Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1. Метод культуры тканей и клеток растений и его использование 10
2. Рост и темновое дыхание культуры ткани и клеток 12
а) Состав питательной среды и рост культуры ткани и клеток 12
б) Действие компонентов питательной среды на рост культуры ткани и клеток 16
в) Действие внешних факторов на темновое дыхание культуры ткани и клеток 20
г) Способ и начальный этап утилизации сахарозыкультурой ткани и клеток 23
д) Соотношение ростовой и дыхательной активности культуры ткани и клеток и пути утилизации экзогенной сахарозы 26
3. Фотосинтез и рост культуры ткани и клеток 33
а) Влияние компонентов питательной среды на синтез пигментов в культуре ткани и клеток 33
б) Структурная организация фотосинтетического аппарата и функциональная активность изолированных хлороплаетов культуры ткани и клеток 37
в) Фиксация COg и пути углерода при фотосинтезе культуры ткани и клеток 39
г) Действие света на накопление биомассы культурой ткани и клеток 44
д) Автотрофные культуры тканей и клеток: современное состояние проблемы 45
4. Заключение
II. ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 53
1. Объект и методы исследования 53
а) Культивирование гетеротрофной, фотогетеротрофной и автотрофной культуры ткани руты 53
б) Определение накопления сырой и сухой массы каллуса руты 56
в) Определение содержания хлорофилла в каллусе руты 56
г) Выделение хлоропластов из каллуса руты 56
д) Определение скорости выделения кислорода изолированными хлоропластами каллуса руты 57
е) Определение скорости нециклического фото фосфорилирования изолированными хлоропластами каллуса руты 59
ж) Определение скорости газообмена О2 и С0 каллусом руты 60
з) Определение поглощения экзогенной сахарозы каллусом руты 62
2. Результаты исследования , 64
а) Рост и влияние экзогенной сахарозы на накопление биомассы культурой ткани руты в темноте и на свету 64
б) Действие света на поглощение экзогенной сахарозы фотогетеротрофной культурой ткани руты. Возможные регуляторы фотоассимшшции субстрата 76
в) Соотношение степени участия темнового дыхания
и фотосинтеза при накоплении биомассы фотогете-ротрофной культурой ткани руты 86
г) Действие кислорода на газообмен Og и С02 гетеротрофной и фотогетеротрофной культурой ткани руты. 99
д) Изменение фотохимических показателей изолированных хлоропластов и скорости фотосинтеза при снижении концентрации сахарозы в питательной среде 107
3. Заключение 115
IV. ВЫВОДЫ 118
V. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 119
- Метод культуры тканей и клеток растений и его использование
- Определение накопления сырой и сухой массы каллуса руты
- Определение содержания хлорофилла в каллусе руты
Введение к работе
Одной из важнейших проблем, стоящих перед биологической наукой является проблема рационального использования возможностей растительной клетки для нувд народного хозяйства. Решение этой задачи особенно актуально в настоящее время, когда начинают разрабатываться биотехнологические приемы получения целого ряда полезных для человека соединений, специфичных для растительной клетки (алкалоиды, стероидные соединения, гликозиды и др.).
Важным направлением, которое успешно и интенсивно разрабатывается в последнее время, является изучение способности растительных клеток и тканей in vitro к синтезу веществ вторичного происхождения. Культуры клеток и тканей в ряде случаев синтезируют вещества высокой биологической активности, что позволяет использовать эти объекты в качестве сырья для фармацевтической, парфюмерной, а в перспективе, и пищевой промышленности (Березнеговская и др., 1978).
Преимущество культур тканей in vitro перед высшими растениями состоит в том, что получение медикаментов и/или специфических ингредиентов из них не связано с сезонными сборами растительного материала, зависящего от погодных условий. Интерес к культурам тканей растений-продуцентов возрастает также в связи с тем, что природные ресурсы или истощаются, или не в полной мере удовлетворяют интересы человека из-за трудности выращивания и акклиматизации некоторых тропических растений-продуцентов с длительным вегетационным периодом.
Изучение большого количества культур тканей лекарственных растений (к недавнему прошлому их насчитывалось около пятидесяти) показало, что в них сохраняется почти полный набор веществ вторичного происхождения, свойственный высшим растениям. Однако, ко- личества этих веществ обычно во много раз ниже, чем в соответствующем органе целого растения (Воллосович, 1970). Известны лишь отдельные случаи, когда в культуре ткани появлялись вещества несвойственные данному виду растения (Воллосович, 1970).
Увеличение количества ценных веществ вторичного происхождения в культуре клеток и тканей возможно двумя путями: путем количественного увеличения биомассы или путем усиления синтеза необходимого метаболита. Поэтому вопрос стимуляции роста и накопления вторичных метаболитов приобретает решающее значение для биотехнологического использования культуры ткани как продуцента важных фармакологических соединений.
