Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Биологически активные свойства резвератрола 11
1.2. Основные источники резвератрола 17
1.3. Биосинтез резвератрола и его производных 19
1.4. Классические биотехнологические приемы увеличения продукции резвератрола в культуре клеток винограда 23
1.5. Участие ионов Сa2+ в регуляции биосинтеза вторичных метаболитов, кальций-зависимые протеинкиназы (CDPK) 27
1.6. Характеристика семейства CDPK винограда 31
1.7. Типы альтернативного сплайсинга растений 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы 43
2.1. Клеточные линии и компоненты питательных сред 43
2.2. Обработка блокатором потенциал-зависимых мембранных Ca2+-каналов, специфическим ингибитором CаМ-подобных протеинкиназ и ионофором Ca2+ А23187 44
2.3. Выделение нуклеиновых кислот и получение комплементарной ДНК 44
2.4. Количественная оценка экспрессии генов STS 45
2.5. Количественная оценка экспрессии эдногенных генов VaCDPK в нетрансгенных клетках винограда 46
2.6. Получение полной последовательности генов VaCDPK1a, VaCDPK1e, VaCDPK1d, VaCDPK2a, VaCDPK3c и VaCDPK3a 49
2.7. Получение трансгенных клеточных линий V. amurensis, сверхэкспрессирующих гены VaCDPK, c помощью агробактериальной трансформации 51
2.8. Проверка трансгенности полученных клеточных линий винограда 52
2.9. Определение содержания стильбенов в образцах ткани V. amurensis 55
2.10. Получение рекомбинантных белков и анализ их протеинкиназной активности 55
2.11. Статистическая обработка полученных результатов 56
ГЛАВА 3. Результаты 57
3.1. Влияние верапамила на рост, биосинтез резвератрола и экспрессию генов STS и VaCDPK в клеточных линиях V. amurensis 57
3.2. Влияние специфического ингибитора СаМ-подобных протеинкиназ на рост, биосинтез резвератрола и экспрессию генов STS и VaCDPK в культуре клеток V. amurensis с повышенной продукцией резвератрола 6 1
3.3. Влияние ионофора Са2+ на рост, биосинтез резвератрола и экспрессию генов STS и VaCDPK в клеточных линиях V. amurensis 66
3.4. Характеристики VaCDPK-трансгенных клеточных линий винограда 72
3.4.1. VaCDPK1a-трансгенные клеточные линии винограда 75
3.4.2. VaCDPK3a-трансгенные клеточные линии винограда 78
3.4.3. VaCDPK1d-трансгенные клеточные линии винограда 85
3.4.4. VaCDPK2а-трансгенные клеточные линии винограда 88
3.4.5. VaCDPK1е-трансгенные клеточные линии винограда 91
3.4.6. VaCDPK3с-трансгенные клеточные линии винограда 100
3.5. Протеинкиназная активность полноразмерного белка VaCDPK3a и его
укороченных вариантов 105
ГЛАВА 4. Обсуждение 109
Выводы 116
Список литературы
- Основные источники резвератрола
- Обработка блокатором потенциал-зависимых мембранных Ca2+-каналов, специфическим ингибитором CаМ-подобных протеинкиназ и ионофором Ca2+ А23187
- Проверка трансгенности полученных клеточных линий винограда
- Характеристики VaCDPK-трансгенных клеточных линий винограда
Введение к работе
Виноград содержит ряд БАВ, которые благоприятно воздействуют на организм человека. Среди таких веществ самое известное – это резвератрол (3,5,4’-тригидроксистильбен). Резвератрол обладает антиопухолевой активностью, кардиопротективными, нейропротективными и гепатопротекторными свойствами (Kawada et al., 1998: Shankar et al., 2011; Juhaz et al., 2011; Liu et al., 2011). Также этот стильбен является мощным активатором сиртуинов – белков, участвующих в процессах программированной клеточной гибели и дифференцировки (Denu, 2003). Резвератрол обнаружен во многих растениях, таких как арахис, клюква и голубика, но наибольшее его содержание характерно для винограда, в том числе и винограда амурского Vitis amurensis Rupr.
