Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Некоторые механизмы регуляции биосинтеза антибиотиков 10
1.1.1. Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы 14
1.1.2. Характеристика ауторегуляторов, образуемых актиномицетами 16
1.2. Механизм биологического действия некоторых ауторегуляторов актиномицетов 21
1.2.1. Влияние а-фактора на различные виды актиномицетов 21
1.2.2. Роль других регуляторов, образуемых актиномицетами, в дифференциации некоторых представителей рода streptomyces 24
1.2.3. Методы и условия выделения и идентификации микробных ауторегуляторов 26
1.3. Макролидные противогрибковые антибиотики 31
Глава 2. Материалы и методы исследования 39
Глава 3. Образование культурой streptomyces imbricatus веществ, стимулирующих биосинтез антибиотиков 55
3.1. Условия образования эндорегулятора при культивировании 57
S. Imbricatus па комплексной регламентной среде 57
3.2. Образование эндорегулятора различными штаммами S. Imbricatus 62
3.3. Влияние состава питательной среды на образование эндорегулятора культурой s. Imbrjca tus 65
3.4. Влияние эндорегулятора s. Imbricatusна антибиотикообразование у продуцентов некоторых макролидных антибиотиков 68
3.5. Влияние эндорегулятораs. Imbricatus наморфолого культуральные признаки собственного продуцента и продуцентов некоторых макролидных антибиотиков 73
3.6. Влияние фильтрата кж s. Imbricatus на образование имбрицина При его внесении на разных стадиях процесса культивирования
Глава 4. Выделение сырца эндорегулятора s. Imbricatus из культуральной жидкости и характеристика некоторых его физико-химических и биологических свойств 86
4.1. Изучение физико-химических свойств фильтрата кж 89
S. Imbricatus, содержащего эндрегулятор 89
4.2. Очистка фильтрата, содержащего эндорегулятор s. Imbricatus ..91
4.3. Выделение эндорегулятора & imbricatus из фильтрата кж продуцента 94
4.4. Определение химической природы сырца эндорегулятора s. Imbricatus 102
4.5. Изучение биологических свойств сырца эндорегулятора s. Imbricatus 108
Глава 5. Влияние эндорегулятора на некоторые биохимические функции streptomycesimbricatus 112
5.1. Разработка и оптимизация состава синтетической питательной среды для биосинтеза имбрицина 113
5.2. Изучение роста s. Imbrica tus в условиях ауторегуляции биосинтеза имбрицина 117
5.3. Влияние эндорегулятора на активность некоторых ферментов S. Imbricatus 122
Заключение 134
Выводы 142
Список использованных источников
- Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы
- Влияние состава питательной среды на образование эндорегулятора культурой s. Imbrjca tus
- Очистка фильтрата, содержащего эндорегулятор s. Imbricatus
- Изучение роста s. Imbrica tus в условиях ауторегуляции биосинтеза имбрицина
Введение к работе
Актуальность работы. Регуляция, і о есть управление скоростью биохимических процессов, лежащих в основе взаимодействия различных клеток как внутри одного организма, так и между разными организмами, является одним из приоритетных направлений исследований в области фундаментальной биотехнологии Определенный прогресс и успехи в этом сегменте науки во мноюм связаны с обнаружением, выделением в индивидуальном состоянии и пониманием роли многочисленных специфических веществ, активно участвующих в таких взаимодействиях и названных аутобиорегуляторами Регуляюры человека и животных (гормоны, витамины, защитные вещества) исследуются уже в течение длительного времени В менее ясном состоянии находится изучение многочисленных аутореіуляторов микроорганизмов
Наиболее изучены низкомолекулярные микробные ауторегуляторы, образуемые микроорганизмами рода Streptomyces, среди которых основными являются А-фактор и его аналої и - низкомолекулярные соединения -бутиролактоны Известно, что эти соединения выполняют функцию «сигнальных молекул» при переключении этапов дифференциации и являются индукторами активации ферментов синтеза вторичных метаболитов
Представленные в литературе сведения об образовании аутобиорегуляторов продуцентами макролидных антибиотиков весьма немногочисленны Сведения об образовании регуляторных соединении продуцентами противогрибковых антибиотиков, в том числе продуцентом имбрицина S imbi icatus, в источниках литературы отсуїствуют
