Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Поведенческая программа - ключевое понятие этологии 11
1.2. Нейроэтологическии анализ представления о поведении как совокупности моторных программ 12
1.2.1. Центральный генератор 12
1.2.2. Перестройка паттерн-генерирующих сетей 13
1.2.3. Фармакологическая активация моторных программ 14
1.2.4. Иерархия генераторов 17
1.2.5. Координация генераторов 18
1.3. Прудовик Lymnaea stagnalis как модельный объект нейроэтологии 20
1.3.1. Воздушное дыхание 20
1.3.2. Локомоция 24
1.3.3. Защитное втягивание 27
1.3.4. Движения радулы 30
1.3.5. Откладка яиц 32
1.4. Координация моторных программ у Lymnaea 33
1.4.1. Координация буккальной и локомоторной систем 33
1.4.2. Координирующие влияния системы защитного втягивания 34
1.4.3. Координирующие влияния системы откладки яиц 35
1.4.4. Координация дыхания и локомоции у Lymnaea 36
1.5. Сравнительная физиология взаимодействия дыхания и локомоции 38
1.6. Заключение. 40
2. Материалы и методы 42
2.1. Фармакология 42
2.2. Поведенческие эксперименты 42
2.3. Электрофизиологические эксперименты 46
2.4. Обработка данных 49
2.5. Моделирование 50
3. Результаты и обсуждение 52
3.1. Поведение: дыхание в воде и на поверхности 52
3.2. Поведение: мышечная локомоция и дыхание на сухой поверхности 56
3.3. Поведение: инъекция метаболического предшественника серотонина, различные дозы 59
3.4. Моделирование: поиск координирующей связи 64
3.5. Регистрация активности одного из ключевых нейронов дыхательной сети - VD4 - на фоне фармакологически индуцированного дыхательного ритма 69
3.6. Электрофизиология: координация дыхания и локомоции под действием 5-НТР и L-DOPA, анализ распределений 76
3.7. Электрофизиология: координирующие связи, анализ синаптических притоков 90
4. Заключение 97
Выводы 102
Список литературы 103
- Фармакологическая активация моторных программ
- Сравнительная физиология взаимодействия дыхания и локомоции
- Электрофизиологические эксперименты
- Поведение: мышечная локомоция и дыхание на сухой поверхности
Введение к работе
Актуальность исследования
Согласно представлениям современной нейроэтологии, зародившимся в последней трети XX столетия (Hoyle, 1970), ключевую роль в управлении отдельными поведенческими актами, из которых складывается целостное поведение, играют нейронные сети, генерирующие так называемые центральные моторные программы. В нейроэтологической литературе эти ансамбли нейронов обычно называются central pattern generators (CPGs), что можно перевести как «центральные генераторы упорядоченных движений» (Delcomyn, 1980, Arshavsky etal., 1991). Будучи расположены в пределах нервной системы, они часто способны работать автономно при экспериментальном исключении сенсорных влияний. Центральный генератор производит пространственно-временную программу нейронной активности, необходимую для скоординированного управления эффекторами, то есть для выполнения поведенческого акта.
В последнее время первоначальные представления о нейронной структуре и логике работы центральных генераторов подвергаются пересмотру. Множество накопленных примеров пластичности центральных генераторов говорит о том, что они не являются независимыми, жестко фиксированными нейронными сетями (Dickinson, 1995), какими их полагали ранее. Нейроны, осуществляющие генерацию моторной программы в рамках одного генератора, могут участвовать в управлении другими поведенческими паттернами, динамически переключаясь между несколькими нейронными сетями (Weimann, Marder, 1994). Не меньшая способность к динамической перестройке характерна, по-видимому, и для процессов координации между несколькими моторными программами, однако этот вопрос до настоящего времени остается малоизученным. Факторами, отвечающие за реконфигурацию нейронных сетей, во многих рассмотренных в литературе случаях являются эндогенные нейроактивные вещества (нейротрансмиттеры, нейромодуляторы, гормоны), специфически воздействующие на все звенья нейронной сети генератора и способные менять его функциональную схему (Сахаров, 1983,1990ab, Dickinson, 1990).
