 7,5, содержащем 5 мМ ЭДТА, полученный гомогенат инкубировали на льду в течение 10 мин и центрифугировали (30 мин, 150000 g). Далее следовала процедура отмывания мембран от мочевины, которая включала суспендирование осадка, полученного на предыдущей стадии, в гомогенизаторе Поттера в 20-кратном объеме буфера А и центрифугирование (30 мин, 150000 g); процедуру отмывания мембран повторяли 3 раза. Отмытые от мочевины мембраны ре-суспендировали в буфере А, разделяли на аликвоты и хранили при 20 С. 5. Получение поликлональных моноспецифических антител про тив аннексина А4 из печени быка, Антитела получали путем иммунизации кролика по стандартной методике [180].
Иммунную сыворотку животного затем подвергали хроматографии на колонке с иммобилизованным аннексином А4, очищенным из печени быка (концентрации белков и условия эксперимента были теми же, что и при получении антител против транске-толазы [180]), Полученные таким образом поликлональные (моноспецифические) антитела концентрировали центрифугированием на нит-роцеллюлозных мембранах (2500 g, 40 мин) и хранили при -20. 6. Получение фракции белков НСП, способных Са -зависимым образом взаимодействовать с иммобилизованным аннексином А4. Иммобилизацию аннексина А4 на BrCN-активированной агаро-зе проводили по методу, описанному в работе [180]. Полученный таким образом носитель помещали в колонку и уравновешивали буфером Г (Трис-HCl, рН 7,5), содержащим 2 мМ СаСЬ- Экстракт НСП, полученный, как описано ранее (см. раздел 2, "Материалы и методы"), диализовали против буфера Г, содержащего 2 мМ СаСЬ, и наносили на колонку. Далее колонку промывали тем же буфером, затем буфером Г, содержащим 2 мМ СаСЬ и 300 мМ NaCl, снова буфером Г, содержащим 2 мМ СаС12, после чего элюировали белки, связавшиеся с носителем, с помощью буфера Г, содержащего 2 мМ ЭГТА. Полученную белковую фракцию концентрировали упариванием на приборе SpeedVac (Savant) и анализировали методом SDS-электрофореза. 7. Определение концентрации белков. Для определения концентрации родопсина в составе фоторецептори ых мембран препараты мембран растворяли в 1 мл 1 %-ного гек-садецилтримети л аммония и определяли оптическую плотность полученного раствора при Х=500 нМ до и после обесцвечивания образцов; коэффициент молярной экстинкции раствора родопсина принимали равным 42000 [179]. Концентрацию аннексина А4 определяли спек-трофотометрически по методу Брэдфорд [181], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин. 8. SDS-электрофорез в пол и акрил амид ном геле. Электрофорез в ПААГ в присутствии SDS проводили по методу Лэммли [182] при концентрациях разделяющего и концентрирующего гелей 12,5 % и 4 %, соответственно. В качестве стандартов молекулярных масс использовали набор белков, включающий фосфорилазу b (97 кДа), бычий сывороточный альбумин (65 кДа), овальбумин (43 кДа), карбоангидразу (31 кДа), ингибитор трипсина из соевых бобов (21 кДа) и а-лактальбумин (14 кДа). Белки в электрофоретическом геле окрашивали Куммаси синим в присутствии 10 %-ной уксусной кислоты и 20 %-ного этанола или нитратом серебра в присутствии 2}5%-ного раствора N&2CO3, содержащего 0,02%-ный формальдегид [183]. 9. Иммуноблоттинг. Иммуноблоттинг проводили в соответствии со стандартной методикой [184] с некоторыми модификациями. Пробы подвергали SDS-электрофорезу по методу Лэммли при концентрациях разделяющего и концентрирующего гелей, равных соответственно 12 и 5%. По завершении электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны в буфере Tris-глицин, рН 8,3, содержащем 20 %-ный С2Н5ОН, при 300 мА в течение 1 ч. Мембраны инкубировали в 20 мМ Tris-HCI-буфере, рН 7,5, содержащем 300 мМ NaCl и 0,1%-ный твин-20 (буфер Д), с добавлением 10 % сухого молока в течение 1,5 ч, а затем - в растворе первичных антител против аннексина А4 (разведения показаны в подписи к рис. 15) в буфере Д в течение ночи. Далее мембраны трижды отмывали буфером Д, инкубировали их в течение 1,5 ч в присутствии вторичных антител против иммуноглобулинов кролика, конъго-гированных с пероксидазой хрена в разведении 1:1000 в буфере Д, вновь трижды отмывали мембраны буфером Д и инкубировали их в 0,5 М Tris-HCl-буфере, рН 7,2, содержащем 0,1 %-ную Н202 и 0,2 %-ный 3,3 -диаминобензидин до появления окраски.
