Содержание к диссертации
Введение
CLASS 1 Обзор литературы CLASS 9
1.1 Органотипическая культура 9
1.2 Реагрегированная культура 17
1.3 Культура диссоциированных клеток 19
1.4 Поведение нейронов в диссоциированных культурах 28
1.4.1 Рост и регенерация нервных отростков 28
1.4.2 Сокращение нервных отростков 34
CLASS 2 Материалы и методы исследования 4 CLASS 4
2.1 Объект исследования 44
2.2 Методика исследования ; 47
2.2.1 Методика выделения одиночных нейронов прудовика для острых опытов 47
2.2.2 Методика выделения одиночных нейронов прудовика для длительного культивирования 49
2.2.3 Описание установки 54
2.2.4 Обработка изображений 55
3 Собственные данные 58
3.1 Поведение травмированных нейронов после диссоциации ганглия 58
3.1.1 Линейное сокращение отростков травмированных нейронов 58
3.1.2 Изометрическое сокращение отростков 67
3.1.3 Первые признаки регенерации 71
3.1.4 Сокращение изолированного нервного волокна 76
3.1.5 Ингибирование сократительной активности нейрона 82
3.2 Регенерация нервных отростков в культуре ткани 89
3.2.1 Поведение конуса роста и ламеллы роста 89
3.2.2 Общая характеристика роста нервных отростков 106
3.2.3 Типы нервных отростков и способы их образования 114
3.3 Сократительная активность нейритов в культуре ткани 126
3.3.1 Ретракция отростка с изменением его длины 126
3.3.2 Ретракция без изменения длины отростка (изометрическое сокращение) 133
3.3.3 Аутотомия и аутоампутация 139
3.4 Морфогенетические процессы в культуре 144
3.4.1 Образование ганглиев 144
3.4.2 Образование локальных и сложных сплетений и их распад 159
3.5 Формирование синцитиальной связи в культуре ткани 177
4 Обсуждение результатов 191
5 Выводы 204
6 Список литературы 206
- Органотипическая культура
- Культура диссоциированных клеток
- Методика выделения одиночных нейронов прудовика для острых опытов
- Поведение травмированных нейронов после диссоциации ганглия
Введение к работе
Актуальность проблемы. Сближение и воссоединение
физиологических и морфологических исследований всегда являлось
актуальной проблемой нейробиологии. Наиболее современным и
распространенным методом клеточной морфо-физиологии является
культура диссоциированных нейронов (Spenser et al., 1998; Chuckowree,
Vickers, 2003; Tanaka et al., 2006; Jeon et al., 2007). Этот метод позволяет
совместить микроэлектродные электрофизиологические и
микроскопические исследования. Оказалось, что в культуре нейронов с помощью микроскопии можно выявить и ряд новых неэлектрических функций нейронов (Сотников, 2001).
Только с помощью прижизненных исследований нейронов можно уточнить или опровергнуть представления о многих процессах, сформулированных на основании фиксированных «мертвых» препаратов нейрогистологами в прошлом. Актуальность проблемы исследования поведения живых нейронов состоит также в том, что это единственный способ дополнить существующее представление о структуре нейрона данными о его структурной кинетике: регенерационной возможности конусов роста (Baker et al., 2003; Gordon-Weeks; 2004), ретрактильных потенциях нейритов, эффектах многочисленных факторов роста и различных фармакологических веществ (Калюнов, 1986; Yar et al.,1993; Spenser et al., 1995; Ahmed et al., 1997; Spenser et al, 1998).