Кроме того, обычно культуры тканей выращиваются на питательных средах, богатых дорогостоящими органическими соединениями, необходимыми для роста, поэтому переход с гетеротрофного на автотрофний способ питания может существенно снизить затраты на получение практически ценных лекарственных веществ.
Очевидно, что решение задачи стимуляции роста и снижения материальных затрат на выход больших количеств биомассы невозможно без знания физиологических и биохимических процессов, протекающих в культуре клеток и тканей.
Необходимость физиолого-биохимической направленности исследований в изучении процессов роста и его стимуляции вполне очевидна. Ростовые характеристики растительного объекта во многом зависят от рН среды культивирования, температуры, аэрации, а в случае выращивания зеленых культур тканей, и освещения. Известно, что изменение условий культивирования приводит к изменению (или смене) биохимической направленности процессов катаболизма и анаболизма, что в свою очередь также отражается на ростовых характеристиках.
Однако, недостаточность знаний в области фундаментальных исследований физиологической и биохимической регуляции роста и регуляции вторичного метаболизма культур клеток и тканей, по-видимому, и является ограничением в создании высокорентабельных технологий.
Как отмечает член-корреспондент АН СССР Зутенко Р.Г. (Дутен-ко, 1983), одной из особенностей культивируемых клеток растений, определяющей характер создаваемых на их основе технологий является "...способность образовывать клеточную биомассу, содержащую экономически важные продукты, в специальной аппаратуре, позволяющей параметрическое регулирование, в том числе и с помощью компьютерной техники".
Культура ткани Ruta graveoiens содержит богатый состав лекарственных веществ вторичного происхождения, среди которых особую ценность составляют фурокумарини (Кузовкина, 1975). Исследованиями отечественных и зарубежных ученых установлено, что многие производные кумаринов обладают активным антикоагулирующим, спазмолитическим и фотосенсибилизирующим действием. На основе фурокума-ринов отечественной фармацевтической промышленностью получены несколько препаратов, которые успешно используются при лечении ряда серьезных заболеваний ("пастинацин", "аммифурин", "бероксан" и др.). Антимитотическая активность некоторых кумаринов может оказаться полезной при изучении их противоопухолевого действия (пит. по: Кузовкина, 1975).
В отличие от целого растения, культура ткани Ruta graveoiens наряду с сохранением почти всего спектра веществ вторичного происхождения имеет существенное преимущество, которое состоит в возможности регуляции роста и метаболизма составом питательной среды.
Целью настоящей работы было исследование роста, изучение изменений таких физиологических показателей, как поглощение субст- рата, темновое дыхание, фотосинтез и взаимосвязи между ними, а также апробация некоторых подходов для получения автотрофнои по углероду каллусной ткани Ruta graveolens.
Основные задачи работы состояли в следующем:
1. Изучение роста гетеротрофной и фотогетеротрофной культу ры ткани руты и его связи с поглощением экзогенного субстрата в цикле выращивания.
Определение степени участия темновых и светозависимых процессов (темновое дыхание, фотосинтез) в накоплении биомассы.
Поиск возможных путей повышения фотосинтетической активности фотогетеротрофной культуры ткани руты.
Отработка метода получения автотрофнои по углероду каллусной ткани руты.
Положения, выносимые на защиту: рост, как темновой, так и фотосинтезирующей культуры ткани зависит от содержания сахарозы в питательной среде. Для обеих культур эта зависимость носит линейный характер. Полное исчезновение сахарозы из питательной среды приводит к остановке роста; фотостимуляция ассимиляции экзогенной сахарозы фотогетеротрофной культурой ткани контролируется продуктом световой стадии фотосинтеза. Наиболее вероятным регулятором является НАДФ^,* углеродное обеспечение фотосинтеза в достаточной мере осуществляется темновым дыханием. Вклад процесса фотосинтеза в накопление сухой массы фотогетеротрофной культуры ткани в 3-4 раза меньше, чем темнового дыхания; фотосинтетические показатели фотогетеротрофной культуры ткани могут быть повышены путем отбора наиболее зеленых участков каллуса и последующего их культивирования на обедненных сахарозой питательных средах; - показана возможность получения автотрофной по углероду каллус-ной ткани. Однако, необходимо отметить ее низкую скорость роста, несмотря на высокую фотосинтетическую активность как изолированных хлоропластов, так и самого каллуса.
Метод культуры тканей и клеток растений и его использование
Получение новых сведений о сущности биологических явлений и о функциях клеточных структур в значительной мере зависит от применения моделей, максимально приближенных к нативному состоянию, и разработки высокоразрешагащих и точных методов исследования.