Выделение и очистка фоторецепторного белка с кажущейся молекулярной массой 32 кДа (р32)
При разработке метода выделения р32 из НСП мы исходили из предположения, что этот белок может принадлежать к семейству аннексинов. Из литературы известно, что для выделения аннексинов обычно используются два основных метода. Первый метод основыва-ется на способности некоторых аннексинов в присутствии Са связываться с гликозаминогликанами, например, с гепарином. Иногда Са2+-зависимая хроматография на гепаринсефарозе приводит к получению индивидуальных аннексинов [145]. В соответствии со вторым методом гомогенные препараты этих белков получают с помощью ионообменной хроматографии. Для этого используются анионообменные колонки [178], так как изоэлектрические точки большинства аннексинов меньше или равны семи. Са -зависимая хроматография фракции фоторецепторных "Са2+-зависимых белков" на гепаринсефарозе не позволила нам получить р32 в гомогенном виде: элюат содержал р32, а также еще несколько белков с кажущимися молекулярными массами 35 и 60-70 кДа. Поэтому для очистки р32 мы использовали альтернативный метод - жидкостную хроматографию FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography) на анионообменной колонке MonoQ, — который оказался более эффективным. Исходным материалом для дальнейшей очистки р32 с помощью этого метода служила фракция фоторецепторных "Са -зависимых белков1 , полученная путем экстракции ЭГТА-содержащим буфером фоторецепторных мембран, которые до этого были отмыты буфером, содержащим ионы кальция (см. рис. 10, дорожка 7). Фракцию фоторецепторных "Са2+ -зависимых белков" наносили на колонку MonoQ и проводили элюцию линейным градиентом 0- 1 М NaCl в Hepes-буфере, рН 7,5. Основная доля р32 была найдена во фракциях, элюи-руемых с колонки при концентрации соли 195-200 мМ (рис. 11Б), Полученный препарат р32 был гомогенен по данным SDS-электрофореза в ПААГ (рис. 11А, дорожка 4); выход белка составил 100 мкг при вы- делении из 1000 сетчаток. Таким образом, предложенный нами метод очистки р32 из наружных сегментов фоторецепторных клеток позволил получить гомогенный препарат этого белка с использованием двух стадий: Са2+-зависимой экстракции фоторецепторных мембран и последующей анионообменной хроматографии на колонке MonoQ. 1.3. Доказательство способности гомогенного р32 взаимодействовать с фоторецепториыми мембранами Са2 -зависимым образом.
Как было показано выше, р32 в составе исходного экстракта НСП способен взаимодействовать с фоторецепторными мембранами Са2+-зависимым образом. Однако нельзя было исключить, что р32 сам по себе чувствительностью к ионам кальция не обладает, а это его свойство на самом деле обусловлено присутствием в его препарате растворимого Са -связывающего белка, который и придает р32 способность связываться с мембранами Са2+-зависимым образом. Поэтому далее мы провели эксперимент, целью которого являлся ответ на вопрос, действительно ли р32 способен связываться с мембранами НСП Са2+-зависимым образом в отсутствие других растворимых фоторецепторных белков. В эксперименте использовали фоторецепторные мембраны, которые были предварительно отмыты 5 М раствором мочевины, а затем трижды - гипотоническим буфером, что позволило получить мембраны, свободные от растворимых белков. Отмытые мембраны инкубировали далее в присутствии гомогенного препарата р32 в пробах, одна из которых содержала 2 мМ СаСЬ (проба "+Са2+"), а другая - 2 мМ ЭГТА (проба -Са2+"). По завершении инкубации пробы центрифугировали и полученные супернатанты анализировали методом SDS-электрофореза в ПААГ. Далее мы провели идентификацию р32 с помощью метода MALDIOF-масс-спектрометрии (Matrix-Assistant Laser Desorpion/Ionisation Time-Of-FHght mass-spectrometry). Этот метод позволяет определять значения отношений масса/заряд пептидов, полученных в результате ферментативного гидролиза исследуемого белка, и затем идентифицировать его путем сравнения экспериментально измеренных отношений масса/заряд с теоретически рассчитанными значениями для пептидов всех известных белков, имеющихся в соответствующих базах данных. Перед проведением масс-спектрометрического анализа очищенный препарат р32 