В связи с вышеизложенным важными и своевременными представляются исследования, направленные на изучение регулятора, обнаруженного у продуцента противогрибкового неполиенового макролидного антибиотика имбрицина и выяснение роли этого соединения в регуляции роста культуры и антибио гикообразования
Исследование проводилось в рамках научных работ, выполняемых на кафедре биотехнологии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии в соответствии с планом по теме «Исследование молекулярно-биологических механизмов синтеза вторичных метаболитов из ряда макролидных антибиотиков и низкомолекулярных цитокинов»
Цель и задачи исследования. Изучение возможности регуляции биосинтеза противогрибкового антибиотика имбрицина и других макролидных антибиотиков эндорегулятором, образуемым культурой Streptomyces imbricatus
В соответствии с целью исследования в работе были поставлены следующие задачи
изучить условия образования эндорегуляторного соединения продуцентом имбрицина и его влияние на биосинтез антибиотика различными штаммами 5" imbricatus,
исследовать влияние эндорегулятора S imbricatus на морфолого-культуральные признаки собственного продуцента и продуцентов некоторых макролидных антибиотиков,
выделить эндорегулятор из культуральной жидкости актиномицета 5 imbricatus, изучить некоторые его физико-химические и биологические свойства,
- исследовагь особенности основных путей обмена углеводов у S imbncatus в условиях стимуляции биосинтеза имбрицина в присутствии регулятора
Научная новизна исследования. Впервые доказано наличие ауторегуляторной системы антибиотикообразования у культуры S imbncatus - продуцента противогрибкового макролидного неполиенового антибиотика имбрицина
Выявлено влияние условий культивирования продуцента на синтез эндорегулятора, максимальное накопление которого в кж совпадает с максимумом антибиотикообразования и зависит от состава питательной среды, значения рН и интенсивности аэрации
Установлено, что способностью образовывать эндорегуляторное соединение обладают мутантные штаммы актиномицета S imbncatus, как низкоактивные, так и высокопродуктивные варианты Внесение эндорегулятора в агаризовашгую среду Чапека вызывает изменение морфолого-культуральных признаков всех мутантных штаммов продуцента
Доказана возможность увеличения интенсивности образования противогрибковых полиеновых антибиотиков - нистатина, леворина, амфотерицина В под воздействием эндорегуляторного соединения S imbncatus на разных стадиях развития продуцентов указанных антибиотиков Для продуцентов этих антибиотиков эндорегулятор, образуемый кульгурой S imbncatus, является экзогенным стимулятором прорастания спор и/или индуктором дифференциации
Показано, что по ряду физико-химических и биологических свойств выделенный эндорегулятор является новым и отличается от описанных в литературе регуляторов, образуемых актиномицетами
Впервые для продуцента противогрибкового неполиенового
антибиотика имбрицина установлено, что усиление
антибиотикообразования в присутствии эндорегулятора происходит вследствие подавления активности ферментов цикла трикарбоновых кислот, что обеспечивает перераспределение пирувата в пуіях образования поликетидной цепи молекулы антибиотика
Практическая значимость работы. При внесении ауторегулятора, содержащегося в кж S imbncatus, в ферментационную среду синтез имбрицина увеличивается на 40 - 50 %
Составлена ведомость изменений к лабораторному регламенту на производство имбрицина, предусматривающая использование фильтратов кж S imbncatus вместо воды при приготовлении питательных сред Это позволит сократить количество стоков в виде отработанного нативного раствора на стадии фильтрации культуральной жидкости (кж)
Разработан и оптимизирован состав синтетической питательной среды для культивирования S imbncatus, на которой уровень антибиотической активности продуцента близок к уровню синтеза имбрицина на комплексной питательной среде, а при добавлении ауторегулятора достигает максимальных значений активности высокопродуктивного штамма
Показано сохранение высокого уровня антибиотикообразования в течение длительного времени при хранении спорового посевного материала продуцентов имбрицина, леворина, нистатина и амфотерицина В на агаризованных средах с эндорегулятором S imbncatus, что позволяет рекомендовать включение фильтратов кж S imbncatus в состав прописей этих сред
