Введение к работе
Актуальность проблемы. Длительное сохранение жизнеспособной нервной ткани в замороженном состоянии (криоконсервация в жидком азоте, при -196С) является современной и актуальной проблемой в связи с развитием в последние годы методов трансплантологии в нейромедицине и, соответственно, необходимостью создания запаса нейронального материала в криобанках.
В настоящее время криоконсервация стала обычной процедурой для длительного сохранения многих типов клеток животных, таких как клетки крови, клетки костного мозга, сперматозоиды, клеточные культуры, и др. Успешные протоколы криоконсервирования в основном разработаны для однородных клеточных суспензий (Фуллер и др., 2003; Meryman, 2007; Choi, Bischof , 2010; Seth, 2012). Изолированные ткани плохо переносят низкотемпературную криоконсервацию, а для целых органов эти методы пока не разработаны. Клетки в составе ткани, создавая определенную архитектуру функциональной единицы, более плотно упакованы, чем в клеточных суспензиях, с которыми исследователи чаще всего имеют дело. Гетерогенный клеточный состав нейрональной ткани (разного типа нейроны и глиальные клетки) и экстраклеточная структура, - все вместе могут создавать проблемы при попытке экстраполировать протоколы криоконсервирования с клеточных суспензий на кусочки органов, ткани, нейросферы (Fagy et al., 2004; Pegg, 2007; Paynter, 2008). Одна из таких проблем заключается в том, что экстраклеточные структуры и межклеточные связи могут быть не менее важными объектами криоконсервирования, чем сами клетки, особенно, если они плотно упакованы в структуре ткани (Acker et al., 2000; Muller-Schweinitzer, 2009; Pegg, 2010). Поэтому в настоящее время являются особенно актуальными исследования механизмов криоповреждений и криозащиты нервной ткани как неделимой интегрированной структуры.
В этой связи в качестве модельных объектов интерес представляют нервные системы беспозвоночных, как например, мозг моллюска Lymnaea stagnalis L., который представляет собой гетерогенную ткань, включающую полифункциональные нейроны разного размера и обширные вненейрональные области, по многим свойствам сходные с аналогичными структурами позвоночных. Хорошо отлаженные способы регистрации электрической активности нейронов, разработанные методы клеточной и органной культуры (Гелетюк и др., 1970; Костенко и др. 1972; Wong et al., 1981; Ивличева, Гахова, 2007), а также доступность объекта для исследователей в любое время года, делают мозг моллюска привлекательной моделью для исследования в области криобиологии (Гахова и др., 1989; Дмитриева, 2004; Ивличева, Гахова, 2007). Изучение особенностей криоповреждений и криозащиты мозга моллюска как целой интегральной структуры позволит определить области криоповреждений, прогнозировать степень восстановления и оценить возможности режимов криоконсервации и создания оптимальных криозащитных сред.
Цель и основные задачи исследования. Цель данной работы заключалась в изучении влияния криоконсервации на функциональную и регенеративную способность зрелых нейронов на примере криоконсервирования изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L.
В соответствии с целью были поставлены и решены следующие задачи:
1. Изучить электрическую активность нейронов переживающего мозга моллюска в органной культуре без криоконсервации и после криоконсервации: мембранные потенциалы (МП), генерацию потенциалов действия (ПД) и постсинаптических потенциалов (ПСП), рецепторные ответы на медиаторы.
-
Провести поиск синаптических связей между нейронами переживающего мозга моллюска в органной культуре после криоконсервации.
-
Исследовать в клеточной культуре выживаемость и регенеративные способности нейронов, выделенных из замороженно-оттаянного мозга моллюска.
-
Выявить характер протективного действия (крио- или нейро- протекторное) пептида Thr- Ser-Lys-Tyr (TSKY) выделенного из мозга зимоспящих сусликов Spermophillus undulates. Определить его влияние на выживаемость и регенеративные способности нейронов в культуре на разных этапах криоконсервирования.
-
Проанализировать влияние пептида TSKY на кристаллизацию и формирование микрочастиц льда в криозащитных растворах в процессе замораживания до температуры жидкого азота.
Научная новизна. Важными достижениями работы являются результаты по изучению электрической активности нейронов переживающего мозга моллюска в органной культуре до и после криоконсервации, поскольку замораживанию подвергался интактный орган, состоящий из разнородной популяции дифференцированных клеток со сложными межклеточными связями и синаптическими структурами. Впервые показано, что на фоне сохранения целостности основной массы нейронов криоповреждения были связаны с межнейрональными областями, а именно с аксонами и синаптическими структурами. Нейроны, выделенные из криоконсервированных ганглиев, как показано в культуре in vitro, обладали способностью к регенерации нервных отростков и образованию контактов. Впервые показано, что пептид TSKY, выделенный из мозга зимоспящих животных, может участвовать в восстановительных процессах в период оттаивания и оказывать нейропротекторное, положительное воздействие, на жизнеспособность нейронов после криоконсервации, а не криопротекторное на этапе замораживания. Криомикроскопические исследования подтверждают отсутствие у пептида TSKY криопротекторных свойств, так он не влиял на характер кристаллизации и формирование микрочастиц льда при замораживании растворов.
Научно-практическое значение работы. Результаты работы вносят вклад в изучение механизмов криопровреждений и криозащиты тканей (и целых органов) животных при криоконсервации. Полученные знания о роли нейропротекторных факторов при гипотермии и при глубоком замораживании изолированных нейрональных тканей позволит продолжить поиск новых эффективных и безопасных способов криоконсервации нервных клеток и ткани. Результаты проведенных исследований могут быть использованы для модификации и разработки криозащитных сред, повышающих жизнеспособность, нейрональной ткани, нейросфер, кусочков мозга.
Конкурсная поддержка. РФФИ грант №10-04-01319-а; грант конкурса УМНИК, гос. контракт № 6639р/9106 от 02.03.09 и № 8229р/12633 от 06.07.10; АФГИР (США, CRDF) проект RUB 2-010001-PU-05; р2004Наукоград-а № 04-04-9730.
Апробация диссертации. Основные материалы исследований были представлены на 8-й, 9-й, 11-й, и 13-й пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино 2004, 2005, 2007, 2009гг.), на Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 2005), VIII (Kazan, 2006) и IX (St. Petersburg, 2009) East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology «Simpler Nervous Systems», ХЕХ Международной конференции-совещании «Консервация генетических ресурсов» (Пущино, 2008), III Всероссийском Конгрессе с международным участием студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010», Школе-конференции «Инновационные подходы в изучении биосистем» (Нижний Новгород, 2010), Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011), VII и VIII Международном междисциплинарном Конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2011, 2012), 14th International Hibernation Symposium «Living in a seasonal world: Thermoregulatory and metabolic adaptations» (Semmering, Austria, 2012 ), IV Съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012).
Публикации.
Основные результаты диссертации представлены в 20 печатных работах, из них 5 в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК; 1 - глава в книге; 2 - в сборнике; 12 тезисов.
Структура и объем диссертации.