Многие моторные паттерны, такие как локомоция, жевание и дыхание, обладают ритмической структурой. Значительная часть ритмических моторных программ подразумевает возможность их одновременной реализации, при том что присущие соответствующим центральным генераторам значения длительности цикла могут существенно различаться. Наблюдения за поведением животных свидетельствуют, что выполняемые одновременно моторные программы склонны к синхронизации, причем не обязательно равнопериодической. Наличие координирующих механизмов часто необходимо из-за анатомической несовместимости отдельных фаз моторных программ. Помимо этого, координация ритмических моторных актов приводит к суммарной экономии энергии при синергичной работе мышц.
Системы, осуществляющие взаимодействие моторных программ, являются объектами пристального изучения, накоплено достаточно поведенческих наблюдений координации ритмических моторных программ у различных животных и у человека. Тем не менее, до сих пор отсутствует понимание принципов их взаимодействия на клеточном уровне (Skinner, Mulloney, 1998). Не последним обстоятельством, замедляющим прогресс в этой области, является сложность устройства нервной системы высших животных.
В рамках проблемы координации центральных генераторов особенно малоизученным вопросом является взаимодействие осциллирующих нейронных сетей, генерирующих паттерны с различными периодами и обладающих различной стабильностью цикла. В то же время, кажется очевидным, что взаимодействия между такими нейронными сетями важны для реализации сложного поведения. Представляется, что найденные в простых нервных системах закономерности координации и построения сложного моторного поведения окажутся общими для всех животных.
Настоящая работа является составной частью научных проектов, которые получили высокие оценки при независимом рецензировании и были поддержаны грантами Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ 99-04-48411, 01-04-06308, 02-04-48091, 03-04-06450).
Цели и задачи исследования
Целью настоящего исследования являлось изучение нейрональных механизмов координации ритмических моторных программ пресноводного легочного моллюска - большого прудовика Lymnaea stagnalis (L).
Беспозвоночные животные с их сравнительно простой нервной системой, предоставляющей возможность для идентификации нейронов, являются классическими объектами нейробиологии. Накопленные для нескольких "модельных" беспозвоночных архивы описанных на нейрональном уровне центральных моторных программ образуют хороший задел для изучения координации между ними. Все вышесказанное справедливо для большого прудовика - модельного животного, широко используемого в мировой нейробиологической практике.
В рамках поставленной цели решались следующие задачи:
1. Разработать методику поведенческой регистрации циклической наземной локомоции и легочного дыхания у моллюска Lymnaea.
2. Определить особенности координации между моторными программами на основании поведенческих наблюдений.
3. Исследовать характер перестроек координационных отношений локомоторной и дыхательной программ при изменении нейротрансмиттерного тонуса.
4. Разработать компьютерную модель системы из двух взаимосвязанных генераторов и провести анализ синхронизирующего влияния одного ритма на другой.
5. В экспериментах на редуцированном препарате определить степень соответствия предсказаний, полученных при моделировании, реальным нейрональным механизмам.
6. Описать нейрональные механизмы координации легочного дыхания и локомоции на уровне синаптических притоков к центральным нейронам.
Научная новизна работы
Показано, что у пресноводного моллюска прудовика переход от водной ресничной локомоции к движению по сухой поверхности сопровождается интенсификацией дыхания, что выражается в увеличении средней частоты дыхательных актов. В этом отношении прудовик не представляет исключения из общего для животных правила, согласно которому длительное повышение мышечной нагрузки влечет за собой усиление активности дыхательной системы.
На основании поведенческих данных сделан вывод о том, что генератор наземной мышечной локомоции обладает значительно большей стабильностью периода ритма по сравнению с респираторным. Моторные программы респирации и мышечной локомоции способны проявляться одновременно, то есть не являются взаимоисключающими.
Нами впервые обнаружено, что в нормальном поведении прудовика эти моторные программы координированы. Координация выражается в том, что между дыхательным и локомоторным циклами устанавливаются фазовые соотношения, в предельном случае сводящиеся к равнопериодической синхронизации.