Необычность состояния культуральных исследований в настоящее время состоит в том, что при больших потенциальных возможностях метода культивирования нейронов, при глубоких современных цитохимических знаниях о создаваемых системах нейронов, в неврологии отсутствует сколько-нибудь полное представление о структурной
5 кинетике поведения живых нейронов в диссоциированных культурах. Несмотря на многочисленные и глубокие исследования молекулярной биологии в культуре ткани, электрофизиологических особенностей связей между нейронами, биохимических процессов, протекающих в нейрональных моделях (Magoski, Bulloch, 1998; Kabir et al., 2001; Widmer et al., 2005; Vana, Weiss, 2006), остаются малоизученными структурные процессы, происходящие с нейронами, механизмы морфогенетических процессов. Оказывается мало исследованной кинетика морфологических изменений самих нейронов, поведение нейронов после их травмы, адаптационный период травмированных нейронов, начало регенераторных процессов, механизмы регенерации, различные формы сократительной активности отростков, механизмы формирования нервных отростков и полярности тела клетки, закономерности формирования ганглиев, локальных и сложных сплетений, механизмы их распада, а также возможности формирования межнейрональных связей, включая синцитиальную связь. Несомненно, знание структурных деталей поведения живых нейронов в различных неадекватных условиях имеет прямое отношение к раскрытию патологических механизмов (Luo, O'Leary, 2005). Этим весьма актуальным вопросам и будет посвящена настоящая диссертация.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось последовательное изучение поведения нервных клеток непосредственно после их выделения из мозга и при культивировании in vitro. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить поведение травмированных нейронов после диссоциации
ганглия.
2. Исследовать сократительную активность нейритов в культуре
ткани.
Проанализировать экструзионные и морфогенетические процессы в культуре.
Изучить формирование синцитиальной связи между нейритами в культуре ткани.
Научная новизна. Проведенные экспериментальные наблюдения за поведением нейронов в культуре ткани свидетельствуют о наличии у нейрона важной неэлектрической функции - сократительной активности. Обнаружено, что ретракция является составной частью регенераторного процесса, а терминальные структуры - конусы роста и колбы ретракции могут служить индикаторами соответствующих процессов не только на живых, но и на фиксированных препаратах. Исследование изолированных нервных волокон демонстрирует автономность этого процесса, его относительную независимость от сомы нейрона. Нам впервые удалось выделить необычную, неизвестную для нейронов форму ретрактильной активности. Помимо обычного линейного сокращения описан новый вид ретракции - изометрическое сокращение, которое характеризуется резким уменьшением объема волокна при сохранении его длины и напоминает ретроградный ток нейроплазмы. Описаны процессы аутотомии сокращающихся нервных отростков и аутоампутации терминалей, механизм которой напоминает апокриновую секрецию нейросекреторных клеток. Высказано предположение о том, что ампутация дегенерирующих терминалей представляет собой микроинъекции нейронального трофического материала в окружающие ткани.
С помощью цейтраферной видеосъемки удалось
продемонстрировать механизм формирования ганглия, его строгой цитоархитектоники путем сокращения отростков контактирующих нейронов и сближения их тел, при котором их контакты и ретрагирующие отростки закономерно оказываются в центре узла, а тела нейронов снаружи.
Впервые удалось показать с помощью культуры ткани, что регенерация нейрона всегда начинается с формирования ламеллы у края его сомы, а не с непосредственного образования нейритов. Ламелла либо сразу превращается в цилиндрический отросток с конусом роста, либо сохраняется и растет длительное время. Представлено подробное описание строения и динамики ламеллярных структур, идентичность с конусами роста и их взаимные переходы. Продемонстрировано, что миграция нейрона осуществляется с помощью перемещения ядра с околоядерной цитоплазмой внутри собственного отростка, при этом обнаруживается новый способ формирования отростка, называемого нами шлейфным.
Впервые была обнаружена способность к слиянию ветвей нейритов между собой. Разработаны 2 критерия, позволяющие на живых нейронах в культуре ткани доказать наличие синцитиальной цитоплазматической связи между отростками разных нейронов. Сформулирована гипотеза о возможности образования межнейрональной синцитиальной связи у нейронов, лишенных глии, и в естественных условиях in vivo.
Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы состояла в том, чтобы дополнить известные статические представления о строении нейрона материалом о структурной кинетике живых нейронов, их отростков и окончаний, продемонстрировать, что кроме электрогенеза у нейрона существуют другие неэлектрические функции, показать, что с помощью регенерации, ретракции отростков, их аутотомии и миграции сомы нейрона нервные клетки способны к самосборке сложных нейрональных систем.
Практическое значение работы состоит в том, что полученные данные могут представить собой принципиально новое дополнение к курсу нейрофизиологии и нейрогистологии нейрона. Полученные данные о сократительной активности нейритов могут учитываться в
8 практической нейрохирургии при травме нервов и проводящих путей, когда, по нашему мнению, целесообразно не только ускорение регенерации с помощью стимуляторов роста, но и предотвращение или ингибирование посттравматической ретракции нейритов. Предложенные нами индикаторы процессов регенерации и ретракции нейритов могут быть использованы для исследования этих процессов в патологических и экспериментальных условиях на статичных гистологических препаратах.