Рынок получения и сбыта резвератрола находится в стадии формирования. Резвератрол получают из растений горца птичьего Polygonum cuspidatum, что является длительным и затратным процессом, поскольку необходимо вырастить взрослое растение, содержание резвератрола в котором не превышает десятых долей процента от сухой массы клеток. Это объясняет довольно высокую стоимость резвератрола. Клеточные культуры имеют определенные преимущества перед традиционным растительным сырьем, так как продукт можно получать независимо от распространения растения, сезона, погодных условий и почвы. Если к тому же учесть быстрое истощение естественных сырьевых ресурсов, то преимущества использования клеточных технологий становятся очевидными. Однако содержание биологически-активных веществ (БАВ) в клеточных культурах растений обычно очень низкое, поэтому для промышленного производства БАВ необходимо увеличить биосинтез этих ценных веществ в клеточных культурах растений с помощью методов биотехнологии. Классическими методами индукции синтеза вторичных метаболитов в культурах клеток растений являются селекция и отбор наиболее продуктивных клеточных линий, варьирование состава питательных сред, добавление предшественников БАВ обработка клеток разнообразными элиситорами, а также создание с помощью методов генной инженерии клеток, активно продуцирующих БАВ. Для создания генно-модифицированных организмов, сверхпродуцирующих резвератрол, необходимо детально знать молекулярные механизмы регуляции биосинтеза этого стильбена в клетках растений.
В настоящее время регуляторы биосинтеза стильбенов полностью не изучены, но установлено, что некоторые вторичные мессенджеры, особенно катионы Ca2+, вовлечены в регуляцию биосинтеза стильбенов (Vandelle et al., 2006). У растений основными сенсорами цитоплазматического кальция являются кальций-зависимые протеинкиназы (CDPK). Показано, что геном двух таксономически далеких видов Oryza sativa и Arabidopsis thaliana включает 31 и 34 гена CDPK, соответственно. Это может свидетельствовать о наличии разнообразных функций белков семейства CDPK. Показано, что увеличение накопления фитоалексинов коррелирует с повышением активности CDPK (Ramani and Chelliah, 2007).
Цель и задачи исследования. Цель работы – проанализировать участие кальциевой сигнальной системы в регуляции биосинтеза резвератрола в клетках винограда V. amurensis.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать влияние ингибитора Ca2+-каналов плазматической мембраны (верапамил, VER), специфического ингибитора СаМ-подобных протеинкиназ (W7) и ионофора Ca2+ А23187 (CI) на биосинтез резвератрола, экспрессию генов стильбен синтаз (STS) и генов CDPK в культурах клеток V. amurensis, а также на ростовые характеристики клеточных культур V. amurensis.
-
Изучить влияние сверхэкспрессии генов VaCDPK1a, VaCDPK1d, VaCDPK1e, VaCDPK2a, VaCDPK3a и VaCDPK3c на биосинтез резвератрола и накопление биомассы клеточных культур V. amurensis.
-
Получить рекомбинантные белки полноразмерного гена VaCDPK3a и его укороченных вариантов VaCDPK3aSF1, VaCDPK3aSF2 и VaCDPK3aSF3, проанализировать их протеинкиназную активность.
-
Изучить влияние сверхэкспрессии укороченных вариантов транскриптов VaCDPK1e и VaCDPK3a на продукционные характеристики клеточных линий винограда амурского.
Научная новизна. Впервые изучено влияние ионофора кальция А23187 и антагониста CаМ-подобных протеинкиназ на содержание резвератрола. Показано, что сверхэкспрессия некоторых CDPK в клетках V. amurensis достоверно увеличивает продукцию резвератрола, что напрямую указывает на участие основных сенсоров кальция в биосинтезе этого ценного стильбена.
Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть использованы биотехнологическими компаниями для создания генетических конструкций и методических подходов для регуляции клеточного роста и биосинтеза вторичных метаболитов растений. Также результаты диссертационной работы можно использовать для проведения теоретических и практических занятий в университете на биологических факультетах.
Апробация работы. Результаты работы представлены на XIII Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2010); X региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России (Владивосток, 2011); третьем международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2012); XI региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России (Владивосток, 2012); XIV Всероссийской молодежной школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2012); VIII международном симпозиуме «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2012); V международной школе молодых ученых по молекулярной генетики «Непостоянство генома» (Звенигород, 2012); I Межрегиональной молодежная школе-конференции «Актуальные проблемы биологических
наук» (Владивосток, 2013); Х международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Казань, 2013); региональной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых учёных по естественным наукам (Владивосток, 2014). Материалы диссертации изложены в 20 публикациях, из них 9 в журналах из списка ВАК.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ, в том числе 9 статей в рецензируемых журналах (из списка ВАК).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 135 страницах, иллюстрирована 32 рисунками и содержит 24 таблицы. Список литературы насчитывает 166 наименований.