Фазовая координация локомоции и респирации осуществляется на центральном уровне, что показано в опытах на редуцированных препаратах.
При активации серотонинергической или дофаминергической системы метаболическим предшественником соответствующего нейротрансмиттера препараты изолированной ЦНС и полуинтактные препараты, включающие мантию и пневмостом, склонны к устойчивой равнопериодической синхронизации, которая редко проявляется в фоновом поведении.
На основе анализа результатов поведенческих экспериментов и компьютерного моделирования предсказано наличие тормозной связи от локомоторного генератора к респираторному.
Установлено, что достаточно одной тормозной связи для устойчивой фазовой координации двух моторных генераторов с различной частотой и стабильностью ритма.
Анализ синаптических притоков на редуцированном препарате подтвердил существование проекции, предсказанной модельными экспериментами. В тех же экспериментах показано, что имеются две трансмиттер-специфические модификации фазовой привязки дыхания к локомоции, способные к динамической перестройке.
Впервые показано, что ритмические сокращения ПН могут возникать при отсутствии спайковой активности двух из трех ключевых нейронов описанного в литературе центрального генератора, что свидетельствует о неадекватности или недостаточности общепринятой схемы сети, ответственной за ритмическое дыхание.
Результаты работы в целом являются первым экспериментально обоснованным свидетельством способности дыхательного генератора к динамическим перестройкам.
Теоретическое значение работы
Впервые на трех методических уровнях - в поведении интактного животного, на редуцированном препарате и при помощи компьютерного моделирования - описан механизм фазовой координации между двумя ритмическими моторными программами.
Практическое значение работы
Исследованная система открывает практическую возможность изучать механизмы, лежащие в основе координации ритмических центральных программ - фундаментального явления, которое поможет приблизиться к пониманию физиологии и патологии мозга человека.
Помимо этого, примененная в работе логика исследования, показавшая адекватность компьютерного моделирования центральных процессов на основании поведенческих наблюдений, расширяет возможности исследования аналогичных явлений на других объектах. В особенности это касается высших животных и человека, обладающих сложной и часто недоступной для клеточного анализа нервной системой.
Положения, выносимые на защиту
1. Координация между ритмическими программами легочного дыхания и циклической наземной локомоции прудовика наблюдается как в нормальном поведении, так и в экспериментах на редуцированном препарате. В обоих случаях между ритмами устанавливается фазовая синхронизация.
2. Описанная координация сохраняется после частичного или полного исключения периферических систем, то есть осуществляется на уровне взаимодействия между генераторами (что не исключает участия сенсорики в адаптации координированных ритмов к условиям функционирования). В качестве механизма координации описана тормозная проекция от локомоторного к дыхательному генератору, активация которой происходит незадолго до окончания локомоторного цикла.
3. Функционирование описанного в литературе центрального генератора дыхательной моторной программы модифицируется в условиях его фармакологической активации.
Апробация диссертации
Материалы диссертации докладывались на VIII Всероссийской школе молодых ученых (Казань, 2001), XVIII съезде физиологического общества им. И. П. Павлова (Казань, 2001), 10-м симпозиуме Международного общества нейробиологии беспозвоночных (ISIN) "Neurobiology of Invertebrates" (Тихань, Венгрия, 2003), на VII Восточно-европейской конференции ISIN "Простые нервные системы" (Калининград-Светлогорск-Отрадное, 2003).