Разработан метод получения и очистки сырца эидорегулятора из культуральной жидкости S imbncalns Выделен сырец со степенью очистки 90,0 %
Результаты представленной работы используются в лабораторном практикуме по дисциплине «Технология биосинтеза ЬАВ» для студентов факультета промышленной технологии лекарств (специальность 240901 -Биотехнология) на кафедре биотехнологии
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Продуцент имбрицина, культура Streptomyces imbneatus образует регулятор, стимулирующий биосинтез собственного антибиотика
-
Применение эидорегулятора S imbneatus на разных стадиях культивирования продуцентов леворина, амфотерицина В и нистатина обеспечивает повышение образования этих антибиотиков
-
Способ выделения и очистки эидорегулятора S imbneatus из культуральной жидкости обеспечивает получение сырца эидорегулятора со степенью чистоты 90 %
-
Эндорегулятор 5 imbneatus изменяет метаболизм продуцента в сторону увеличения синтеза имбрицина
Апробация работы. Результаты исследований обсуждены на заседании кафедр биотехнологии и микробиологии СПХФА, доложены на Международной научной конференции «Фармация в XXI веке инновации и традиции» (Санкт-Петербург, 1999), научно-методической конференции СПХФА «Состояние и перспективы подготовки специалистов для фармацевтической отрасли» (Санк-Петербург, 2004), научной конференции СПХФА «Подготовка кадров для фармацевтической промышленности», (Санкт-Петербург, 2005)
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ Объем и структура работы. Диссертация сосюит из введения, обзора литератур, экспериментальной части, заключения, выводов, списка литературы и приложения Работа изложена на 176 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы, 22 рисунка Библиография включает 191 источник
Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы
Микробные ауторегуляторы составляют достаточно большую группу природных соединений, значительно различающихся по строению и выполняемым функциям. Они описаны в литературе с разной степенью детализации. Значительную часть среди микробных ауторегуляторов составляют половые гормоны (феромоны) и вещества, контролирующие процессы образования и прорастания спор. Низкомолекулярные пептидные половые феромоны были обнаружены у бактерии Streptococcus faecalis [44]. Было показано, что они продуцируются также культурами Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguis, Streptococcus faecium.
К наиболее изученным половым феромонам микроорганизмов относятся так называемые триспоровые кислоты, которые участвуют в регуляции полового цикла большой группы мукоровых грибов, насчитывающей 54 рода и более 300 видов [45].
Своеобразные половые гормоны липопептидной природы найдены у нескольких представителей гетеробазидиальных грибов - Rhodotorula glutinus (родоторуцин A), Tremella mesenterica и Tremella brasiliensis (тремерогены) [1].
К веществам, регулирующим процесс споруляции у сумчатых грибов, относится склероспорин, образуемый фитопатогенным аскомицетом Sclerocinia fructicola [46].
Половые гормоны были обнаружены также у дрожжей рода Saccharomyces [47] . Установлено, что дрожжи S. cerevisiae образуют регуляторы полового цикла - а-фактор и а-фактор, которые способствуют усилению половой конъюгации дрожжевых клеток и образованию, в конечном итоге, диплоидной зиготы. Половые феромоны, идентичные этим факторам, образует ряд близких видов Saccharomyces: S. norbensis, S. carlsbergensis, S. diastaticus, S.oviformis.
Еще одну группу низкомолекулярных микробных ауторегуляторов представляют факторы d, ингибирующие рост клеток и индуцирующие образование цистоподобных клеток. Возможность синтеза ауторегуляторов -индукторов анабиоза, являющихся по своей природе алкилоксибензолами, показана для бактерий Azotobacter chroococcus [48], A. vinelandii [49], Bacillus cereus [50-52], Pseudomonas carboxidoflava [53], P. aurantiaca [54], Saccharomyces cerevisiae [55]. Ауторегуляторные факторы присутствовали в культурах изученных микроорганизмов в виде смесей изомеров и гомологов, отличающихся положением заместителей в ароматическом кольце и длиной алкильного радикала. Факторы di и ёг синтезируют помимо вышеназванных микроорганизмов дрожжи Rhodosporidium toruloides [56], фактор di -Micrococcus luteus [57, 58], простекобактерии Labris monas, а также различные культуры метаноокисляющих и других бактерий [59-62].