Основные источники резвератрола
С древних времен до настоящего времени, люди прибегают к традиционной медицине, основой которой являются лекарственные растения. Одним из важных действующих компонентов лекарственных растений являются фитоалексины – естественные БАВ, которые являются ключевым звеном в системе защиты растений от фитопатогенов. Фитоалексины из натуральных продуктов имеют широкий диапазон химических структур, таких как полифенолы, флавоноиды, сапонины и витамины (Vasanthi et al., 2012).
Одним из самых известных полифенолов растений является резвератрол. Резвератрол привлек внимание ученых, когда в 1992 году Симэном и Кизи показли его присутствие в вине. Представление о благоприятном воздействии красного вина на здоровье человека ясно установлено в средиземноморской диете и явлении «французского парадокса». Понятие «французского парадокса» определено как низкая заболеваемость ишемической болезнью сердца при потреблении в пищу продуктов богатых насыщенными жирами (Feher et al., 2007). Результаты исследований показали, что «французский парадокс» частично связан с действием этанола, присутствующем как в вине, так и в других алкогольных напитках. Этанол вызывает увеличение содержания в крови липопротеинов высокой плотности (Rimm et al., 1996). Однако ученые предположили, что не только этанол способен оказывать защитный эффект, но и какие-то другие, неизвестные на тот момент, составляющие вина (Leger et al., 1979). Позднее многочисленные исследования показали высокую биологическую активность фенольных компонентов вина, большая часть которых имела структуру полифенолов (Soleas et al., 1997). В средиземноморском регионе уровень сердечнососудистых заболеваний один из самых низких в мире. Это связывают с эффектом средиземноморской диеты, характерной особенностью которой является большое потребление арахиса, фисташек, различных ягод, виноградного сока и красного вина. Во всех этих продуктах довольно большое содержание таких стильбенов, как резвератрол и его гликозилированного производного – пицеид (Zamora-Ros et al., 2008). Поэтому в последние годы резвератрол стал популярной основой для пищевых добавок, используемыми людьми во всем мире (Rahman et al., 2010).
Как показывают исследования, резвератрол может играть значительную роль в предупреждении развития сердечно-сосудистых заболеваний (Kopp et al., 1998). Это обусловлено следующими свойствами резвератрола: во-первых – ингибирование молекул адгезии клетками сосудов (Ferrero et al., 1998; Rotondo et al., 1998); во-вторых – ингибирование пролиферации гладкомышечных клеток сосудов (Haider et al., 2005; Poussier et al., 2005; Wang et al., 2006); в-третьих – стимуляция активности эндотелиальной синтазы оксида азота (Chen et al., 1996; Duffy et al., 2003); в-четвертых – ингибирование агрегации тромбоцитов через регуляцию синтеза эйкозаноидов (Wang et al., 2002; Olas et al., 2005; Stef et al., 2006); в-пятых -ингибирование процессов окисления липопопротеинов низкой плотности (Fremont et al., 1999; Ungvari et al., 2007). Показано, что препарат Longevinex, на основе резвератрола, снижает уровень холестерина в крови и препятствует развитию ишемии сердца (Juhaz et al., 2011).
В настоящее время установлено, что резвератрол способен благотворно влиять на работу нервной системы высших животных. Так, был проведен ряд экспериментов на приматах, где показано, что добавление резвератрола в ежедневный рацион животных способствовало улучшению пространственной памяти и мыслительных функций (Dal-Pan ey al., 2011). У людей прием резвератрола может, теоретически, уменьшить образование бета-амилоидных бляшек ассоциированных с возрастными изменениями в мозгу. Исследователи предполагают, что одним из механизмов этого процесса является связывание резвератролом ионов меди. Лиу с коллегами (Liu et al., 2011) показали, что резвератрол способствует восстановлению нервных связей в поврежденных участках мозга, благодаря его свойствам – антиоксидантным и, предотвращающим запуск апоптоза. Таким образом, резвератрол помогает восстановить мыслительные способности у неврологических больных или людей преклонного возраста. Также резвератрол улучшает метаболизм нейронов, предотвращает их гибель и препятствует окислению ксантина, тем самым предотвращает развитие ишемии мозга (Draczynska-Lusiak et al., 1998; Li et al., 2010).
