Введение к работе
Актуальность темы. Решение проблемы промышленного получения биологически активных веществ (БАВ) часто осложняется недостатком быстро воспроизводимых сырьевых источников. Такими источниками могут стать культуры клеток растений. Однако опыт получения клеточных культур показывает, что содержание в них целевых веществ чаще всего ниже, чем необходимо для эффективного промьішлеіпшго производства этих соединений, поэтому разработка методов увеличения содержания БАВ в клетках растений in vitro является актуальной задачей.
Известно, что резвератрол (3,5,4'-тригидроксистильбен) обладает превентивными свойствами против нескольких видов рака, положительно влияет на сердечнососудистую систему, а также обладает высоким фармакологическим потенциалом в лечении нейродегенеративных заболеваний (Shankar et al., 2007; Vingtdeux et al., 2008). Резвератрол обнаружен во многих растениях, таких как арахис, клюква и голубика, однако виноград, в том числе и дикий виноград Vitis amurensis Rupr., относят к основным источникам резвератрола. В растениях содержание этого вещества невелико, поэтому получать резвератрол из растений невыгодно. Синтетические аналоги БАВ часто содержат токсичные примеси. Клеточные культуры винограда, при условии их высокой целевой продуктивности, могли бы стать альтернативным источником резвератрола.
Клеточные культуры растений, трансформированные генами rol из Agrobacterium rhizogenes, уже давно привлекали внимание биотехнологов вследствие повышенной способности продуцировать самые разнообразные вторичные метаболиты (Bulgakov, 2008). Так, недавно был показан стимулирующий эффект трансформации Rubia cordifolia геном rolB на синтез антрахинонов в культурах клеток этого растения (Bulgakov et al., 2002). Однако механизм активации биосинтеза вторичных метаболитов в культурах клеток, трансформированных геном rolB агробактерий, не изучен. Понимание этого механизма имеет фундаментальное и прикладное значение. Новые данные о протекании процессов онкогенеза у растений и влиянии белка RolB на метаболизм растительных клеток позволят расширить знания об общих принципах регуляции биосинтеза вторичных метаболитов, что важно для промышленного получения ценных БАВ.
Цель и задачи исследования. Цель работы - получение культуры клеток V. amurensis с высоким содержанием резвератрола, а также исследование биохимических механизмов активации биосинтеза резвератрола в полученных клетках.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Оценить эффективность классических биотехнологических приемов, направленных на увеличение продукции резвератрола клеточной культурой V. amurensis.
Трансформировать клетки культуры V. amurensis геном rolB из A. rhizogenes и оценить биосинтез резвератрола в трансгенных клеточных линиях.
Изучить механизм влияния трансформации культуры клеток V. amurensis геном rolB на биосинтез резвератрола.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Воздействие различных элиситоров, добавление фенилаланина в питательные среды, а также селекция на фторфенилаланине приводят к увеличению продукции «г/7я«с-резвератрола культурой клеток V. amurensis, однако уровень биосинтеза этого
вещества остается недостаточным для промышленного использования полученных клеточных линий.
Трансформация клеточной культуры V. amurensis геном rolB из A. rhizogenes приводит к активации биосинтеза /яранс-резвератрола и накоплению больших количеств этого стильбена в полученных трансгенных клеточных линиях.
В /-о/В-экспрессирующих клеточных культурах и в контрольной культуре V. amurensis, обработанной салициловой кислотой (SA), дифференциально увеличена экспрессия генов ключевых ферментов в биосинтезе резвератрола, таких как фенилаланин-аммиак-лиаза (PAL) и стильбен синтаза (STS). При этом влияние SA и трансформации геном rolB на экспрессию генов PAL и STS в культурах клеток V. amurensis значительно различается.
Ингибиторы кальциевых каналов снимают стимулирующий эффект трансформации клеток V. amurensis геном rolB на биосинтез резвератрола.
Трансформация геном rolB значительно изменяет экспрессию некоторых генов Са2+-зависимых протеинкиназ (CDPK), а также приводит к появлению транскриптов CDPK с необычными модификациями последовательности Ser/Thr-киназного домена.
Научная новизна. Впервые изучено влияние трансформации растительных клеток геном rolB из A. rhizogenes на биосинтез стильбенов. В клеточной культуре V. amurensis, активно экспрессирующей ген rolB, продукция /иранс-резвератрола клетками составила 111.5 мг/л среды или 1431.3 мкг/г сырого веса клеток (2.32% от сухого веса клеток), что значительно превышает ранее сообщаемые данные для резвератрол-продуцирующих клеточных культур растений. Впервые показано, что трансформация растительных клеток геном rolB и обработка SA по-разному влияют на экспрессию генов PAL и STS. Впервые показано, что трансформация культур клеток растений геном rolB из A. rhizogenes значительно изменяет экспрессию некоторых генов CDPK и приводит к появлению транскриптов CDPK с необычными модификациями последовательностей Ser/Thr-киназного домена.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Полученные результаты важны для понимания протекания процессов опкогенеза у растений, механизма действия гена rolB A. rhizogenes на метаболизм трансгенных растительных клеток, а также принципов регуляции биосинтеза стильбенов. Понимание этих процессов необходимо для решения практических задач биотехнологии растений. Запатентован новый способ получения резвератрола, основанный на получении га/Д-трансгенных клеточных культур V. amurensis (Патент РФ №2326165).
Апробация работы.
Результаты работы были представлены на Всероссийском конкурсе инновационных проектов "Живые системы" (г. Киров, 2005); на 10-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006); на XI Международной молодежной Школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2007); на IX Международной конференции "Биология клеток растений in vitro и биотехнология" (Звенигород, 2008); на Международном Симпозиуме по достижениям в биохимической инженерии (Китай, 2009); на 4-й Международной конференции польского сообщества экспериментальной растительной биологии (Польша, 2009).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 4 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах и один патент.
Структура и объем работы.