Ауторегуляторы роста обнаружены у бактерии Е. coli М-17 - продуцента колибактерина, причем среди выделяемых этой культурой низкомолекулярных соединений имеются как стимуляторы роста, так и вещества, понижающие выживаемость бактерий (УГ-факторы) [63]. Интересным является то, что стимулятор роста имеет поликомпонентный состав, и его основными компонентами являются обычные метаболиты - янтарная и глутаминовая кислоты, метионин, лизин, ацетат. Очень важной представляется в этом комплексе роль ацетата: он способен изменять активность среды. При низких концентрациях ацетат усиливает действие стимуляторов роста и нивелирует влияние ингибиторов, а при высоких - проявляет собственную ингибирующую активность и усиливает ингибирование других веществ [64]. Кроме того, ауторегуляторные соединения Е. coli выполняют определенные коммуникативные функции - обеспечивают рост и развитие не только собственной популяции, но и взаимодействие с другими популяциями или участвуют в поддержании коммуникативных связей с организмом хозяина. При выращивании Е. coli М-17 в смешанных культурах с нормальными симбионтами человека L. acidophilus (Д-75 и Д-76) и В. adolescentis наблюдается стимуляция роста и повышается приживляемость этих бактерий [63]. С практической точки зрения это означает, что низкомолекулярные метаболиты активного штамма Е. coli могут в виде определенной композиции входить в состав пробиотиков и стимулировать рост некоторых представителей нормофлоры человека [63].
При изучении большого количества разнообразных микробных ауторегуляторов значительное число работ выполнены на актиномицетах, выделяющихся среди других прокариот сравнительно большим разнообразием морфологических признаков и синтезируемых веществ. В настоящее время у актиномицетов открыты эндогенные регуляторы, имеющие различное химическое строение и выполняющие различные биологические функции [34, 65].
Одним из наиболее изученных регуляторов актиномицетов является обнаруженный в 1967 г. академиком Хохловым А.С. с соавт. А-фактор, контролирующий морфологическую дифференциацию и синтез стрептомицина у Streptomyces griseus [1].
А-фактор был обнаружен в ходе изучения механизма биосинтеза стрептомицина, проводившегося с использованием мутантов, имеющих нарушения различных стадий процесса. При культивировании низкоактивного (№ 751) и неактивного (№ 1439) мутантов на культуральной жидкости друг друга было показано, что мутант 751 образует специфическое вещество (А-фактор), которое обеспечивает биосинтез стрептомицина неактивным мутантом 1439, утерявшим способность образовывать А-фактор и, как следствие этого, стрептомицин [66]. Последующие исследования показали [67], что все селекционированные высокоактивные штаммы (образующие более 3000 мкг/мл стрептомицина) наиболее характерных продуцентов стрептомицина - S. griseus и S. biciniensis, все выделенные природные изоляты и малоактивные мутанты (образующие 2-400 мкг/мл стрептомицина) продуцируют А-фактор. Из 119 неактивных мутантов только 5 могут образовывать данный ауторегулятор. Из 114 штаммов, не образующих А-фактор, 108 способны синтезировать стрептомицин в присутствии ауторегулятора.
А-фактор, помимо стимулирования биосинтеза стрептомицина, влияет на клеточную дифференциацию, вызывая образование спор у аспорогенных штаммов и изменения в морфологии культур [1].
После обнаружения и выделения А-фактора возник вопрос о специфичности этого регулятора. Исследования О.В. Ефременковой с сотруд. [68, 69] показали, что 57 культур стрептомицетов разной видовой принадлежности образуют А-фактор или другие активные вещества типа А-фактора. Так, например, штамм Streptomyces coelicolor A3 (2) образует смесь биологически активных соединений, близких (но не идентичных) А-фактору - факторы Асі 1 и Асі 2. Обнаружено перекрестное действие регуляторов дифференциации: регуляторы S. coelicolor A3 (2) восстанавливают спорообразование и синтез стрептомицина у А-факторнедостаточного мутанта S. griseus 1439, а А-фактор, образуемый S. griseus, в определенных условиях культивирования влияет на развитие S. coelicolor A3 (2) [70].
