Введение к работе
Актуальность работы. Среди соединений специализированного обмена растений в последние годы особое внимание привлекают фитоэкдис-тероиды — полигидроксилировашпые стерипы, идентичные или структурно близкие с гормонами линьки и метаморфоза насекомых и ракообразных. Обнаруженные в растениях сравнительно недавно, эти соединения выделены из папоротникообразных, голосеменных и цветковых растений, а также из некоторых водорослей и грибов. Несмотря на широкую распространенность в растительном мире и большое разнообразие химических структур, физиологические функции фитоэкдистероидов до конца не выяснены, а биосинтез и метаболизм практически не изучен. Так как культуры клеток и тканей высших растений традиционно используются в фундаментальных исследованиях в качестве моделей для изучеігая различных аспектов вторичного метаболизма, теоретически разработаны и реализованы подходы к получению культур клеток со стабильным уровнем биосинтеза, создание адекватных экспериментальных систем для углубленного исследования биосинтеза фитоэкдистероидов и механизмов его регуляции представляет научный интерес.
Получение культур клеток экдистероидсодержаших растений, имеющих разное систематическое положение, также имеет теоретическое значение, так как дает возможность изучить в сравнительном аспекте физио-лого-биохимические закономерности существования их как самостоятельных биологических систем и выявить различия их характеристик, обусловленные видовыми отличиями культур.
И наконец, растения-продуценты экдистероидов имеют практическую значимость. В частности, серпуха венценосная (Serratula coronata L., Asteraceae) и живучка ползучая (Ajuga reptans L., Lamiaceae) -— лекарственные растения, издавна используемые в народной медицине. Обнаруженные в них экдистероиды обладают широким спектром биологической активности: анаболической, адаптогенной, тонизирующей, антиоксидантной. Ряд экдистероидов этих растений проявляют гормональную активность в отношении насекомых и могут служить источником гормональных препаратов для научішх исследований. Поскольку природные запасы этих растений недостаточны, технология выделения экдистероидов из растительного сырья сложна, а стоимость коммерческих препаратов очень высока, то получение культуры клеток как альтернативного источника биологически активных экдистероидов может оказаться целесообразным.
Цель исследования — изучение закономерностей биосинтеза экдис-тероидов в каллусных культурах серпухи венценосной и живучки ползучей.
Задачи исследования:
получение стабильных каллусных культур серпухи венценосной и живучки ползучей из различных типов эксплантов индивидуальных растений, культивируемых in vitro;
изучение влияния различных факторов на эффективность каллусо-генеза и рост полученных каллусных культур;
определение качественного и количественного состава экдистеро-идов в иитактных растениях серпухи венценосной и живучки ползучей in vivo и в условиях in vitro;
определение качественного и количественного состава экдистеро-идов в каллусных культурах серпухи венценосной и живучки ползучей и зависимости биосинтетической активности культур клеток от генетических и эпигенетических особенностей эксплантов;
изучение влияния факторов культивирования (гормональных, трофических) и условий культивирования (световой режим) на рост и биосинтез экдистероидов в полученных каллусш>іх культурах.
Положения, выносимые на защиту.
-
Возможность эффективного биосинтеза экдистероидов в недифференцированных культурах клеток серпухи венценосной и живучки ползучей — растений с высоким содержанием этих вторичных метаболитов.
-
Большая значимость для продуцирования экдистероидов в культурах клеток генотипа исходного растения, но не эпигенетических свойств эксплантов.
-
Возможность изменения качественного состава экдистероидов в культурах клеток относительно иитактных растений. Вероятность как отсутствия некоторых метаболитов интактного растения, так и появления экдистероидов, нехарактерных для вида.
-
Количественное содержание экдистероидов в каллусных культурах может быть ниже, чем в иитактных растениях (серпуха венценосная) или оставаться на уровне иитактных растений (живучка ползучая). Существует тенденция к ослаблению биосинтетической активности с увеличением продолжительности культивирования каллусных тканей.
-
Возможность физиологической регуляции процессов роста и синтеза экдистероидов в культурах клеток, видовая и штаммовая специфичность в отношении реакции на факторы культивирования.
Научная новизна работы. Впервые получены каллусные культуры серпухи венценосной и живучки ползучей с высоким содержанием экдис-
тероидов и выявлена штаммовая специфичность у каллусных тканей, индуцированных из разных эксплантов разных донорных растений. Создана коллекция каллусных культур этих растений.
Впервые изучен качественный и количественный состав экдистерои-дов в культурах клеток серпухи венценосной и живучки ползучей в сравнении с интактными растениями in vivo и in vitro и выявлена зависимость биосинтетической активности культур клеток от генотипа исходного растения.
Установлено, что в каллусных культурах серпухи венценосной сохраняется способность к синтезу основных экдистероидов интактных растений, таких как 20-гидроксиэкдизон, инокостерон и экдизон. Спектр экдистероидов в культивируемых клетках изменяется: появляется нетипичный для растений метаболит и не обнаруживается макистерон А. Содержание экдистероидов по сравнению с интактными растениями существенно снижается.
В каллусных культурах живучки ползучей доминирующими экдисте-роидами, так же как и в интактных растениях, являются 29-норциастерон и 29-норсенгостерон. Для этой культуры различия в спектре экдистероидов по сравнению с интактными растениями достоверно не установлены. Получены культуры клеток живучки ползучей с равноценным с интактными растениями уровнем синтеза экдистероидов.
Показана возможность физиологической регуляции процессов роста и синтеза экдистероидов в культурах клеток изучаемых видов и выявлены видоспецифические и штаммоспецифические отличия у культур клеток в отношении реакции на одинаковые факторы культивирования.
Практическая значимость. В результате проведенных исследований получены сведения о составе, содержании и закономерностях синтеза экдистероидов, необходимые для практического использования культур клеток Serrntv.la ccrcr.alz;; Ajugu repians. Ряд каллусных штаммов с высоким и стабильным содержанием фитоэкдистсроидов можно рассматривать как перспективный исходный материал для получения суспещионных культур и создания на их основе линий-продуцентов ценных соединений для медицины, косметики, ветеринарии, а также гормональных препаратов для разведения полезных насекомых и научных исследований в области биохимии и физиологии беспозвоночных животных.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на XI международном совещании по экдизонам (Чешске Будейовице, 1994), научной конференции молодых ученых Института биологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 1995), III Российском симпозиуме "Новые методы био-
технологии растений" (Пущино, 1995), XII международном совещании по экдизонам (Барселона, 1996), международном совещании по фитоэкдис-тероидам (Сыктывкар, 1996), научной сессии Института биологии Коми НЦУрО РАН (Сыктывкар, 1997).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц и 17 рисунков. Список литературы включает 166 наименований, из них 101 на иностранных языках.
