Содержание к диссертации
Введение
1.1. Врожденная дисфункция коры надпочечников. Общие представления 12
1.2. Биосинтез кортикостероидов 14
1.3. Классификация форм врожденной дисфункции коры надпочечников 17
1.3.1. ВДКН при недостаточности StAR-протеина 17
1.3.2. ВДКН при дефиците 20,22-десмолазы (P450scc) 17
1.3.3. ВДКН при недостаточности 3--гидроксистероиддегидрогеназы (3HSD) 18
1.3.4. ВДКН при дефиците 17--гидроксилазы (P450c17) 18
1.3.5. ВДКН при дефиците 11 -гидроксилазы (P450с11) и альдостеронсинтазы (P450c11AS) 19
1.3.6. ВДКН при недостаточности Р450-оксидредуктазы (POP) 20
1.4. ВДКН, обусловленная недостаточностью 21-гидроксилазы (Р450с21) 21
1.4.1. Клинические формы 21-гидроксилазной недостаточности 21
1.4.2. Распространенность ВДКН при дефиците 21-гидроксилазы 23
1.4.3. Белок 21-гидроксилаза: строение, функции. Участие в развитии ВДКН 24
1.4.4. Молекулярно-генетические основы 21-гидроксилазной недостаточности 26
1.4.4.1. Структура, локализация генов CYP21A2 и CYP21P1 26
1.4.4.2. Мутации в гене CYP21A2 28
1.4.4.2.1. Точечные мутации гена CYP21A2 30
1.4.4.2.2. Делеции, конверсии и химерные конструкции 35
1.4.5. Генофенотипическая корреляция 36
1.4.6. Диагностика недостаточности 21-гидроксилазы 39
1.4.7. Неонатальный скрининг новорожденных на ВДКН 42
2.1. Материал для исследования 45
2.2. Методы исследования 45
2.2.1. Выделение геномной ДНК 45
2.2.2. Полимеразная цепная реакция 47
2.2.3. Рестрикционный анализ 52
2.2.4. SSCP-анализ 52
2.2.5. Определение нуклеотидной последовательности 53
2.2.6. Анализ внегенных STR-локусов 54
2.2.7. Методы статистической обработки 54
3.1. Анализ частоты встречаемости ВДКН в Республике Башкортостан 56
3.2. Анализ гена CYP21A2 у больных ВДКН из РБ 56
3.2.1. Скрининг «классических» мутаций гена 21 -гидроксилазы 57
3.2.2. Поиск изменений нуклеотидной последовательности гена CYP21A2 67
3.2.3 Кластеры мутаций гена CYP21A2 73
3.2.4. Анализ полиморфных вариантов гена CYP21A2 у больных ВДКН и в группе контроля из РБ 75
3.3. Анализ корреляции генотип-фенотип 90
3.4. Анализ внегенных STR-локусов D6S2670 и D6S273 в семьях больных ВДКН и здоровых семьях 97
3.4. Практическое применение полученных результатов молекулярно- генетического изучения недостаточности 21-гидроксилазы 109
Заключение 113
Выводы 118
Список литературы 120
- ВДКН при недостаточности StAR-протеина
- Клинические формы 21-гидроксилазной недостаточности
- Полимеразная цепная реакция
- Скрининг «классических» мутаций гена 21 -гидроксилазы
Введение к работе
Актуальность проблемы. Врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН) - группа аутосомно-рецессивных заболеваний, обусловленных нарушением секреции кортикостероидов вследствие врожденного дефекта ферментов, ответственных за их биосинтез (Katsumata et al, 2010; Wedell, 2011; Mnif, 2013). В 95% случаев ВДКН обусловлена недостаточностью фермента 21-гидроксилаза вследствие мутаций в кодирующем его гене CYP21A2 (White et al, 2000). Недостаточность 21-гидроксилазы классифицируется на 2 основные формы: «классическая» (сольтеряющая (СТФ) и простая вирильная (ПФ)), основными признаками которой являются внутриутробная вирилизация и нарушение солевого обмена, и «неклассическая», проявляющаяся в постнатальном периоде. Частота ВДКН варьирует от 1:27 до 1:42000 в зависимости от формы и рассматриваемой популяции (Ambroziak, 2010; Li-Ping Tsai, 2011).