Известно, что культуры S. biciniensis штамм JA 8031 и S. cyaneofuscatus штамм ZIMET 43684 также образуют ауторегуляторы, близкие, но не идентичные А-фактору. Одно из них идентично ауторегулятору Асі 2d, образуемому S. coelicolor, а два других являются, вероятно, его гомологами. Образование биологически активных аналогов А-фактора отмечено также у другого штамма S. cyaneofuscatus PRL 1642, продуцента антибиотика валиномицина [71].
Влияние состава питательной среды на образование эндорегулятора культурой s. Imbrjca tus
К 2 мл культуральной жидкости добавляли 5 мл 65%-ого водного раствора изопропилового спирта и проводили экстракцию при непрерывном встряхивании в течение 1 часа на качалке (220 мин _1). Пробу отфильтровывали через бумажный фильтр, фильтрат разводили этиловым спиртом в 50 (100, 200) раз и определяли оптическую плотность полученного раствора при двух значениях длин волн: 240 и 270 нм. В качестве раствора сравнения использовали 96 % этиловый спирт. Содержание антибиотика рассчитывали по формуле: л (Дт-Дт)-67,5-РгР2 п где А - содержание антибиотика в культуральной жидкости, мкг/мл; Д240 - оптическая плотность спиртового раствора при длине волны 240 нм; Д270 - оптическая плотность спиртового раствора при длине волны 270 нм; Pi - разведение пробы при экстракции; ?2 - разведение экстракта; 67,5 - коэффициент пропорциональности, рассчитанный методом наименьших квадратов зависимости между результатами спектрофотометрического и биологического анализов исследуемой пробы [135]. Определение биологической активности имбрицина проводили методом диффузии раствора антибиотика в агаровую среду, расчет активности вели с использованием стандартной кривой [135]. В качестве тест-культуры использовали Candida utilis ЛИА-01, которую вносили в агаризованную среду следующего состава (г/л): пептон - 10,0; дрожжевой экстракт - 30 мл (1,5-2,0% в пересчете на сухое вещество); NaCl - 10,0; глюкоза - 10,0; Na2HP04 - 3,0; КС1 - 30,0; агар-агар - 17,0; вода очищенная до 1 л.
В качестве рабочего стандарта использовали очищенный образец имбрицина с активностью 830 ЕД/мг.
Основной раствор стандартного образца имбрицина готовили в диметилформамиде (ДМФА) из расчета 1 мг/мл. Для построения стандартной кривой из основного раствора готовили ряд разведений в фосфатном буфере с рН 6,0 с таким расчетом, чтобы получить растворы с концентрацией имбрицина 25, 40, 50, 75, 100 ЕД/мл. В качестве контрольной была принята концентрация 50 ЕД/мл. Для имбрицина 1 ЕД антимикробной активности соответствует активности 1 мкг активной части молекулы.
Леворин экстрагировали из культуральной жидкости ДМФА в течение 1 часа при встряхивании. Соотношение объемов экстрагента и культуральной жидкости -9:1. Полученный экстракт фильтровали через бумажный фильтр и разводили 96 % этанолом в 25 раз. Измеряли оптическую плотность полученного раствора при длине волны 380 нм. В качестве раствора сравнения использовали 96 % этиловый спирт. Расчет концентрации леворина в культуральной жидкости проводили по формуле: A = 0,44xl(f хДхРгхР2 где А - концентрация леворина, ЕД/мл; Д - оптическая плотность спиртового раствора при 380 нм; Pi -разведение пробы при экстракции; 2 - разведение в этаноле; 0,44 х 10 - коэффициент для пересчета экстинции на биологическую активность [27].