Фармакологическая активация моторных программ
К настоящему времени накоплено достаточно много данных, свидетельствующих об интеграции локальных моторных систем или, реже, целостного поведения организма нейротрансмиттерными веществами, долгое время считавшимися лишь локальными передатчиками сигналов в химических синапсах. В исследованиях на "модельных" беспозвоночных был проделан быстрый путь от реального поведения к нейрофизиологическому анализу так называемого фиктивного поведения, когда изучается влияние медиатора на генерацию моторной программы изолированной нейронной сетью (Marder, Eisen, 1984, Marder, Bucher, 2001). Несколько позже аналогичные явления стали изучаться на мозге позвоночных (Harris-Warrick, Cohen, 1985; Grillner era/., 1987), в том числе млекопитающих. Однако в случае сложных нервных систем тотальное действие нейротрансмиттера чаще приводит не к запуску адекватного целостного поведения, а вызывает так называемые стереотипии, характеризующиеся навязчивым повторением отдельных моторных актов. Ниже рассмотрены несколько примеров трансмиттер-зависимых моторных программ.
Радула и передний отдел пищеварительного тракта водных и наземных брюхоногих моллюсков управляются парными буккальными ганглиями. В изолированном препарате, состоящем из буккальной мускулатуры и этих ганглиев, можно вызвать определенные ритмические мышечные сокращения, которые наблюдаются у целых животных при нормальном питании. Установлено, что дофамин запускает пищевую моторную программу в буккальном аппарате у большого слизня (Wieland, Gelperin, 1983), аквариумной катушки (Trimble, Barker, 1984). и прудовика (McCrohan et al., 1989).
Тотальное воздействие другого нейромедиатора, серотонина, или его метаболического предшественника, 5-гидрокситриптофана (5-НТР), выражается в активации хорошо скоординированной плавательной локомоции у пиявки (Willard, 1981) и моллюска аплизии (Sakharov et al., 1989; Parsons, Pinsker, 1989), охотничьего поведения у хищного моллюска морского ангела (Kabotyanski, Sakharov, 1988), моллюска тритония (McClellan et al., 1994), циклическую мышечную локомоцию у легочных гастропод (Kabotyanski et al., 1992). Помимо активации основной моторной программы, целостное координирующее действие вещества, как правило, проявляется в адекватной подстройке активности сердечной и дыхательной систем (Koester, Koch, 1987).
У саранчи ионофоретическое введение октопамина в разные области нейропиля метаторакальных ганглиев вызывает формирование различных поведенческих программ: принятие определенных поз, защитное отдёргивание конечностей (перешагивание, удары и лягания), маршевое шагание, комплекс дыхательных движений, подпрыгивание или периодические взмахи крыльев (Sombati, Hoyle, 1984).
Прекрасной моделью нейрохимической регуляции моторных программ является стоматогастрическии ганглий декапод. Эта нейронная сеть получает нисходящие и сенсорные модулирующие входы, содержащие нейроактивные вещества различных типов - нейропептиды, биогенные амины и аминокислоты. В зависимости от преобладания либо сочетания тех или иных модулирующих веществ, центральный генератор ритмической моторики способен перестраиваться и генерировать на выходе различные программы (см., например, обзор Marder, Bucher, 2001).
Важно отметить специфический характер эффектов разных медиаторов на центральные поведенческие программы. Иными словами, химическая природа передатчика оказалась фактором, определяющим состояние системы в целом (Сахаров, 1990b). Были также высказаны гипотезы о консервативной функции нейротрансмиттера (Sakharov, 1990), в том числе у далеких в эволюционном отношении животных (Jacobs, Fornal, 1993).
Запуск моторных программ в экспериментах по исследованию трансмиттер-зависимого поведения состоял, как правило, в инъекции нейротрансмиттера целому животному (например, Mackey, Carey, 1983), тотальной аппликации медиатора или его метаболического предшественника на редуцированный препарат, включающий ЦНС или изолированную нейронную сеть (Harris-Warrick, Cohen, 1985; McCrohan etal., 1989), либо блокаде действия нейротрансмиттера (Glover, Kramer, 1982). В естественных условиях функционирования нервной системы, то есть в отсутствие привнесенного извне нейротрансмиттера, выделение последнего производится так называемыми проекционными интернейронами, запускающими ту или иную моторную программу (Clione, Aplysia, Lymnaea). Помимо такой схемы активации, когда источник нейротрансмиттера находится вне центрального генератора, были найдены примеры нейрохимической интеграции активности генератора за счет нейрона, входящего в его состав (Katz, Frost, 1996). Естественно, что помимо активации моторных программ, нейротрансмиттеры участвуют также и в их подавлении, что было показано на примере пищевой моторики гастропод, ингибируемой парой FMRFaMHfl-содержащих нейронов (Alania, Sakharov, 2000). В более общем случае, ненаправленное выделение нейротрансмиттеров, не ограниченное локальным синаптическим эффектом, может лежать в основе координации нескольких моторных программ, то есть в основе высокоуровнего управления целостным поведением организма.