Интенсивно разрабатываемый в последние годы метод культуры изолированной ткани и клеток представляет собой пример управляемого биологического моделирования.
Под методом культуры ткани и клеток принято понимать способ выращивания in vitro отдельных органов, тканей и клеток в стерильных условиях на твердых (гелеобразных) или жидких питательных средах. В соответствии с условиями выращивания следует различать культуру тканей и культуру клеток растения. Культура тканей -выращивание в длительной пересадочной культуре сообщества клеток, возникших путем пролиферации изолированных сегментов какого-либо органа, культура клеток - выращивание отдельных клеток или небольших их групп во взвешенном состоянии в жидкой питательной среде при использовании аппаратуры, обеспечивающей их аэрацию и перемешивание.
К числу первых попыток применения этого метода на растительном объекте следует отнести работу Хаберландта (цит. по Бутенко, 1964), который, работая с клетками палисадной паренхимы, считал, что такие клетки менее требовательны к составу питательной среды, так как хотя бы частично могут обеспечивать свой рост in vitro за счет питательных веществ, образующихся в процессе фотосинтеза. Однако, исследователю не удалось наблюдать ни деления, ни роста клеток в условиях in vitro.Неудача, постигшая Хаберландта, привела к потере интереса исследователей в разработке метода культуры ткани и клеток на растительных объектах на длительное время.
Новый импульс в развитии метода был получен в 30-40 г.г. Основанием для этого послужили успехи в культивировании тканей и клеток животного происхождения.
В новых систематических исследованиях наряду с традиционными способами совершенствования приемов культивирования (подбор питательных сред, техника изоляции и др.) были начаты работы по изучению действия химических и физических факторов на процессы роста и деления клеток, а в последние годы интенсивно изучаются вопросы гормональной, метаболитной и физиологической регуляции жизнедеятельности растительной клетки.
Метод культуры ткани и клеток находит все более широкое применение для решения целого ряда задач, имеющих теоретическое значение. К ним относятся: проблемы дифференциации и дедифференциа-ции растительных клеток; вопросы морфогенеза; изменение генетической информации путем воздействия физическими и химическими мутагенными факторами; интеграция генетического материала различных видов растительных клеток; изучение опухолевого роста и др.
Определение накопления сырой и сухой массы каллуса руты
Значение рН питательной среды перед добавлением агара доводили І МК0Н до 5,6-5,8.
Питательную среду разливали в 250 мл конические колбы, по 80-90 мл в каждую, закрывали плотными ватными пробками и стерилизовали в горизонтальном автоклаве при дополнительном давлении 0,7-0,8 атм и температуре 115-120 в течение 30 минут. Затем, на остывшую питательную среду в стерильных условиях помещали кусочки ткани общим весом 1-2 г и выращивали в течение четырех недель (цикл выращивания).
Каллусная ткань руты культивировалась либо в темноте (гетеротрофная культура ткани), либо на свету, с использованием сахарозы в качестве основного источника углерода (фотогетеротрофная культуpa ткани). Интенсивность света 3500-4000 лк создавали с помощью люминесцентных ламп ЛХБ-80-4. Продолжительность освещения составляла 16 часов в сутки.
Температура в термостатированной камере поддерживалась в течение суток на уровне 26±2. Относительная влажность воздуха составляла 70-80 %.
Определение содержания хлорофилла в каллусе руты
Для получения культуры ткани руты с более высокой скоростью фотосинтеза, исходную фотогетеротрофную культуру ткани, выращенную на питательной среде с 3 % сахарозы, измельчали в стерильных условиях на кусочки размером 200-300 мг и пересаживали на питательную среду несколько измененного состава: тиамин-нсі - 0,4 мг л ; индолилуксусная кислота - 0,5 мг-л"1; сахароза - 20000 мг»л . Содержание других компонентов и условия культивирования оставались без изменения.
Исходным объектом для получения автотрофной по углероду кал-лусной культуры ткани руты служила фотогетеротрофная культура, выращенная на питательной среде с 2 % сахарозы.
Трансплантат весом до I г помещали в 250 мл конические колбы с 80-90 мл питательной среды того же состава, что и в случае культивирования ткани с высокой скоростью фотосинтеза. Сахарозу исключали из состава питательной среды. Снабжение углеродом осуществляли с помощью продувания каждой колбы газовой смесью, состоящей из I % углекислоты и 99 % воздуха.
Скорость продувания составляла 40-60 мл «мин""1 на каждую колбу. Схема подачи газовой смеси в культуральные сосуды представлена на рисунке 3. Интенсивность света, температура культивирования и влажность сохранялись прежними, как и в случае культивирования фотогетеротрофной культуры ткани.