Нистатин экстрагировали из культуральной жидкости метиловым спиртом в течение 30 минут при встряхивании. Соотношение объемов метанола и исследуемой пробы - 9:1. Полученный экстракт отфильтровывали от мицелия через бумажный фильтр и разводили 96 % этанолом в 50 или 100 раз. Измеряли оптическую плотность полученного раствора при 304,5 и 340 нм. В качестве раствора сравнения использовали 96 % этанол.
Расчет содержания нистатина проводили по формуле: 0,7586-Дш.-Дш 4 378 где А - концентрация нистатина в культуральной жидкости, ЕД/мл; Дзо4,5 Дз4о - оптические плотности спиртовых растворов при 304,5 и 340 нм; Р - разведение в этаноле; 104 - переход к концентрациям в мкг/мл; 2,95 - переводной коэффициент концентрации из мкг/мл в ЕД/мл; 0,7586 и 378 - коэффициенты для пересчета экстинции на биологическую активность [136].
К 1 мл культуральной жидкости S. nodosus добавляли 9 мл диметилсульфоксида (ДМСО) и проводили экстракцию амфотерицина В в течение 30 минут при встряхивании. Экстракт отфильтровывали от мицелия через бумажный фильтр и разводили в 100 или 200 раз 96 %-м этанолом. Пробу тщательно перемешивали и производили измерение оптической плотности полученного раствора на 383 нм. В качестве раствора сравнения использовали 96 % этанол. Содержание амфотерицина В в культуральной жидкости рассчитывали по формуле: А = 6,2хДхР]хР2, где А - содержание амфотерицина В в культуральной жидкости, ЕД/мл; Д - оптическая плотность спиртового раствора при 383 нм; Pi и 2 - разведение пробы при экстракции и в этаноле; 6,2 - коэффициент для пересчета экстинции на биологическую активность.
30 мл отфильтрованной культуральной жидкости S. erythrea помещали в коническую колбу объемом 100 мл, доводили рН до значения 9,2 - 9,8 добавлением 5 %-го раствора едкого натра и приливали 12 мл бутилацетата (бутиловый эфир уксусной кислоты). Содержимое колбы перемешивали круговыми движениями в течение 1 минуты, затем переливали в делительную воронку и отстаивали до полного разделения слоев.
Из верхнего слоя отбирали 2,5 мл бутилацетатного экстракта (БАЭ), помещали в коническую колбу объемом 50 мл, добавляли 2 мл очищенной воды, 5 мл этилового спирта и тщательно перемешивали содержимое. Затем в колбу добавляли 1-2 капли индикатора нейтрального красного и титровали 0,01 н раствором хлористоводородной кислоты до появления ярко-красного окрашивания. Если при титровании раствор мутнел, добавляли еще 5 мл этилового спирта. Замечали объем кислоты, пошедший на титрование. Анализ производили в 3-х повторностях.
Очистка фильтрата, содержащего эндорегулятор s. Imbricatus
Известно, что состав питательных сред является одним из важнейших факторов, влияющих на рост, развитие и образование вторичных метаболитов микроорганизмами - продуцентами БАВ. Понятно также, что и образование регуляторных веществ самим продуцентом может зависеть от компонентного состава среды для культивирования.
В частности, А.С. Хохлов с соавт. [1] отметили, что использование различных по составу сред при выявлении А-фактора у различных по таксономическому положению актиномицетов очень важно. Авторы установили, что некоторые актиномицеты плохо развиваются и не образуют А-фактора на одних средах, тогда как на других наблюдается и хорошее развитие, и образование А-фактора. В связи с этим представляло интерес изучить, в какой мере образование эндорегулятора культурой S. imbricatus зависит от состава используемой ферментационной питательной среды.
В опытах для наработки фильтратов использовали штаммы 9М и 1.5, так как они образовывали наибольшее количество эндорегулятора биосинтеза имбрицина и различались по уровню антибиотикообразования. Продуценты культивировали в течение 96 часов на обедненной среде №5(1 % соевой муки, 1 % глюкозы), регламентной среде № 135 (4 % кукурузной муки, 2 % соевой муки, 5 % глюкозы), кукурузно-соевой среде № 25 (2 % кукурузной муки, 1 % соевой муки, 1 % глюкозы) и получали фильтраты кж. Полученные фильтраты использовали для приготовления питательной среды № 135, на которой и проводили опытные ферментации S. imbricatus. В качестве контроля использовали среду № 135, приготовленную на водопроводной воде. Эксперименты показали, что на средах № 135 и № 25 продуцент образует эндорегулятор, причем в различных количествах (рис. 7).