Из-за высокой распространенности и тяжести клинических проявлений ВДКН включили в программу неонатального скрининга новорожденных более чем в 30 странах мира, в том числе с 2006 года и в России. Введение массового обследования новорожденных позволяет диагностировать ВДКН в неонатальный период, что с помощью своевременного и адекватного лечения дает возможность предотвратить развитие таких серьезных осложнений, как сольтеряющий криз и связанные с ним летальные исходы и длительная госпитализация, преждевременное половое развитие и бесплодие.
Ввиду сложности диагностики ВДКН и ее неточности при использовании биохимических методов во всем мире активно ведется исследование молекулярной природы данного заболевания. Идентификация мутаций гена 21-гидроксилазы и последующая оценка индивидуального генетического риска на их основе имеют большое значение для разработки дифференцированного подхода к профилактике и лечению ВДКН, а также внедрения в практику медико-генетической службы. Использование высокополиморфных маркеров, локализованных в HLA-локусе рядом с геном 21-гидроксилазы и сцепленных с ним, позволяет более эффективно проводить пренатальную молекулярно-генетическую диагностику ВДКН и выявлять гетерозиготных носителей в семьях высокого риска с целью профилактики данного
заболевания, что, в свою очередь, значительно улучшает медико-генетическое консультирование семей с ВДКН.
Цель работы: изучение генетической природы врожденной дисфункции коры надпочечников, обусловленной недостаточностью 21-гидроксилазы, и разработка подходов ее ДНК-диагностики.
Задачи исследования:
1. Провести скрининг наиболее распространенных «классических» мутаций гена
21-гидроксилазы у больных с ВДКН из Республики Башкортостан.
2. Провести поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене 21-
гидроксилазы у больных с ВДКН из Республики Башкортостан.
3. Определить молекулярно-генетические особенности классических форм
ВДКН вследствие дефицита 21-гидроксилазы у больных в Республике Башкортостан.
-
Провести сравнительный анализ распределения частот аллелей и гаплотипов внегенных STR-локусов (D6S2670, D6S273) на нормальных и мутантных хромосомах в семьях больных с ВДКН и здоровых семьях.
-
Проанализировать неравновесие по сцеплению между мутациями гена 21-гидроксилазы и аллелями и гаплотипами изученных STR-локусов; оценить их значимость и возможность использования для косвенной ДНК-диагностики ВДКН.
6. Разработать оптимальный алгоритм молекулярной диагностики ВДКН в
Республике Башкортостан.
Научная новизна. Впервые в Республике Башкортостан проведено молекулярно-генетическое исследование всей кодирующей последовательности и экзон-интронных соединений гена 21-гидроксилазы методом SSCP анализа с последующим секвенированием. Впервые обнаружена мутация с.1151 1153delACT (p.Ile384del) гена CYP21A2. Получены данные о спектре и частоте мутаций в гене 21-гидроксилазы у больных ВДКН из Республики Башкортостан. Для каждой классической формы ВДКН показан свой спектр диагностически значимых мутаций гена 21-гидроксилазы. Впервые проведен анализ распределения частот аллелей и гаплотипов высокополиморфных локусов D6S2670 и D6S273, локализованных рядом с геном CYP21A2, в семьях больных ВДКН и здоровых семьях и определена их значимость для диагностики недостаточности 21-гидроксилазы. Впервые проведена
оценка информативности семей с ВДКН из Республики Башкортостан, основанная на комплексном исследовании мутаций в гене CYP21A2.
