Введение к работе
Актуальность проблемы и выбор объектов исследования. С
середины 80-х годов начались интенсивные исследования
взаимодействия нервной, эндокринной и иммунной клеточных
систем на молекулярном уровне. Взаимосвязи этих систем
наиболее ярко проявляются при установлении новых
гомеостатических состояний, связанных со старением, длительным
воздействием стрессирующих условий, употреблением
наркотических веществ, хроническими заболеваниями, а также при изменениях, вызванных введением эндотоксинов и провоспалительных веществ. Для всех названных процессов характерны такие общие явления, как изменение концентраций простаноидов и опиоидов. Установление механизмов регуляции функций различных клеточных систем этими классами веществ позволит понять фундаментальную проблему поддержания гомеостаза организма и сформулировать принципы коррекции различных патологических процессов. Решение этой проблемы выдвигает на первый план комплексные биохимические и физико-химические исследования регуляции жизнедеятельности организма физиологически активными веществами на уровне клеток и взаимодействующих клеточных систем. Такого рода исследования и проводятся в данной работе.
Класс опиоидов включает в себя растительные алколоиды (морфин и другие компоненты опиума) и эндогенные опиоидные пептиды (энкефалины, эндорфины и другие). К настоящему времени достаточно хорошо сформировано представление о том, что опиоиды определяют устойчивость организма к различным дестабилизирующим факторам и ключевым этапом их воздействия на клетки является взаимодействие с рецепторами, однако молекулярные механизмы активации клеток опиоидами и клеточной адаптации к длительному воздействию этих веществ оставались не ясными. Нами выбраны клетки иммунной системы как объект, удобный для изучения взаимодействия различных клеток при прямом действии опиоидов и опиоидные рецепторы головного мозга для исследований динамики регуляции функций нервной системы при длительном введении опиоидов животным.
Класс простаноидов (простагландины, тромбоксаны, простациклины) - это производные полиненасыщенных жирных кислот, важнейшей из которых является арахидоновая. Простаноиды относятся к физиологически активным соединениям с широким спектром биологической активности. Они принципиально важны в системе крови, в репродуктивной системе,
в развитии сердечно-сосудистых заболеваний, воспалительных и иммунных ответах организма. Эти вещества имеют короткое время полупревращения, поэтому количественные характеристики ферментов их синтеза и определяют во многих случаях физиологическую активность простаноидов. Ключевым ферментом биосинтеза простаноидов является простагландин Н синтаза (PGH-синтаза). В последние пять лет, после открытия новой изоформы PGH-синтазы, индуцируемой при активации клеток провоспалительными агентами, количество работ в этой области резко возросло. Широко используемые в фармакологической практике нестероидные противовоспалительные препараты являются ингибиторами фермента PGH-синтаза, и, следовательно, всего биосинтеза простаноидов. Тем не менее, к моменту постановки настоящей работы сведения о механизме образования простаноидов клетками, и их роли в регуляции функций клеточных систем были весьма ограничены. Объектом наших исследований выбраны макрофаги, т.к. синтезируемые ими простаноиды влияют на пролиферацию клеток, секрецию интерлейкинов, антителообразование и т.д., что проявляется в активном участии макрофагов в регуляции процессов воспаления, развитии иммунного ответа.
Возможность существования взаимосвязи опиоидной и простаноидной систем обсуждали еще в 70-х годах, однако эта взаимосвязь на уровне клеток была не изучена, что связано, в первую очередь, с многопараметровостыо исследуемых систем. Для выявления такого рода взаимосвязи нами выбраны клетки иммунной системы, т.к. они позволяют (1) моделировать in vitro ответы иммунной системы; (2) выделять компоненты этой системы и исследовать влияние изучаемых веществ на отдельные типы клеток; (3) иметь значительные количества биоматериала для биохимических исследований. Важно также, что клетки иммунной системы имеют рецепторы к исследуемым классам веществ и отвечают на активацию этих рецепторов изменением клеточных функций.
Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена изучению взаимосвязи действия опиоидов и простаноидов на клетки иммунной системы, исследованию синтеза простаноидов макрофагами с целью понимания основных закономерностей действия этих веществ. Для достижения поставленной цели было необходимо решить ряд фундаментальных и практических задач, основными из которых являлись следующие:
- выявить закономерности действия опиоидов на клетки иммунной
и нервной систем;
- проанализировать участие нервной системы в установлении
новых гомеостатических состояний при наркотической
зависимости и возможность участия иммунной системы в
формировании при этом неспецифических защитных реакций
организма;
осуществить поиск взаимосвязи простаноидов и опиоидов на уровне клеток;
выделить и охарактеризовать PGH-синтазу из макрофагов;
сравнить кинетические закономерности синтеза простаноидов целыми клетками и микросомами;
сравнить динамику синтеза простаноидов клетками из арахидоновой кислоты, вводимой извне или высвобождаемой из внутриклеточных источников;
выявить физиологическое значение процесса синтеза простаноидов макрофагами и возможность его регуляции.