Известно, что пролиферация звездчатых клеток, которые играют критическую роль в развитии фиброза печени, усиливается окислительным стрессом. По этой причине вещества, которые способны ингибировать активацию этих клеток, способны предотвращать развитие фиброза печени. Кавада с коллегами (Kawada et al., 1998) обнаружили, что резвератрол способен ингибировать активацию звездчатых клеток путем нарушения передачи сигнала к пролиферации этим клеткам и экспрессии некоторых белков клеточного цикла.
Вследствие схожести структуры транс-резвератрола и синтетического эстрогена диэтилстильбэстрола (4,4 -дигидрокси-транс-диэтилстильбен), возник вопрос об эстрогенной активности резвератрола. Несмотря на многочисленные исследования, до сих пор остается дискуссионным вопрос, является ли резвератрол агонистом или антагонистом эстрадиола (Aggarwal et al., 2004). Некоторые исследования показывают, что резвератрол обладает выраженной эстрогенной активностью, в то время как другие обнаруживают противоположный эффект (Gehm et al., 1997; Turner et al., 1999; Pozo-Guisado et al., 2004).
Обработка блокатором потенциал-зависимых мембранных Ca2+-каналов, специфическим ингибитором CаМ-подобных протеинкиназ и ионофором Ca2+ А23187
Сайты неканонического сплайсинга обычно представлены короткими повторяющимися последовательностями 4–8 нуклеотидов (short direct repeated sequences, SDRs) и сильно отличаются от классических знаков узнавания сплайсосом U2 и U12. Недавние исследования показали, что SDRs растений очень богаты G и С нуклеотидами, и преимущественно представлены GC, CG, CC и GG нуклеотидами (Niu et al., 2010). Стоит отметить, что на сегодняшний день пока не установлена универсальная последовательность SDRs. Показано, что SDRs являются необходимым элементом неканонического альтернативного сплайсинга (Niu et al., 2010; Luo et al., 2007; Lin et al., 2010).
Недавние полногеномные исследования показали, что альтернативный сплайсинг широко распространен в растениях. Так полногеномное картирование транскриптома A. thaliana показало, что около 42% (Filichkin et al., 2010) генов, содержащих в своей последовательности интроны, были подвержены альтернативному сплайсингу. Предполагают, что альтернативный сплайсинг большого числа генов играет важную роль в ответе и устойчивости растений на стрессовые воздействия (Filichkin et al., 2010; Iida et al., 2004; Ali and Reddy, 2008; Mastrangelo et al., 2012; Carvalho et al. 2013). Известно, что альтернативному сплайсингу подвергаются различные транскрипты генов, белковые продукты которых вовлечены в разнообразные сигнальные пути. Альтернативному сплайсингу подвергаются транскрипты генов транскрипционных факторов, убиквитин-лигаз и различных защитных генов (Druillennec et al. 2012). На сегодняшний день остается неясным вопрос, как альтернативный сплайсинг регулирует активность и функции протеинкиназ растений, которые, как известно, являются ключевым звеном в передачи сигнала в клетке. Известно только несколько примеров альтернативного сплайсинга Ser/Thr-протеинкиназ растений (Nishiyama et al. 1999; Kawasaki et al. 1999; Xiong and Yan, 2003; Castells et al. 2006; Kurihara et al. 2007; Koo et al. 2007; Lin et al. 2010). В настоящее время показано, что альтернативному сплайсингу подвергаются только два гена CDPK растений. Нишияма с коллегами (Nishiyma et al., 1999) показали, что транскрипт гена CDPK печеночника (Hepaticae) имеет два идентичных соседних экзона, которые в результате альтернативного сплайсинга образуют две мРНК. Кавасаки с коллегами (Kawasaki et al., 1999) показали, что были независимо транскрибированы две разные РНК на двух независимых локусах SPK-A и SPK-B на разных хромосомах риса и объединены в один транскрипт. Пока неизвестно, подвергаются ли транскрипты генов мультигенного семейства CDPK альтернативному сплайсингу. Ранее, сотрудниками нашей лаборатории были найдены и описаны несколько необычных транскриптов гена VaCPK3a в rolB– трансгенной культуре клеток винограда амурского (Dubrovina et al. 2009). Также были найдены и описаны необычные транскрипты гена VaCPK1е (Dubrovina et al. 2009). Показано, что транскрипт VaCPK1е подвергался классическому альтернативному сплайсингу по каноническим сайтам сплайсинга 5 GT и 3 AG, в результате чего образовывались изоформы у которых отсутствуют ключевые субдомены каталитического центра. Также было показано, что необычные короткие транскрипты генов VaCPK3а и VaCPK1е с, у которых отсутствовали внутренние домены, сайты канонического сплайсинга, и, которые, возможно, подвергались необычным пост-транскрипционным изменениям посредством SDRs. До сих пор неизвестно, обладают ли белковые продукты подобных транскриптов киназной активностью, и какую функцию они могут выполнять в клетке. Поэтому, в данной работе одной из задач является установить влияние полноразмерных и укороченных белковых продуктов генов VaCDPK на продукцию резвератрола в клетках V. amurensis.