К - контроль, среда на водопроводной воде; №135, №25, №5 - питательные среды, использованные для получения фильтратов кж с эндорегулятором вариантов 9М и 1.5. Так, выращивание актиномицета с использованием фильтрата кж, полученной на среде № 135, приводило к увеличению выхода имбрицина на 40-50 %, а при использовании фильтрата кж, полученной на среде № 25, выход антибиотика увеличивался не так значительно: всего на 20-25 %. При использовании же фильтрата кж, полученной на среде № 5, содержащей меньшее количество углеводного и азотного питания, накопления эндорегулятора не происходило. Напротив, наблюдали ингибирование антибиотикообразования, и количество имбрицина уменьшалось на 15-20 % по сравнению с контролем. Полученные данные в определенной степени подтверждают существующую сегодня теорию реакций "кворум-сенсинга" у микроорганизмов и, в частности, актиномицетов. Известно, что ауторегуляторы актиномицетов начинают свое действие лишь при достижении определенной концентрации в среде, которая, в свою очередь, зависит от плотности популяции продуцента [10]. На обедненной питательной среде № 5 плотность популяции S. imbricatus, вероятно, не достигает величины, необходимой для накопления эндорегулятора в достаточном количестве.
Для подтверждения этого предположения определили количество образующегося мицелия при культивировании S. imbricatus на выше указанных питательных средах.
В таблице 3 представлены данные по накоплению мицелия при выращивании S. imbricatus на различных питательных средах. Интенсивное образование биомассы наблюдали в первые 12 часов на регламентной среде № 135, несколько меньше - на среде № 25 и совсем незначительный прирост биомассы в этот период роста наблюдали на обедненной среде № 5. В дальнейшем, на 24 - 72 часа культивирования, динамика накопления биомассы была аналогична на средах № 135 и № 25, а на среде № 5 увеличения массы мицелия в этот период практически не происходило. На момент окончания ферментации (96 часов) количество биомассы на средах № 135 и № 25 было выше, чем на среде № 5, на 92 и 39 % соответственно.
Изучение роста s. Imbrica tus в условиях ауторегуляции биосинтеза имбрицина
Внесение объединенных фракций I части хроматограммы (с 1 по 9) в ферментационную среду не приводило к увеличению антибиотикообразования у продуцента S. imbricatus - активность кж в опыте в среднем составляла 2400 ± 100 мкг/мл. Следовательно, в этих фракциях стимулирующее начало отсутствовало. Вещества, содержащиеся во фракциях I части хроматограммы являются высокомолекулярными, о чем свидетельствует их ранний выход из колонки, тогда как ранее (см. раздел 4.2) было показано, что регуляторное соединение имеет относительно небольшую молекулярную массу, поскольку не задерживалось ультрафильтрационными мембранами.
Экспериментальные данные, представленные в таблице 17, показали, что при внесении в питательную среду № 135 фракций Па и Пб части хроматограммы происходит увеличение биосинтеза имбрицина, но в разной степени.
Стимулирующая активность фракций части Па (10 - 14 на хроматограмме) составляла 155 ± 3 % от уровня контроля и, следовательно, в среднем на 13 % превышала стимулирующую активность исходного раствора сырца эндорегулятора. В случае внесения в питательную среду фракций части Пб (15 - 20 на хроматограмме) биосинтез имбрицина увеличивался на 20 ± 2 % по сравнению с контролем, то есть стимулирующая активность фракций этой части составила 85 % от стимулирующей активности исходного раствора сырца. В качестве контроля использовали ферментационную среду № 135 без внесения эндорегулятора. Степень очистки по сухому остатку раствора сырца после гель-фильтрации составила 99,0 % (табл. 17).