Сравнительная физиология взаимодействия дыхания и локомоции
Координация локомоции и дыхания часто встречается у самых разных животных, в том числе у рыб (Piiper et а/., 1977), млекопитающих (Bramble, Carrier, 1983; Kawahara et a/., 1989; Young et al. 1992) и у человека (Rassler, Kohl, 1996). Дыхательный акт, как правило, привязан к одной и той же фазе локомоторного цикла. Сходным образом, у некоторых птиц вдох синхронизирован с движением крыльев вверх (Butler et al. 1977). Такая координация способна уменьшить совершаемую при дыхании работу двумя способами: (1) за счет уменьшения механических помех со стороны локомоции (поскольку оба типа двигательной активности часто включают движение одних и тех же частей тела, например грудной клетки) и (2) выполняя часть работы по осуществлению дыхания за счет локомоторных движений, то есть перенося на них нагрузку с собственно дыхательной мускулатуры. К примеру, изгибы и растяжения туловища несущейся галопом лошади, действуя наподобие кузнечных мехов, могут полностью заменить работу диафрагмы (Young et al. 1992). Инерционные колебания внутренних органов во время бега у собак могут работать как поршневой механизм, способствующий перемещению воздуха при дыхании (Bramble, Jenkins, 1993; Alexander, 1993).
Гипотеза об уменьшении механических помех дыханию со стороны локомоции кажется разумной, особенно при координации периодов двух ритмов 1:1. Однако у животных часто наблюдаются иные варианты координации, такие как 3:1, например во время полета у птиц (Funk et al., 1993). Хотя механические и энергетические последствия такой координации на первый взгляд неясны, было показано, что и в этом случае животные получают энергетическую выгоду от координации (Funk et al., 1997). В то же время возможны ситуации, когда локомоторный и дыхательный ритмы не синхронизированы, например при локомоции у черепах (Landberg et al., 2003).
Исследование центральных механизмов координации ритмических моторных программ у млекопитающих ограничено сложностью их нервной системы. Тем не менее, возможность координации между локомоторным и дыхательным центрами была показана в сравнительно редуцированном спинальном препарате на кролике (Viala et al, 1979). В недавней работе на том же препарате авторы привели доказательства того, что фазовая координация между локомоторным и респираторным генераторами не устанавливается при отсутствии афферентного притока, в то время как искусственная ритмическая стимуляция, подаваемая по соответствующим сенсорным путям (от локомоторных мышц) приводит к сходной с поведенческой координации ритмов (Morin, Viala, 2002).
Несмотря на отдельные успехи в выяснении клеточных механизмов координации, когда, например, удается показать конвергенцию локомоторных и респираторных ритмических входов на центральных нейронах (Ezure, Tanaka, 1997), сложность ЦНС млекопитающих делает их сравнительно неудобными объектами для изучения взаимоотношений между моторными программами. Напротив, беспозвоночные животные с их сравнительно простыми нервными системами и поддающимися индивидуальной идентификации нейронами являются более предпочтительными моделями для исследования общих механизмов центральной координации ритмических моторик (Nusbaum, Beenhakker, 2002).