В работе мы использовали клеточные линии V. amurensis с разным содержанием резвератрола: от низкого (0.004% от сухой массы клеток) в контрольной клеточной линии V2 до относительно высокого (до 0.5% от сухой массы клеток) в rolB-трансгенных клеточных линиях. Каллус V2 был получен в 2002 году из молодого стебля взрослого дикорастущего растения V. amurensis Rupr. (Vitaceae), которое было собрано на Дальнем Востоке (юг Приморского края) и определено в отделе ботаники Биолого-почвенного института ДВО РАН. Трансгенные по гену rolB клеточные линии VB1 и VB2 были получены в результате независимых трансформации суспензионной культуры V2 штаммом Agrobacterium tumefaciens GV3101/pMP90RK (Kiselev et al., 2007), несущим векторную конструкцию pPCV002-CaMVB (Spena et al., 1987). В конструкции ген rolB находится под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты 35S CaMV (Spena et al., 1987). Конструкция также несет ген устойчивости к канамицину nptII под контролем нопалинсинтазного промотора.
Для проведения экспериментов на клеточных линиях винограда мы использовали WБ/A агаризованную питательную среду (Kiselev et al., 2009) с добавлением 0.5 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП) и 2.0 мг/л -нафтилуксусной кислоты (АНУ), которую разливали в пробирки 20020 мм по 15 мл. Интервал субкультивирования составлял 35–40 дней в темноте при 24±1oС.
Также для характеристики VaCDPK-трансгенных клеточных линий винограда V. amurensis, а именно, внешнего вида, прироста сырой и сухой биомассы, содержания и продукции резвератрола, мы осуществляли пассаж трансгенных клеток винограда на агаризованную питательную среду WБ или WА, либо на питательную среду, не содержащую фитогормонов W0. 2.2. Обработка блокатором потенциал-зависимых мембранных Ca2+ каналов, специфическим ингибитором CаМ-подобных протеинкиназ и ионофором Ca2+ А23187
Ингибитор кальциевых каналов плазматической мембраны – верапамил (VER, ICN Pharmaceuticals, Швейцария), растворяли в дистиллированной воде и добавляли в питательные среды до измерения pH среды (исходный раствор 100 мг/мл). Рабочая концентрация 0.75 мМ. Эта концентрация была использована, так как ранее полученные результаты свидетельствуют, что данная концентрация является наиболее подходящей для ингибирования биосинтеза резвератрола в клетках винограда (Dubrovina et al., 2009).
Специфический ингибитор СаМ-подобных протеинкиназ W7 (Tocris bioscience, Бристоль, Великобритания) растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) и добавляли в питательные среды после автоклавирования до конечной концентрации 100 M (исходный раствор 10 мг/мл). Ранее было показано, что данная концентрация является оптимальной, при которой растительные клетки обладают способностью делиться (Kiselev et al., 2010). Ионофор кальция (CI, A23187, Sigma, Сент-Луис, США) растворяли в этаноле и добавляли до конечной концентрации 1 M и 10 M (Kiselev et al., 2012).
Проверка трансгенности полученных клеточных линий винограда
Мы исследовали влияние ингибиторов и активаторов Сa2+-каналов на рост и биосинтез резвератрола в клеточных линиях V. amurensis. Нами показано, что добавление ингибиторов Сa2+-каналов в питательные среды приводит к значительному снижению аккумуляции резвератрола в клеточных линиях винограда (Dubrovina et al., 2009; Шумакова и др., 2013; Kiselev et al., 2013a), а добавление активаторов, напротив, значительно увеличивает продукцию резвератрола в контрольной культуре (Kiselev et al., 2012). Таким образом, нами показано, что Сa2+-сигнальная система вовлечена в регуляцию биосинтеза резвератрола, поэтому нам интересно узнать корреляцию между продукцией резвератрола и экспрессией генов CDPK в клетках винограда. Дальнейшей нашей задачей является установить полную последовательность различных генов CDPK, а также выявить их функции и возможное участие в продукции резвератрола. Одним из методов изучения функций белковых продуктов генов является сверхэкспрессия изучаемых генов в клетках. Поэтому для изучения функций CDPK нами были получены VaCDPK1a-, VaCDPK1e-, VaCDPK1d-, VaCDPK2a-, VaCDPK3a- и VaCDPK3с-трансгенные клеточные линии винограда V. amurensis. Также были получены клеточные линии винограда амурского, сверхэкспрессирующие укороченные варианты генов VaCDPK1eSF1, VaCDPK1eSF2, VaCDPK1eSF3, VaCDPK3aSF1, VaCDPK3aSF2 и VaCDPK3aSF3.