Таким образом, после хроматографического разделения раствора сырца эндорегулятора на Сефадексе LH-20 были выделены фракции, обладающие большей стимулирующей активностью, чем сырец эндорегулятора, полученный способом, описанным в разделе 4.3. Очевидно, увеличение стимулирующей активности этих фракций связано с освобождением сырца от различных примесей, которые могли снижать стимулирующее действие эндорегулятора на биосинтез имбрицина.
Провели идентификацию веществ, содержащихся во Па части хроматограммы (фракции 10 - 14), поскольку именно в них содержатся соединения, в большей степени стимулирующие синтез имбрицина. Для идентификации активных соединений, содержащихся в части Па хроматограммы использовали специфические химические реакции и метод ТСХ. Было проверено наличие в растворе после гель-хроматографической очистки белковых соединений и пептидов (по Лоури), аминов, редуцирующих веществ (углеводов), органических кислот и аминокислот - методом ТСХ, как описывалось выше. Результаты представлены в табл. 17.
При изучении химической природы А-фактора, образуемого актиномицетом & griseus J А 5142, в составе молекулы путем хроматографического анализа на пластинах Silufol UV-256, предварительно обработанных 0,1 М фосфатным буфером (рН 7,0) и высушенных при 110С, в системе бензол - диметиловый эфир (1:1) был идентифицирован бутиролактон [166].
Проведен анализ активных фракций части На, используя метод ТСХ на пластинах Sorbfil ПТСХ-П-Х-УФ в указанной выше системе растворителей. При детекции хроматограммы в УФ-свете обнаружили четко светящееся пятно с Rf = 0,26. По литературным данным величина Rf А-фактора в аналогичных условиях равнялась 0,25. Эти данные позволяет высказать предположение о том, что, по-видимому, эндорегулятор, образуемый S. imbricatus, имеет в своем составе лактонную группировку.
На основании полученных данных можно сделать вывод, что эндорегулятор S. imbricatus является низкомолекулярным соединением, имеющим в своей структуре кислотные и аминогруппы, а также, возможно, лактонную группировку. Однозначно исключается белковая природа регулятора, поскольку белки разрушаются при термической стерилизации. Следовательно, отпадает и предположение, что стимулирующая активность фильтратов связана с присутствием в них специфических экзоферментов, определенным образом влияющих на биосинтез имбрицина. Присутствие небольшого количества соединений пептидной природы в растворах фракций Па части хроматограммы указывает на необходимость дальнейшей очистки сырца эндорегулятора, например, методом ВЭЖХ.
Окончательное установление природы эндорегулятора не входило в задачу данной работы. Решение этой проблемы является предметом специального исследования и потребует совместных усилий в этом направлении химиков и биологов.
В ходе экспериментов по выделению эндорегуляторного соединения S. imbricatus показано, что стимулирующая активность очищенного сырца эндорегулятора составляет 155,0 ± 3,0 % , то есть превосходит стимулирующую активность исходного фильтрата кж S. imbricatus. В дальнейшем было проведено биологическое тестирование сырца, то есть определение оптимальной дозы его внесения в питательную среду для максимального стимулирования биосинтеза имбрицина.
В опытах использовали штаммы продуцента имбрицина S. imbricatus 9М, С9 и 1.5. Лиофильно высушенный сырец эндорегулятора вносили при приготовлении ферментационной питательной среды № 135 в количествах от 0,1 до 12,0 мг/мл. В качестве контроля использовали ферментационную среду без внесения сырца регулятора. Экспериментальные данные представлены на гистограмме (рис. 16).
Представленные данные демонстрируют пропорциональную зависимость между величиной стимулирования антибиотикообразования и количеством добавленного сырца эндорегулятора для высокоактивных штаммов S. imbricatus 9М и С9. Максимальное стимулирование биосинтеза имбрицина для этих вариантов было достигнуто при добавлении сырца регулятора в количестве 12 и 8 мг/мл среды и составило 142 + 3 % и 116 ± 2 % для штаммов 9М и С9 соответственно. Для низкоактивного штамма S. imbricatus 1.5. максимально возможное стимулирование образования имбрицина достигалось при добавлении сырца эндорегулятора в количестве 0,1 мг/мл питательной среды и составляло 185 + 3 % по отношению контролю