Научно-практическая значимость. В результате молекулярно-генетического анализа гена 21-гидроксилазы определена информативность изученных семей с ВДКН из Республики Башкортостан для пренатальной молекулярно-генетической диагностики и выявлены гетерозиготные носители. Полученные данные о частоте и спектре мутаций и полиморфных вариантов в гене CYP21A2 внесли определенный вклад в познание генетической природы недостаточности 21-гидроксилазы и позволили разработать поэтапную схему молекулярно-генетического обследования семей с ВДКН, которая дает возможность повысить эффективность медико-генетического консультирования и профилактики данного заболевания в Республике Башкортостан. В 7 семьях с ВДКН определен тип мутационных повреждений и проведена пренатальная диагностика дефицита 21-гидроксилазы.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на II и III школе-конференции по физико-химической биологии и биотехнологии (Уфа, 2011; 2012); международной конференции Human Genome Meeting (Dubai, 2011); European Human Genetics Conference (Ntirnberg, 2012; Paris, 2013); V Всероссийской конференции с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий» (Санкт-Петербург, 2012); Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Актуальные проблемы генетики человека, животных растений и микроорганизмов» (Уфа, 2012); V Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома» (Звенигород, 2012); Всероссийской молодежной научно-практической конференции (Уфа, 2013); 8th ISABS Conference (Zagreb, 2013); конференции ВОГиС «Проблемы генетики и селекции» (Новосибирск, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, из них 2 - статьи в журналах из Перечня ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы из 140 источников, в том числе 5
отечественных и 135 зарубежных. Иллюстративный материал содержит 47 рисунков и 15 таблиц.
ВДКН при недостаточности StAR-протеина
Дефицит StAR-протеина приводит к нарушению переноса холестерина на внутреннюю мембрану митохондрий и тем самым к блокаде первого этапа биосинтеза стероидных гормонов в надпочечниках и гонадах и, соответственно, к развитию наиболее тяжелой формы ВДКН - врождённой липоидной гиперплазии коры надпочечников (OMIM#201710) с липоидными отложениями в клетках коры надпочечников и выраженной минерало- и глюкокортикоидной недостаточностью у детей обоего пола в раннем возрасте, ведущей к летальному исходу без своевременно начатого лечения (Demirci et al., 2008). Кроме того, у представителей мужского пола наблюдаются признаки феминизации (ложный мужской гермафродитизм), обусловленные недостаточным количеством вырабатываемых андрогенов в период внутриутробного развития (Greger et al., 1987). Данное заболевание обусловлено мутациями в гене StAR (ID: 6770), локализованном на хромосоме 8 в области 8p11.23 и кодирующем белок StAR, и распространено, в основном, в Японии, Корее и Палестине (Bose et al, 2000; Demirci et al., 2008).
Недостаточность 20-22-десмолазы (OMIM#613743), катализирующей реакции 22- и 20-гидроксилирования и расщепления связи С20–С22 с удалением боковой цепи холестерина в коре надпочечников и половых гонадах, нарушает преобразование холестерина в прегненолон на первом этапе стероидгенеза (Greger et al., 1987). В зависимости от степени дефицита данного фермента наблюдаются различные клинические проявления: от спонтанного абортирования эмбрионов или преждевременных родов вследствие недостатка прогестерона для поддержания беременности, тяжелых форм надпочечниковой недостаточности с сольтеряющими кризами и смертью в раннем возрасте до легких форм со стертыми клиническими признаками. Недостаточность 20-22-десмолазы имеет сходную клиническую картину с врождённой липоидной гиперплазией коры надпочечников, в том числе и признаки феминизации у мальчиков, но у больных нет гиперплазии коры надпочечников, а наблюдается уменьшение размеров надпочечников и половых желез. Данная форма ВДКН встречается крайне редко, составляет менее 1% от всех случаев ВДКН и обусловлена мутациями в гене CYP11A1 (ID: 2580), локализованном на хромосоме 15 в области 15q23-24 (Demirci et al., 2008). 1.3.3. ВДКН при недостаточности 3-р-гидроксистероиддегидрогеназы (3fiHSD) ВДКН, обусловленная дефицитом 3--гидроксистероиддегидрогеназы (OMIM #201810), является одной из наиболее редко встречающихся форм, при которой наблюдается нарушение синтеза минералокортикоидов, глюкокортикоидов и половых гормонов. Клинический спектр данной формы ВДКН достаточно широк: от тяжелых форм минерало- и глюкокортикоидной недостаточности, признаков гермафродитизма у детей обоего пола до бессимптомных форм (Greger et al., 1987; Demirci et al, 2008; Krone et al, 2009). Процент летального исхода в раннем возрасте очень высокий.