Апробация материалов диссертации. Результаты работы были представлены на научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины -2002» (Санкт-Петербург, 2002); на V Российской медико-биологической научная конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 2002); на IVh V Международных Конференциях «Колосовские чтения» (Санкт-Петербург, 2002, 2006); на научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии, гистогенез и регенерация тканей» (Санкт-Петербург, 2004); на Международной научной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на севере» (Сургут, 2004); на Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 2005); на IV Всероссийской конференции, посвященной 80-летию Института физиологии им. И.П.Павлова (Санкт-Петербург, 2005); на конференции «Бабухинские чтения в Орле» (Орел, 2005); на V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005); на Первом международном междисциплинарном конгрессе "Достижения нейронауки для современной медицины и психологии" (Судак, 2005); на Международной конференции "Biology Motility", (Пущино, 2006); на XX съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (Москва, 2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 научных работ, из них 5 статей в журналах из списка ВАК.
Органотипическая культура
Как известно, поведение живых нейронов может быть полноценно исследовано только в культуре ткани. В настоящее время используются три типа культур: органотипическая, реагрегированная и культура диссоциированных клеток. Еще в 1939 году В. Libet и R.W. Gerar продемонстрировали потенциальные возможности органотипической культуры. В своих электрофизиологических экспериментах эти авторы использовали небольшие полностью изолированные кусочки мозга взрослой лягушки, которые в течение нескольких часов после изоляции генерировали ЭЭГ-подобную активность. G. Levi и Н. Meyer в 1938г показали, что у многих клеток в культивировавшихся эксплантатах спинального ганглия курицы развивались сложно разветвленные нейриты.
При изучении ультраструктуры культивируемой нервной ткани (нейроны, синапсы, миелиновые оболочки) в электронномикроскопических (Bunge et al., 1965) и в электрофизиологических исследованиях спинальных эксплантатов (Crain, Peterson, 1964) авторы показали, что она практически идентична наблюдаемой в развивающемся спинном мозге in vivo. Нейроны в таких культурах обладают выраженной биоэлектрической активностью, которая усложняется по мере созревания культур. Потенциалы действия были зарегистрированы внутриклеточно в долгоживущих эксплантатах симпатических ганглиев взрослой лягушки-быка (Padjen et al., 1975).
Разработка методов длительного органотипического культивирования нервной ткани позволила углубить и расширить исследования развития ткани мозга in vitro. Культура ткани исследовалась с помощью различных гистологических методик и с помощью различных методов микроскопии. В органотипической культуре изучалась морфология нейронов и межнейронных связей различных структур мозга с помощью классических методов импрегнации солями серебра (Wolf, 1964; Сванидзе, 1976), суправитального окрашивания метиленовым синим (Чубаков, Саркисова, 1986), помощью электронной микроскопии (Bunge, Bunge, 1965, Скобо, Коваль, 1992), а также при внутри- и внеклеточном ионофоретическом введении пероксидазы хрена (Hendelman, Marshall, 1980). С помощью микроинъекций пероксидазы хрена изучали аксональныи и дендритный транспорт в клетках Пуркинье культивируемых срезов мозжечка (Krah, Meller, 1999). Внутриклеточные инъекции флуоресцентных красителей позволили четко идентифицировать тела отдельных нейронов со всеми их отростками в культурах ткани гиппокампа (Gahwiler, 1984а), мозжечка (Gahwiler, 19846). Для прижизненных исследований культуры ткани использовались микроскопия в светлом поле, темнопольная микроскопия, поляризационная, ультрафиолетовая флуоресцентная. Ведущее место в современных прижизненных исследованиях занимает фазово-контрастная микроскопия (Чубаков, Сотников, 1982). Она с успехом применяется для наблюдения зоны роста и связей крупных органных эксплантатов.