В основных разделах этого обзора приведены данные, свидетельствующие о том, что в основе многих поведенческих программ лежит активность центрального генератора и что в некоторых случаях устройство такого генератора хорошо расшифровано и описано в понятиях нейрона и синапса. В то же время, по проблеме нейрональных механизмов координации генераторов в литературе имеется значительно меньше данных. В особенности это касается случаев взаимодействия одновременно активных ритмических нейронных сетей, генерирующих функционально различные моторные программы. Исследования, в которых координация моторных программ рассмотрена на нейронном уровне, как правило описывают взаимодействие функционально близких элементов поведения. Хорошими примерами таких работ являются изучение координации ритмических программ в стоматогастрическом ганглии декапод (Nadim et а/., 1998), а также исследования, посвященные фазовой координации двух пищевых моторных программ морского ангела Clione (Malyshev, Norekian, 2002). Можно предположить, что в основе центральной координации любых ритмических моторных программ лежат общие закономерности, которые в будущем позволят сделать обобщения и в отношении сложно организованных нервных систем.
Выбранный нами объект исследования, моллюск Lymnaea, является одной из наиболее удобных моделей для изучения взаимодействия между центральными генераторами. Уже накоплено значительное количество информации о функционировании его поведенческих программ и их нейрональных коррелятов. В данном обзоре проведена классификация известных на данный момент моторных программ Lymnaea, причем особенное внимание уделено описанным до настоящего времени механизмам координации между различными генераторами. Представляется, что в обозримом будущем гастроподы сохранят свое значение как ведущий объект исследований, посвященных клеточным и нейрохимическим механизмам, лежащим в основе генерации поведенческих программ и их взаимодействий.
В основе данной работы лежало наблюдение, что в редуцированных препаратах Lymnaea, подвергнутых тотальному воздействию предшественника серотонина, часто наблюдается жесткая привязка дыхательной программы к локомоторному ритму (Цыганов, Сахаров, 2002). Помимо этого, активность нейрона RPeD1, являющегося частью центрального респираторного генератора (Syed, Winlow, 1991b), оказалась вовлечена в фармакологически вызванный локомоторный ритм (Сахаров, Цыганов, 1998). Первоначально нами была поставлена задача выяснить отношение наблюдавшейся в препаратах координации к нормальному поведению. Не являлась ли координация дыхания с локомоцией фармакологическим артефактом? В случае подтверждения наличия координации между локомоцией и дыханием в нормальном поведении, предстояло определить количественные (в том числе фазовые) характеристики этого взаимодействия, а затем, вернувшись к редуцированному препарату, найти нейрональные корреляты координации двух ритмических программ.
Электрофизиологические эксперименты
В данной части работы была поставлена задача выяснить, в какой степени активность нейрона VD4 необходима для генерации респираторного ритма. Нейрон VD4 был выбран для этих целей, поскольку он, как известно из работ (Syed, Winlow, 1991b, Syed et al., 1992), является одним из двух ключевых нейронов респираторного генератора, построенного согласно модели «half-center» (Brown, 1911). Второй нейрон (или группа нейронов) генератора, ІрЗІ, оказался очень труден для поиска и электрофизиологического отведения из-за неточности опубликованных карт локализации нейронов респираторного генератора. Во всех описанных ниже экспериментах мы контролировали электрическую активность третьего из трех ключевых нейронов дыхательной сети - гигантской дофаминергической клетки RPeD1, идентификация которой не представляла сложности. Первоначальная цель экспериментов состояла в поиске способа влияния на центральный респираторный генератор, поскольку нам казалось естественным начать изучение механизмов координации двух генераторов с поиска возможности влияния на один из них.
Было выполнено две серии экспериментов: на полуинтактном препарате, где, помимо ЦНС, присутствовали фрагмент мантии и ПН (n = 8) и на препарате изолированной ЦНС (n = 6). В четырех опытах не проводили ферментативную обработку для размягчения сосудистых оболочек ЦНС. Запуск дыхательного ритма производили суперфузией раствором L-DOPA (0.5 мМ) либо электрической стимуляцией нейрона RPeDI (описание последнего способа приведено в работе Syed, Winlow, 1991b). Помимо респираторной программы, в ЦНС на фоне суперфузии L-DOPA был активен локомоторный ритм.