Существует две высокогомологичные изоформы 3b гидроксистероиддегидрогеназы 1 и 2 типа, которые кодируются генами HSD3B1 (GeneID: 3283) и HSD3B2 (GeneID: 3284), локализованными на хромосоме 1 в области 1p13.1. Данная форма ВДКН, в основном, обусловлена мутациями в гене HSD3B2 (Krone et al, 2009).
Данная форма заболевания составляет около 1% всех случаев ВДКН (Krone et al., 2009). Нарушенный синтез 17--гидроксилазы (17OHD, OMIM #202110) является причиной недостаточности глюкокортикоидов и половых стероидов, а также причиной накопления минералокортикоидных предшественников. В результате развивается артериальная гипертензия и гипокалиемия, недостаточная вирилизация у новорожденных мальчиков и первичная аменорея и признаки гипогонадизма у девочек (Greger, 1987; Auchus, 2001; Krone et al, 2009; Coeli et al., 2010). К дефициту 17--гидроксилазы приводят мутации в кодирующем ее гене CYP17A1 (GenelD: 1586), локализованном на 10 хромосоме в области 10q24.3 и состоящем из 8 экзонов. Выявлено свыше 70 мутаций, спектр которых характерен для каждого региона. Только для нескольких популяций показаны мажорные мутации, отвечающие за более чем 60% случаев данного заболевания (Krone et al., 2009).
Около 5-8% случаев ВДКН являются результатом недостаточности 11-гидроксилазы (11OHD, OMIM#202010), участвующей в превращении 11-дезоксикортизола в кортизол, финальной стадии биосинтеза кортизола. Дефицит 11-гидроксилазы приводит к существенному избытку 11-дезоксикортикостерона, обладающего умеренными минералокортикоидными свойствами и способствующего задержке натрия и хлоридов в организме. Клиническая картина недостаточности 11-гидроксилазы представлена значительной артериальной гипертензией с возможным развитием гемипареза и вторичных изменений сосудов внутренних органов в раннем возрасте, гиперандрогенией, вирилизацией и преждевременным половым развитием у представителей обоего пола. Манифестация процесса наступает после 3-х лет, но бывает и более раннее начало (Merke et al, 1998; Demirci et al, 2008; Krone, 2009).
Частота встречаемости данной формы заболевания составляет 1:100000-200000 новорожденных в Европе, преобладая у марокканских евреев (1:5000-7000) (Demirci, 2008; Krone, 2009). Недостаточность 11-гидроксилазы вызвана мутациями в гене CYP11B1 (GeneID: 1584), локализованном на хромосоме 8q22, состоящим из девяти экзонов и кодирующим белок из 503 аминокислотных остатков. В настоящее время выявлено более 50 мутаций в гене CYP11B1, часть из которых являются результатом генных конверсий между ним и расположенным на расстоянии около 2400 кб высокогомологичным геном CYP11B2 (Gene ID: 1585), локализованном в области 8q24.3 и кодирующим фермент цитохром P450-альдостеронсинтазу (P450c18/P450aldo/P450c11AS), которая также участвует в биосинтезе стероидных гормонов, катализируя 3 последних этапа преобразования холестерина в альдостерон (Curnow et al., 1998; Krone N. et al., 2005). Недостаточность альдостеронсинтазы (OMIM#203400) встречается редко, составляет менее 1% от всех ВДКН и приводит к накоплению 11 дезоксикортикостерона и кортикостерона, дефициту альдостерона и, соответственно. В результате развивается гипернатриемия, гипокалиемия, гиперволемия, гипертензия, обусловленные избыточным накоплением 11 дезоксикортикостерона, а также другие клинические проявления, характерные для ВДКН. Без своевременно начатого лечения больные умирают в первый год жизни.