С помощью методики органотипической культуры E.R. Peterson и др. (1962) культивировали эксплантаты спинного мозга мышей и крыс (15-19-дневных эмбрионов) в течение 3 месяцев и получили с помощью световой микроскопии данные о нормальном развитии тел крупных моторных нейронов передних рогов и об активной миелинизации их аксонов. Таким образом, была установлена способность большей части нейронов выживать и дифференцироваться в условиях органотипической культуры. E.R. Peterson и др. (1965) провели длительное морфологическое исследование развития нейронов в культурах спинного мозга 6-7-дневных куриных эмбрионов, 11-20-дневных крысиных эмбрионов и 6-недельных плодов человека. Изучение строения крупных мультиполярных нейронов позволило идентифицировать их с двигательными нейронами мозга и показало сходство строения этих клеток in vitro и in vivo. В культурах срезов переднего мозга плодов мышей и крыс изучали распределение тел и рост отростков базальных холинергических нейронов. Распространение отростков зависело от возраста культуры. Этот процесс имитировал нормальное развитие данных нейронов в областях коры мозга (Tsai et al., 2002). В органотипических культурах показано, что важную регуляторную роль в процессе роста нейритов чувствительных нейронов играет Na+, К+-АТФаза (Пеннияйнен и др., 2003).
В тонкослойной культуре мозжечка 8-дневных крыс изучали действие агонистов протеинкиназы С на морфогенез дендритов клеток Пуркинье. Под влиянием агонистов площадь арборизации дендритов сокращалась на 32%, а при воздействии ингибитора протеинкиназы С площадь арборизации увеличивалась на 158% (Metzger et al., 2000). При стимуляции импульсным магнитным полем культивируемых спинальных ганглиев эмбрионов крыс был выявлен асимметричный и усиленный рост нейритов параллельно направлению тока. У неэкспонированных ганглиев наблюдался характерный радиальный вырост нейритов (Macias et al., 2000).
В модели органотипической культуры ткани удалось воспроизвести миелинизацию нервных волокон, синаптические связи, тканевые рецепторы, а также связи между ядрами ЦНС. E.R. Peterson (1950) продемонстрировала формирование миелиновых оболочек в долгосрочной культуре ганглионарных клеток. М.В. Bornstein, M.R. Murray (1958) в культурах мозжечка новорожденных животных показали, что процесс миелинизации начинается на 10-20 день культивирования. Сроки начала миелинизации зависят от эмбрионального возраста и типа ткани.
Культура диссоциированных клеток
Стремление к изоляции одиночных нейронов нейрогистология испытывала всегда, так как при этом появляются идеальные условия для микроскопии клетки. Изучение диссоциированных клеток нервной системы занимает важное место в нейробиологических исследованиях, так как изолированные и развивающиеся in vitro нервные и глиальные клетки можно считать хорошей экспериментальной моделью для решения проблем и приложения методов морфологии, физиологии, молекулярной биологии, гистохимии, иммуноцитохимии, нейрофармакологии, нейроцитотоксикологии и генетики. Культура диссоциированных клеток дает уникальную возможность для микроскопического прижизненного наблюдения за поведением отдельных нейронов и их структурных элементов в процессе роста и ретракции, при патологических экспериментальных воздействиях и даже позволяет моделировать простые нервные системы (Сотников, 1999).
Впервые возможность диссоциации живой ткани, то есть разделение ее на изолированные клеточные элементы показали P. Rous и F.S. Johnes в 1916 году. A.A. Moscona (1952) разработал методику энзиматической диссоциации эмбриональных тканей в среде, не содержащей двухвалентных ионов кальция и магния. Эта методика широко применяется для получения монослойных культур диссоциированных клеток самых различных тканей. Метод диссоциации нейронов мозга взрослого моллюска предложила М.А. Костенко (Костенко, 1972; Костенко, Вепринцев, 1972).
Все существующие методы дезагрегации нервной ткани для последующего культивирования изолированных клеток можно разделить на две группы. Первая группа представляет собой механическое выделение отдельных клеток (микропрепаровка ткани, пипетирование -многократное продавливание через тонкую пипетку или через нейлоновые сита с отверстиями определенной величины) (Hyden, 1964, Varon, Rainborn, 1969; Dichter, 1978). Вторая группа методик диссоциации - это разрушение межклеточных соединений с помощью протеолитических ферментов (Moscona, 1952; Greenham et al., 1974; Костенко и др., 1998). Такое разделение методов диссоциации ткани условно, так как в ряде случаев имеет место сочетание обоих указанных факторов - физического и химического (Аркатов и др., 1983; Ghirardi et al., 1996; Chuckowree, Vickers, 2003). Изучение динамики структур в культуре ткани обычно проводится с помощью цейтраферной видеосъемки. В последнее время этот метод получил значительное распространение в связи с расширяющимися исследованиями структурной кинетики живых нейронов в культуре ткани (Segal, Andersen, 2000; Hayashi et al., 2002; de-Miguel, Vargas, 2002; Tanaka et al., 2006).