Ни в одном из экспериментов обеих серий нейрон VD4 не генерировал потенциалов действия на фоне респираторного ритма. На фазе открывания ПН мы наблюдали в нейроне VD4 волну деполяризации (рис. 3.11а), амплитуда которой варьировала от опыта к опыту в пределах от 3 до 15 мВ в зависимости от значения мембранного потенциала нейрона. На фоне искусственной деполяризации было видно, что описанные волны имеют характер тормозного синаптического входа. При значительной деполяризации нейрона VD4 происходила инверсия знака этого синаптического притока, а сам нейрон периодически генерировал пачечный разряд непосредственно после окончания синаптического притока.
Анализ активности других нейронов висцерального ганглия, известных своим участием в дыхательном ритме, показал, что в нервной системе присутствует обширный синаптический приток (рис. 3.116), который считается коррелятом открывания ПН (Input3) (Syed et al., 1991). Сравнение моментов возникновения и окончания Input3 и синаптического притока в нейроне VD4 указывает на идентичность источников этих притоков. Этот факт не противоречит полученным ранее результатам (Syed, Winlow, 1991b), согласно которым нейрон VD4 получает приток Input3 непосредственно перед собственным разрядом, происходящим по механизму посттормозной отдачи. Надпороговая электрическая стимуляция VD4 прямоугольными толчками положительного тока при отсутствии ритмических движений ПН приводила либо к неполному открыванию ПН, либо к более плотному его закрыванию. Ответ ПН уменьшался в ряду повторяющихся стимуляций VD4 (рис. 3.12). Если же разряд VD4 искусственно был вызван на фоне открытого состояния дыхальца, то это не приводило к немедленному (внеочередному) его закрыванию, чего можно было бы ожидать в том случае, если VD4 является интернейроном закрывания ПН (рис. 3.13а). Длительная стимуляция нейрона VD4 на фоне фармакологически вызванной дыхательной программы могла приводить к временному нарушению ритма (рис. 3.136).
Нами была показана возможность стабильной работы вызванного респираторного ритма при отсутствии спайковой активности VD4. Молчание этого нейрона в наших опытах согласуется с результатами Бенжамина (Benjamin, 1984). Сайд и Уинлоу, считающие спайковую активность VD4 необходимым условием генерации дыхательного ритма (Syed, Win low, 1991b), высказали предположение, что в опытах Бенжамина клетка VD4 молчала из-за повреждения длительной ферментативной обработкой препарата. Это объяснение вряд ли приложимо к нашим результатам, так как мы использовали схему ферментативной обработки, применявшуюся в работах группы Сайда (Inoue et а/., 1996), а в контрольной группе (4 эксперимента) препараты вообще не подвергали действию протеолитического фермента. Можно предложить несколько гипотез, объясняющих причины расхождений наших результатов с ранее опубликованными. 1. Взаимодействие VD4 с другими нейронами гипотетической дыхательной сети может иметь неспайковую природу. 2. Для генерации ритма достаточно ритмической работы единственного нейрона, IP3I, если он обладает собственной пейсмейкерной активностью. Можно предположить, что в этом случае ПН закрывается пассивно.