Научная новизна. В диссертационной работе выдвинуто и экспериментально обосновано положение о непосредственном участии клеток иммунной системы в формировании неспецифических защитных процессов при введении в организм разлштых наркотических веществ, выявлены закономерности действия опиоидов на В- и Т-лимфоциты и макрофаги, показано, что опиоиды непосредственно действуют на синтез простаноидов макрофагами. Впервые проведено изучение PGH-синтазы перитонеальных макрофагов мыши. Определен спектр основных простаноидов, синтезируемых макрофагами: PGEj, PGF2a и ТхВ2 и показано, что качественный состав простаноидов, базально синтезируемых клетками, не изменяется под действием различных физиологических агентов. Показано, что, кинетика синтеза простаноидов клетками из арахидоновой кислоты из внешних и внутренних источников различна, для PGH-синтазы в клетке предпочтительна эндогенная форма субстрата - арахидоновой кислоты. Обнаружено, что макрофаги поддерживают соотношение концентраций синтезируемых простагландинов на определенном уровне. Показано, что клетки в состоянии покоя, в отсутствие какого-либо физиологического стимула в процессе культивирования активно метаболизирутот арахидоновую кислоту в простаноиды. Это свидетельствует о том, что одной из функций макрофагов может являться обеспечение постоянной эндогенной концентрации простаноидов в организме.
Изучение физиологической роли эндогенно синтезируемых простаноидов тканевыми макрофагами позволило впервые обнаружить бимодальный концентрационный эффект PGE2 на пролиферативную активность лимфоцитов. Исследование влияния нестероидных противовоспалительных препаратов на базальный синтез простаноидов макрофагами позволило впервые обнаружить явление активации синтеза простаноидов при действии пикомолярных концентраций этих препаратов, которые считались ранее классическими ингибиторами PGH-синтазы. Показана физиологическая значимость этих концентраций в регуляции функций иммунной системы.
Практическая значимость. Сформулирован ряд общих
подходов к проведению биохимических исследований с животными
клетками по схеме: стимул-субстрат-продукт ферментативного
превращения-эффект, что представляет несомненный
практический интерес для изучения механизмов взаимодействия различных классов физиологически активных веществ и целенаправленного поиска новых эффективных лекарственных средств. Разработан метод радиорецепторного анализа на основе лиофилизованных мембранных препаратов для детекции опиоидной активности в субклеточных жидкостях и плазме крови. Предложена схема кинетических экспериментов по исследованию эффектов иммуномодуляторов на пролиферацию лимфоидньгх клеток. Впервые показан противоположный эффект морфина на пролиферацию лимфоидных клеток разных типов, что существенно при терапии рака, когда опиоиды применяются как анальгетики. Оптимизирован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с детекцией флуоресцентных производных простаноидов, присутствующих в биологических объектах в виде многокомпонентной смеси. Метод позволяет проводить индивидуальный анализ этих веществ в биологических образцах с хорошей воспроизводимостью и высокой чувствительностью определения (1*2 нг). При изучении физиологической роли простаноидов, синтезируемых тканевыми макрофагами, показано, что вещества, в терапевтических дозах ингибирующие синтез простаноидов макрофагами, в более низких концентрациях активируют этот синтез. Установлено, что для физиологической регуляции принципиально важно изменение эндогенной концентрации PGEj в любую сторону от базального уровня. Полученные результаты создают научные основы для выяснения механизмов различных заболеваний. Обнаруженное в работе явление активации нестероидныеми противовоспалительными
препаратами в пикомолярных концентрациях синтеза простаноидов клетками интересно не только с точки зрения фундаментальньгх аспектов исследования PGH-синтазы, но и имеет важное практическое значение для фармакологии.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на I Международном конгрессе Международного Общества Нейроиммуномодуляции (1990, Флоренция), на Всесоюзном симпозиуме по биохимии рецепторньгх систем (1990, Таллинн), на IX (1994, Флоренция) и X (1996, Вена) Международных конференциях "Простагландины и сопутствующие компоненты", на IV Европейском конгрессе по клеточной биологии (1994, Прага), на I Европейском конгрессе по фармакологии (1995, Милан), на VI Международной конференции "Современные проблемы биохимии и молекулярной биологии. Наследие А.Н.Белозерского" (1995, Москва), на Международной конференции "Биокатализ-95" (1995, Суздаль), на II съезде биохимического общества РАН (1997, Москва), на XVII Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (1997, Сан-Франциско)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 42 печатных работы.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из расширенного введения, 6 экспериментальных глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (429 наименований). Объем диссертации составляет 245 страниц, в том числе 52 рисунка и 28 таблиц.