Было показано, что в монослойных диссоциированных культурах клеток спинного мозга развиваются зрелые мультиполярные нейроны, происходит формирование миелиновых оболочек растущих аксонов (Bird, James, 1975). Образование связей между нейронами сопровождается активным синаптогенезом. Эти данные были подтверждены в ультраструктурных и электрофизиологических исследованиях диссоциированных культур разных отделов ЦНС эмбрионов и новорожденных животных (Peacock, 1979; Van Huizen et al., 1985). Нейроны краниального шейного ганглия раннего постнатального периода в диссоциированной культуре проходят ряд определенных этапов в своем развитии: подготовка клетки к началу роста отростков, обеспечение активного роста нейритов, установление межклеточных контактов, окончательная дифференцировка нейронов и стабилизация структурно-функциональных отношений в культуре (Аркатов и др., 1983). С помощью диссоциированных культур подробно исследовалась морфологическая лабильность шипиков (Van Rossum, Hanisch, 1999; Spire, 2000) и изменение шипиков при их активации (Yuste et al., 2000).
При исследовании культур нейронов гиппокампа описан новый тип экзоцитоза «целуй и беги» синаптических пузырьков, при котором медиатор выделяется из пузырька не путем полного экзоцитоза, а через «пору слияния», а затем используется повторно, то есть это новый способ рециклинга пузырька (Stevens, Williams, 2000). В такой же культуре исследовалась кратковременная пластичность и кинетика слияния пор при экзоцитозе синаптических везикул (Ting et al., 2006). В подобных условиях продемонстрировано участие в эффекте обучения не только постсинапсов, но и пресинапсов за счет активации повторного использования мест выделения медиатора (их конверсией) и образования новых мест (Ninan et al., 2006).
В культуре ткани удается моделировать отдельные идентифицированные фрагменты нервной системы (Spenser et al. 1995). N.I. Syed и др. (1990) реконструировали фрагменты дыхательной рефлекторной дуги, состоящей из 3 идентифицированных нейронов моллюска. Даже в сравнительно простых нервных системах часто трудно изучать индивидуальные синаптические соединения в деталях и исключить участие неидентифицированных нейронов. Эти ограничения были преодолены реконструкцией частичных цепей идентифицированных нейронов в клеточной культуре (Bulloch, Syed, 1992). Этот подход обеспечивает возможность изучать функции малых нейронных сетей способом недоступным в интактной нервной системе. В других работах созданы системы из двух и более идентифицированных нейронов медицинской пиявки (Fuchs et al., 1982; Ackin, Nicholls, 1990) или моллюска (Панчин и др., 1997; Kelmanson, Panchin, 1997). На созданных парах клеток Ретциуса и сенсорных Р-клетках пиявки электронномикроскопически показано формирование серотонинергических синапсов (Bruns et al., 1997).
Культура диссоциированных нейронов значительно расширила возможности физиологических исследований на одиночных идентифицированных нейронах, так как она является удобной моделью для изучения микроэлектродных электрофизиологических свойств мозга. Эксперименты свидетельствуют о принципиальной идентичности электрофизиологических процессов, наблюдаемых в культуре и в интактном мозге (Spenser et al., 1995; Magoski, Bulloch, 1998). Специальные сопоставления мембранных потенциалов и ответов в клетках изолированного ганглия и диссоциированных нейронов в культуре продемонстрировали их сходство (Гелетюк, Вепринцев, 1972; Костенко и др., 1998).