Поведение: мышечная локомоция и дыхание на сухой поверхности
Наши представления о механизме координации между циклической локомоцией и дыханием у Lymnaea были основаны на первоначальных наблюдениях привязки открывания ПН к локомоторному циклу. Предложенная схема координации в целом сводилась к значительной перестройке респираторного генератора с переносом его центрального звена в локомоторную нейронную сеть, расположенную в педальных ганглиях (Цыганов, Сахаров, 2002). Описанная реконфигурация центрального генератора под действием нейромодуляторного вещества хорошо согласуется с современными представлениями о таких процессах (Dickinson, 1995) и подтверждается примерами сходных перестроек нейронных сетей (Weimann, Marder, 1994; Meyrand ef a/., 1994). В пользу предложенной схемы также свидетельствовали результаты перерезок в пределах ЦНС (Цыганов, Сахаров, 2002), говорившие о пластичности структуры описанного ранее в литературе респираторного генератора (Syed, Winlow, 1991 b)
Альтернативная схема координации дыхания и локомоции предполагала сохранение возможности независимой генерации обеих моторных программ, в то время как между ними устанавливались либо проявлялись исходно имеющиеся координационные связи. Она также объясняла часто наблюдаемую в опытах на редуцированных препаратах жесткую равнопериодическую синхронизацию ритмов, но, помимо этого, обосновывала возможность нарушения равнопериодической синхронизации, появление гармонических отношений между ритмами (2:1 и др.), возможность быстрой смены фазы привязки открывания ПН к ЛЦ, а также возможность работы каждой из моторных программ в отсутствие другой. Все перечисленные явления, большинство из которых плохо совместимо с гипотезой о едином генераторе для обоих моторных ритмов, неоднократно наблюдались нами в ходе экспериментов и подробно рассмотрены в разделе "Результаты и обсуждение". Полученные в работе данные свидетельствуют о том, что между системами дыхания и циклической локомоции прудовика существует центральная координация. Вероятно, она редко проявляется в нормальном поведении моллюска, находящегося большую часть жизни в водной среде и нечасто вынужденного использовать наземную локомоцию для поиска другого водоема при пересыхании или загрязнении воды. Тем не менее, во время активации циклической мышечной локомоции, призванной заменить ресничную при значительном увеличении силы тяжести в безводной среде, включаются механизмы координации локомоции с участившимся в соответствии с мышечной нагрузкой дыханием.
Согласно нашим наблюдениям, ведущую, доминирующую роль во взаимодействии двух моторных программ играет локомоция, тормозящая дыхательную программу на определенной фазе локомоторного цикла. Эта координация имеет центральную природу, поскольку сохраняется в редуцированных препаратах, включая изолированную ЦНС. Однако не следует исключать и периферических рефлекторных механизмов, в какой-то мере модифицирующих выполнение центральных программ, что подтверждается продемонстрированным в наших поведенческих экспериментах учащением дыхания при частичном устранении механического влияния раковины на ПН. Однако несмотря на описанное изменение, фазовая координация моторных программ при этом не претерпела существенных изменений.
Полученные нами результаты, подтверждающие преимущественно центральный механизм взаимодействия моторных программ, вновь поднимают вопрос о степени участия в установлении координации периферических обратных связей. Среди имеющихся в литературе данных о фазовой координации ритмических моторных программ есть примеры как центрального (Malyshev, Norekian, 2002), так и периферического (Morin, Viala, 2002) механизмов координации. Существует ли обратное координирующее влияние со стороны дыхания на локомоторную программу? Полученные нами результаты свидетельствуют, что обратное влияние имеет место, однако вопрос о его значимости для формирования целостного поведения Lymnaea остается открытым. Вероятнее всего, указанное координирующее влияние проявляется при нормальном дыхательном поведении моллюска в водной среде, когда он находится на поверхностной пленке воды. Излишняя активность локомоторной системы нежелательна в момент совершения дыхательного акта. В наших экспериментах влияние, обеспечивающее торможение локомоторной системы в момент открывания ПН, проявилось в поведенческих экспериментах с чрезмерной фармакологической активацией дыхательной системы, а также было неоднократно показано в редуцированных препаратах.
Можно предположить, что описанные координирующие механизмы достались прудовику, вторично-водному легочному моллюску, от сухопутных предков. Однако существует и другое возможное объяснение функционального смысла наблюдаемой нами координации. Помимо циклической наземной локомоции, в поведенческом репертуаре Lymnaea можно выделить еще один тип локомоторного поведения - акватическую локомоцию, демонстрируемую моллюском на поверхностной пленке воды (Winlow, Haydon, 1986) и часто синхронизированную с легочным дыханием. Фазы движения ноги и раковины во многом совпадают с теми, которые наблюдаются при наземной локомоции. Однако фаза привязки открывания ПН к локомоторному циклу отличается от той, которая подробно рассмотрена в данной работе - при акватической локомоции ПН открывается в начальной части ЛЦ, сразу же вслед за подтягиванием раковины (В. В. Цыганов, личное сообщение).