После агробактериальной трансформации полученными бинарными векторами, несущими тот или иной ген VaCDPK, клетки винограда культивировали в течение 5 месяцев в присутствии 250 мг/л цефотаксима для подавления роста агробактерий. В течение трех месяцев на питательной среде с добавлением 10–20 мг/л канамицина осуществляли отбор VaCDPK-трансгенных клеток V. amurensis, которые, в отличие от нетрансгенных клеток, не погибали при используемых концентрациях канамицина. Так, в ходе шести независимых агробактериальных трансформаций суспензионной культуры клеток V2 каждым из бинарных векторов: КА-10 (несущем в своей последовательности ген VaCDPK1a), КА-08 (VaCDPK1e), КА-07 (VaCDPK1d), КА-15 (VaCDPK2a) и КА-09 (VaCDPK3с), было получено четыре VaCDPK1a-трансгенных клеточных линий, четыре VaCDPK1е-трансгенных клеточных линий, три VaCDPK1d-трансгенных клеточных линий, четыре VaCDPK2a-трансгенных клеточных линий и пять VaCDPK3с-трансгенных клеточных линий соответственно. Для того, чтобы получить три клеточные линии винограда трансгенных по гену VaCDPK3а, нам потребовалось провести порядка двадцати независимых агробактериальных трансформаций бинарным вектором КА-04 (несущем в своей последовательности ген VaCDPK3a). Это было обусловлено тем, что в первый месяц селекции трансформированные штаммом агробактерий КА-04 клетки винограда амурского отличались активным ростом, но в последующих месяцах селекции переставали делиться и погибали. Похожая ситуация наблюдалась при получении трансгенных клеточных линий винограда по коротким вариантам генов VaCDPK1е и VaCDPK3а. Так, для получения трех VaCDPK1еSF1-, двух VaCDPK1еSF2- и трех VaCDPK1еSF3-трансгенных клеточных линий потребовалось около двенадцати независимых агробактериальных трансформаций каждым бинарным вектором КА-11, КА-12 и КА-13 соответственно. Для получения двух VaCDPK3аSF1-, четырех VaCDPK3аSF2- и двух VaCDPK3аSF3-трансгенных клеточных линий мы провели около шестнадцати независимых агробактериальных трансформаций бинарными векторами КА-02, КА-05 и КА-06 соответственно. В ходе агробактериальной трансформации бинарным вектором, несущем в своей последовательности только ген устойчивости к канамицину nptII, нами была получена векторная клеточная линия винограда КА-0, которая по внешним признакам, ростовым и биосинтетическим характеристикам не отличается от культуры клеток V2.
Нами было показано, что все полученные клеточные линии несут ген устойчивости к канамицину nptII, что свидетельствует о факте вставки генетической конструкции, содержащей тот или иной ген VaCDPK в клетки винограда амурского. Во всех полученных клеточных линиях отсутствует сигнал на ген virB2, что говорит о том, что в наших образцах нет примеси клеток агробактерий, а сигнал на nptII получен именно с ДНК клеточных линий винограда. С помощью метода ПЦР РВ и разных комбинаций праймеров мы оценили эндогенную – внутриклеточную экспрессию гена, трансгенную – экспрессию дополнительной вставки гена, и тотальную – суммарную, экспрессии внутриклеточного и дополнительной вставки гена во всех полученных VaCDPK-трансгенных клеточных линиях V. amurensis.