Методика выделения одиночных нейронов прудовика для острых опытов
Извлеченный мозг прудовика после ферментативной обработки разрезали на ганглии (методика подробно описана выше). Под бинокулярной лупой препаровальными иглами снимали с них соединительнотканную капсулу. Затем ганглии помещали на часовое стекло в небольшом количестве раствора Рингера и проводили пипетирование с помощью Г-образной стеклянной микропипетки вначале с диаметром отверстия кончика 0,8 мм, а затем 0,6 мм (рис. 5). Таким образом, нервные клетки выделялись из ганглиев. Уникальность этого метода заключается в том, что при сохранении нейронов погибают глиальные и другие клетки ганглия. По нашему мнению, это связано с тем, во-первых, ненервные клетки находятся снаружи нейронов и поэтому первыми вступают в контакт с протеазами. Во-вторых, они имеют ламеллярную и, следовательно, большую повреждаемую поверхность, но относительно малый объем (коэффициент S/V), что соответствует низкой термодинамической их устойчивости. При уменьшении концентрации проназы или времени ее действия в массе выделенных клеток можно встретить погибающие многоотросчатые глиальные клетки, отростки которых со временем сокращаются (рис. б; 1).
Выделенную таким способом суспензию нервных клеток и погибших глиальных клеток много раз промывали раствором Рингера для моллюсков. Для этого вращением часового стекла нервные клетки (рис. 7) собирали в центре. При этом погибшие глиоциты и соединительная ткань оказывались на периферии и на поверхности, их тщательно удаляли с помощью такой же микропипетки. Недостаточное промывание суспензии при добавлении питательной среды приводит к агрегации и адгезии нервных клеток. Диссоциировать агрегат в дальнейшем представляется очень сложным.
Последнее промывание проводили стерильным раствором питательной среды. В результате пипетирования удавалось получить значительное количество изолированных лишенных глии нейронов. Нейроны моллюсков Lymnaea stagnalis удобны тем, что их можно высаживать на стекло без специальных подложек (Костенко, 1985). Клетки хорошо адгезируются на стекле, без чего невозможна регенерация отростков. Наиболее удобная концентрация нейронов в культуре получается при использовании ганглиев 7-10 моллюсков и распределении клеток в 4 камеры.
Для культивирования нейронов использовали микрокамеры двух видов (рис. 8). Модифицированный сосуд Кареля (рис. 8, а) (Костенко и др., 1998) представляет собой камеру объемом 4 мл с двумя круглыми отверстиями на верхней и нижней стенке. Для сохранения стерильности отверстия закрывали покровными стеклами и запаивали смесью парафина и вазелина (3:1). Клетки высевали на нижнее покровное стекло, что позволяло производить микроскопирование с помощью инвертированного микроскопа при большом увеличении и хорошем фазовом контрасте. Другой вид камеры представляет собой стеклянные кольца высотой 0,8 см и диаметром 0,8 см, прикрепленные смесью парафина и вазелина (3:1) к покровному стеклу (рис. 8, б). Характер роста культуры от типа камеры не зависел.
Для своих исследований мы использовали бессывороточную питательную среду с определенным химическим составом RPM3-1640 или Игла MEM (Sigma) без глютамина и бикарбоната, которые отличаются рядом преимуществ - неизменный химический состав,
отсутствие сывороток, что позволяет добиться постоянства условий эксперимента. Среду непосредственно для культивирования готовили на основе стандартной однократной среды RPM1-1640 путем разведения ее солевым раствором. Для этого к 10 мл однократной среды добавляли 40 мл солевого раствора. Концентрация аминокислот снижалась после разведения в 5 раз. В полученный раствор среды добавляли сухой L-глютамин в концентрации 0,3 г/л. Такой состав среды является оптимальным для успешного культивирования диссоциированных нейронов Lymnaea stagnalis. В среду также добавляли гентамицина сульфат в концентрации 50 мкг/мл. С помощью бикарбоната натрия устанавливали рН среды 7,8. Для этого использовали рН-метр-милливольтметр типа рН-150 ("Измеритель", Гомель). Непосредственно перед посадкой для стерилизации среду фильтровали, пропуская ее через миллипоровые мембраны с диаметром пор 0,22 мкм с помощью шприца. Фильтрованной средой заполняли камеры для культивирования на 2/3 объема. Сверху всегда оставалось воздушное пространство. Для культивирования нейронов Lymnaea stagnalis повышенная концентрация
Поведение травмированных нейронов после диссоциации ганглия
В культуре диссоциированных травмированных нейронов прежде всего обнаруживается сокращение нейритов. Сократительная способность этих нейронов исследовалась сразу после выделения их из ганглия. Такие нейроны нередко имели отростки достаточной длины для наблюдения. Место повреждения нервного отростка может иметь рваную или вытянутую в длину форму, но постепенно (в течение 5-30 минут) концевой отдел округляется и формирует колбовидную структуру, которую мы называем колбой ретракции (рис. 10, а-в; стрелки). Она характеризует начало сократительной активности нейрита. Линейное сокращение отростков наиболее наглядно прослеживается в том случае, когда тело клетки прикреплено к субстрату. Активнее и быстрее сокращаются более тонкие вторичные отростки (рис. 11). Сокращение наблюдается у подавляющего большинства отростков. Сокращающиеся отростки, не связанные с субстратом, нередко извиваются. При этом соприкосновение конца отростка с телом клетки создает картину, напоминающую их слияние (рис. 12). В дальнейшем происходит его полное впячивание.