подвергали SDS-электрофорезу, фрагмент геля, содержащий полосу р32, вырезали и белок в геле подвергали гидролизу трипсином. Далее полученные фрагменты р32 элюировали из геля и анализировали методом масс-спектрометрии (рис. 13А). В результате удалось идентифицировать значения отношения массы/заряд для четырнадцати пептидных фрагментов р32 (рис. 13Б). Сравнение экспериментально полученных данных с наборами рассчитанных значений отношения масса/заряд, имеющимися в базе данных SWISS-PROT TrEMBL по первичным структурам всех известных белков быка, осуществляли с помощью программы Peptldent (сайт www.expasy.ch). Проведенное сравнение показало, что полученные фрагменты р32 соответствуют фрагментам аннексина А4 (аннексии IV, эндонексин I) (рис. 13В), Следовательно, можно заключить, что выделенный нами белок р32 является аннексином А4. Следует подчеркнуть, что хотя ранее аннексии А4 был обнаружен в целом ряде тканей позвоночных животных (см. раздел 2.2), данные о присутствии этого белка в сетчатке отсутствовали. Таким образом, полученные нами результаты являются не только первой демонстрацией присутствия аннексина А4 в фоторецепторных клетках быка, но и первой демонстрацией присутствия этого аннексина в сетчатке позвоночных животных.
Обнаружение Са -связывающего белка аннексина А4 в НСП быка само по себе является важным результатом, так как именно Са2+-связывающие белки осуществляют регуляцию передачи зрительного сигнала в фоторецепторной клетке. Однако для того, чтобы можно было начать исследование роли аннексина А4 в фототранедукции, прежде всего необходимо доказать локализацию этого белка в наружных сегментах фоторецепторных клеток. 1.5. Изучение локализации аннексина А4 в сетчатке быка. Для доказательства того, что аннексии А4 присутствует именно в НСП, требовалось провести цитоиммуногистохимическое исследование локализации этого белка в сетчатке. Для этого, прежде всего, было необходимо получить антитела против аннексина А4. Однако тех количеств аннексина А4, которые могли быть получены при выделении этого белка из НСП, было недостаточно для иммунизации животных. Поскольку по литературным данным молекулы аннексина А4, полученного из разных тканей быка имеют идентичную структуру, для иммунизации животных (кроликов) мы выделили аннексии А4 из апьтерантивного источника - печени быка, содержащей наибольшее количество этого белка по сравнению с другими тканями. Препарат аннексина А4 из печени был использован нами для получения поли-клональных (моноспецифических) антител против него путем иммунизации животных (кроликов). Далее антитела очищали из иммунной сыворотки кролика с помощью аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованным аннексином А4 и использовали для цитоимму-ногистохимического исследования локализации аннексина А4 в сетчатке быка. Выделение аннексина А4 из печени быка проводили с помощью процедуры, в основу которой был положен метод, описанный ранее [178]. Метод был модифицирован, так как, по нашим данным, он не давал степени очистки, необходимой для получения антител против аннексина А4. На рис. 14 показаны электрофореграммы фракций, полученных на различных стадиях выделения аннексина А4 из печени в соответствии с исходным методом [178]: 1 стадия - Са -зависимая экстракция клеток печени (дорожка 1), 2 стадия - хроматография на фенилсефарозе (дорожка 2), 3 стадия - хроматография на MonoQ-колонке (дорожка 3). Как видно из рисунка, полученный таким образом препарат аннексина А4 не является гомогенным и содержит примесь белков с кажущимися молекулярными массами в области 35 кДа. Для получения гомогенного препарата аннексина А4 мы ввели дополнительную стадию очистки, а именно, Са +-зависимук хроматографию на гепаринсефарозе [145]. В результате нами был получен гомогенный препарат аннексина А4 (рис. 14, дорожка 4) с общим выходом 1 мг белка из 300 г печени. Гомогенный препарат аннексина А4, выделенный из печени быка, использовали далее для иммунизации животных. Полученную имунную сыворотку подвергали афинной хроматографии на колонке с иммобилизованным аннексином А4, что дало возможность выделить поликлональные (моноспецифические) антитела против аннексина А4.