Также мы провели ряд экспериментов по анализу ростовых характеристик всех полученных VaCDPK-трансгенных клеточных линий V. amurensis. Для этого осуществляли пассаж полученных клеточных линий на питательные среды с разным составом фитогормонов. Ранее было показано, что при культивировании на питательных средах WБ/А в клетках винограда амурского наблюдается наивысшая продукция резвератрола (Kiselev et al., 2007). Также известно, что трансформация культуры клеток растений тем или иным геном может приводить к гормоноспецифическому или, напротив, к гормоно-неспецифическому росту клеток и биосинтезу вторичных метаболитов. Поэтому в своих экспериментах мы решили анализировать прирост сырой, сухой биомассы, содержание и продукцию резвератрола в полученных трансгенных клетках V. amurensis, растущих на средах с разным составом фитогормонов WБ/А, WБ, WА и W0. Все эксперименты на VaCDPK-трансгенных клеточных линиях ставили на второй месяц после снятия с канамицина. Отмечено, что прирост сырой и сухой биомассы, а также содержание и продукция резвератрола практически во всех CDPK-трансгенных клеточных линиях при культивировании на питательных средах WА и W0 достоверно снижалась. Содержание резвератрола во всех клеточных линиях винограда определяли с помощью метода ВЭЖХ. Далее более детально опишем характеристики всех полученных VaCDPK-трансгенных клеточных линий.
Характеристики VaCDPK-трансгенных клеточных линий винограда
Нами было отмечено, что прирост сырой биомассы клеток сверхэкспрессирующих формы генов VaCDPK1d, VaCDPK2а и VaCDPK1е либо значительно не изменялся, либо в отдельных клеточных линиях был выше в 1.4–1.7 раза и за счет этого продукция резвератрола в клеточных линиях КА-07, КА-15 и КА-08 увеличилась в 1.2–4.8 раза (табл. 16, 17, 18). Известно, что последовательности полноразмерных генов VaCDPK1d, VaCDPK2а и VaCDPK1е наиболее гомологичны последовательностям генов VvCDPK12, VvCDPK13 и VvCDPK17 из V. vinifera соответственно. Ранее было показано, что VvCDPK17 экспрессируются во всех органах и тканях, а VvCDPK12 и VvCDPK13 также экспрессируются во всех органах и тканях, кроме пыльцы (Chen et al., 2013). Также известно, что VaCDPK1d и VvCDPK12 участвуют в ответе V. amurensis и V. vinifera на стресс, вызванный засолением почвы, а экспрессия форм VaCDPK2а и VvCDPK13 увеличивается при водном дефиците (Dubrovina et al., 2013; Chen et al., 2013). Экспрессия гена VaCDPK1е и VvCDPK17 увеличивается в растениях V. amurensis и V. vinifera как в случае водного дефицита, так и засухи (Dubrovina et al., 2013; Chen et al., 2013). Также показано, что ген VaCDPK2а, который является близким гомологом генов OsCPK3, OsCPK16 и OsCPK27 (Ye et al., 2009), что сильно экспрессируются в соцветиях. Для VaCDPK1d и VaCDPK2а характерен высокий уровень экспрессии в семенах винограда амурского, что коррелирует с ранее полученными данными об экспрессии гомологичных генов риса O. sativa, которые активно экспрессируются в молодой метелке и эндосперме семян риса (Ye et al., 2009). Вероятно, белковые продукты генов VaCDPK1d и VaCDPK2а участвуют в регуляции ответа растений на стресс, вызванный засухой и водным дефицитом, кроме того, гены VaCDPK2а и VaCDPK1d также могут участвовать в процессе развития семян (Dubrovina et al., 2013).
Сравнительный анализ выведенной аминокислотной последовательности гена VaCDPK3с с известными аминокислотными последовательностями CDPK A. thaliana показал высокий уровень гомологии с AtCPK1 (73% гомологии), AtCPK2 (78%) и AtCPK20 (75%) (Coca and Segundo, 2010). Ранее было показано, что обработка растений A. thaliana патогенами грибковой природы приводит к увеличению экспрессии гена AtCPK1. Более того, было показано, что фермент PAL является одним из возможных субстратов для фосфорилирования AtCPK1, близкого гомолога VaCDPK3с (Cheng et al., 2002). Как известно, PAL – это первый фермент фенилпропаноидного пути биосинтеза вторичных метаболитов растений. Таким образом, сведения о фосфорилировании PAL посредством CDPK обеспечивают прямую связь между CDPK и вторичным метаболизмом растений (Cheng et al., 2002).