Сокращение может протекать с разной скоростью и осуществляется в несколько этапов: с замедлениями, остановками и небольшими удлинениями (график 1). Скорость ретракции варьирует в широких пределах от 0.4 мкм/мин до 10 мкм/мин, что соизмеримо со скоростью регенерации - 2мм/сут = 1,39 мкм/мин. Начальная скорость ретракции, как правило, больше конечной в 2-3 раза (конечная от 0.35 мкм/мин до 3.13 мкм/мин).
Обычно ретракция тормозится или даже прекращается при приближении терминального отдела отростка к соме (сравни величину и время укорочения отростка на б-г и д-е рис. 11). Как видно на графике 2 уменьшение размеров отростка определяемого по площади оптического среза структуры в течение 50 мин сопровождается пропорциональным увеличением площади оптического среза сомы клетки.
Следовательно, в это время процесс набухания сомы и отростка отсутствует. Процесс истинного набухания у разных нейронов начинается через различный промежуток времени, когда ретракция отростков практически завершена. Все исследования проведены в этот промежуток времени. У большинства нейронов отростки полностью втягиваются в тело клетки. После ретракции отростков округлившиеся травмированные нейроны могут быстро разрушаться, даже через 2 минуты после втягивания отростка (рис.13). Однако большинство округлившихся нейронов остаются живыми и способны регенерировать отростки заново. Это наблюдение, по-видимому, имеет практическое значение, так как во время травм мозга, как известно, нейроны, утерявшие связь с другими нейронами, обычно удаляются из раны как нежизнеспособные.
У двухотростчатых клеток близко расположенные сокращающиеся отростки также могут соединяться своими концами (возможно, сливаться) (рис. 10, б-г). Если сокращающийся отросток испытывает хотя бы частичную адгезию к субстрату, то при сокращении он выпрямляется (рис. 13). На этом рисунке при сокращении отростка прослеживаются 3 точки адгезии препарата: одна на теле клетки, вторая ближе к дистальной части волокна и третья на его конце. Это обнаруживается только при сокращении отростка. Соответственно вначале выпрямляется участок волокна между третьей и второй точками, а затем - и между второй и первой точками. При этом фрагменты волокон образуют ровные линии. Сокращение отростка происходит по ровным линиям и сопровождается появлением варикозностей и колб ретракции. После преодоления сокращающимся волокном третьей и второй точек прикрепления оно сразу же теряет прямолинейность и приобретает извитую форму (рис. 13, е).
В некоторых случаях конец отростка может быть связан с не диссоциированным до конца нейропилем или группой клеток, тогда у клетки появляется новая точка опоры (punctum fixum). В результате, сокращение отростка приводит к перемещению не конца отростка к телу клетки, а наоборот тела нейрона к концу отростка (рис. 14). При ретракции отростка на нем нередко появляются варикозности. Однако они не являются обязательным элементом ретракции. Скорее всего, их появление зависит от толщины волокна (рис. 13, 14). Сокращение отростка и округление нейрона - это обычная и, видимо, обязательная предрегенерационная стадия поведения травмированной клетки. Она наблюдается и у других типов живых клеток после их травмирования.
Таким образом, на одиночных живых нейронах, выделенных из диссоциированных ганглиев, удается обнаружить и исследовать новую важную неэлектрическую сократительную функцию, детальное исследование которой, по нашему мнению, имеет фундаментальное значение и большой практический интерес.