Нами было показано, что в полученных VaCDPK3с-трансгенных клеточных линиях винограда амурского достоверно увеличивалась продукция резвератрола в 8.8–67.8 раз относительно контрольной клеточной линии КА-0 (табл. 22). Содержание резвератрола в клеточной линии КА-09-I достигало 0.42% от сухой биомассы клеток (табл. 22). Такое содержание резвератрола в клетках V. amurensis намного выше, чем в культуре клеток, содержащих резвератрол, описанных ранее (Ku et al., 2005; Tassoni et al., 2005), но ниже чем в rolB-трансгенных клеточных линиях (Kiselev et al., 2009). Нами было показано, что сверхэкспрессия гена VaCDPK3с в культуре клеток винограда увеличивает продукцию резвератрола посредством активации только некоторых форм генов STS (табл. 23). Полученные данные об увеличении выборочной экспрессии генов STS в VaCDPK3с-трансгенных клеточных линиях винограда амурского кореллируют с ранее полученными данными об экспрессии генов экспрессия гена STS7 достоверно увеличивается в клетках винограда амурского, растущих на питательной среде с добавлением СА (Kiselev et al., 2013а), и rolB-трансгенных клетках V. amurensis (Kiselev et al., 2009). Вероятно, ген STS7 в большей степени вовлечен в биосинтез резвератрола, чем остальные формы представителей STS. Возможно, ген VaCDPK3с увеличивает продукцию резвератрола посредством увеличения экспрессии гена STS7, чей белковый продукт необходим для активного биосинтеза резвератрола. Также возможно, что некоторые ферменты вторичного метаболизма растений (например, STS7) могут быть субстратами для VaCDPK3с.
Ранее было показано появление необычных коротких транскриптов VaCDPK (VaCDPK1es и VaCDPK3as) в rolB-трансгенных клеточных линиях винограда VB1 и VB2, которые отличаются повышенной продукцией резвератрола. Известно, что в большинстве случаев альтернативного сплайсинга у растений интроны, как интроны всех эукариот, начинаются с GT 5 -донорного сайта и AG 3 -акцепторного сайта (Reddy, 2007). Намного реже донорные и акцепторные сайты сплайсинга представлены GC-AG, AT-AC или GT-GG динуклеотидами. Ранее было показано, что все короткие варианты транскриптов VaCPK3a не имеют канонических донорно-акцепторных сайтов (Dubrovina et al., 2014). Известно, что сплайсинг коротких вариантов транскриптов VaCPK3a происходил на 5 и 3 -сайтах по коротким прямым повторам SDR длиной 3–7 пар нуклеотидов. Также было показано, что полученные необычные короткие варианты транскриптов VaCPK3a являются артефактом ОТ-ПЦР (Dubrovina et al., 2014). Нам стало интересно узнать, могут ли белковые продукты коротких транскриптов VaCDPK3a влиять на клеточные характеристики культуры клеток V. amurensis, и обладают ли они протеинкиназной активностью. Для этого нами были получены трансгенные клеточные линии по коротким вариантам генов VaCDPK3aSF1, VaCDPK3aSF2 и VaCDPK3aSF3 и проанализирована белковая активность рекомбинантных белков представленных генов. Было показано, что клеточные характеристики VaCDPK3aSF1-трансгенных линий КА-02 значительно не отличались от векторной клеточной линии КА-0 (табл. 13). Также было показано, что рекомбинантный белок VaCDPK3aSF1 не обладает киназной активностью, что в свою очередь объясняет отсутствие каких-либо изменений в клеточных характеристиках VaCDPK3aSF1-трансгенных клеток винограда амурского (рис. 32). Показано, что клеточные линии КА-05 и КА-06, сверхэкспрессирующие короткие варианты генов VaCDPK3aSF2 и VaCDPK3aSF3, отличались от векторной клеточной линии КА-0 достоверным увеличением прироста биомассы в 1.3–1.6 раза (табл. 14,15). Также нами отмечено, что белковые продукты генов VaCDPK3aSF2 и VaCDPK3aSF3 обладают киназной активностью и не проявляют сродства к катионам Ca2+ (рис. 32). Наличие ферментативной активности у белковых продуктов укороченных генов VaCDPK3aSF2 и VaCDPK3aSF3 обуславливает схожий эффект увеличения прироста биомассы клеток, сверхэкспрессирующих полноразмерный ген VaCDPK3a, и увеличения прироста биомассы клеток КА-05 и КА-06, трансгенным по укороченным вариантам VaCDPK3aSF2 и VaCDPK3aSF3 (табл. 12,14,15). Ингибирование ферментативной активности с помощью специфического ингибитора СаМ-подобных протеинкиназ W7 всех полученных рекомбинантных белков свидетельствует о том, что они принадлежат к одному классу – Ca2+-зависимых протеинкиназ.