Клинические формы 21-гидроксилазной недостаточности
В зависимости от клинической картины врожденную дисфункцию коры надпочечников, обусловленную недостаточностью 21-гидроксилазы, классифицируют на две формы: классическую и неклассическую. Классическая форма в свою очередь подразделяется на сольтеряющую, которая является более распространенной и встречается в 75% случаев, и простую вирильную (25%) (White et al., 2000).
При простой вирильной форме (ПФ) ВДКН ферментативная активность 21-гидроксилазы составляет 1-2%. Влияние избытка андрогенов в период между 8 и 12 неделями внутриутробного развития приводит к значительной вирилизации наружных половых органов у индивидов женского пола при нормальном развитии внутренних половых протоков, тогда как подобное воздействие после 12-14 недель приводит лишь к легкой степени вирилизации. У мальчиков вирилизация проявляется увеличением и гиперпегментацией гениталий, повышенным оволосением туловища и бедер. В постнатальный период у индивидов обоего пола отмечается дальнейший процесс вирилизации, быстрый соматический рост, раннее закрытие эпифизарных зон, ложное преждевременное половое развитие, акне (воспаление сальных желёз), гирсутизм (избыточный рост терминальных волос у женщин по мужскому типу), снижение фертильности и бесплодие (White et al., 2006; Demirci et al., 2008; Huynh et al., 2009; Ambroziak et al., 2010; Shaw, 2010).
Сольтеряющая форма (СТФ) ВДКН характеризуется полной потерей ферментативной активности 21-гидроксилазы. Наряду с признаками вирилизации у больных с данной формой заболевания отмечается тяжелая недостаточность кортизола, неспособность к синтезу достаточного количества альдостерона, необходимого для поддержания натриевого гомеостаза. При тяжелых формах у больных на первых четырех неделях жизни наблюдается гипонатриемия, гиперкалиемия, ацидоз, развивающиеся в надпочечниковый криз, который может закончиться сосудистым коллапсом и летальным исходом. Другие симптомы крайне неспецифичны и включают апатию, рвоту, потерю аппетита и уменьшение массы тела (Belgorosky et al., 2003; Gozzi et al, 2005; Dessinioti et al., 2009; Huynh et al., 2009; Trakakis et al., 2009; Ambroziak et al., 2010; Shaw, 2010; Al-Agha et al., 2011).
При неклассической форме (НФ) ВДКН сохраняется нормальная секреция минералокортикоидов и 20-25%-ая активность 21-гидроксилазы. Клинические признаки проявляются в пубертатном возрасте, постепенно прогрессируя, либо отсутствуют. Как правило, отсутствие симптомов при неклассической форме ВДКН наблюдается, в основном, у мужчин (Levinel et al., 1980; Temeck et al., 1987; Balducci et al., 1994; Bidet et al., 2009; Witchel, 2013). В многочисленных исследованиях наиболее общими проявлениями заболевания у женщин являются преждевременное половое развитие, акне (33%), гирсутизм (59%), олигоменорея (нарушение менструального цикла) (54%), выражающееся в короткой продолжительности менструации, снижение фертильности/бесплодие (Levinel et al., 1980; Temeck et al., 1987; Oberfield et al., 1990; Balducci et al., 1994; Dacou-Voutetakis et al., 1999; Moran et al., 2006; Dessinioti et al., 2009; Huynh et al., 2009; 2009; Trakakis et al., 2009; Ambroziak et al., 2010; Concolino et al., 2010; Al-Agha et al., 2011; Witchel, 2013), однако, распространены и случаи бессимптомного течения заболевания. Так, в одном из исследований при анализе генофенотипической корреляции обнаружены клинические проявления заболевания лишь у 9 пациентов среди 161 больных с НФ ВДКН (Witchel, 2013).
Частота «классической» формы ВДКН варьирует в зависимости от этнической принадлежности и географической зоны - от 1:280 у эскимосов Аляски до 1:42000 у афро-американцев США, составляя в среднем 1:15000 согласно данным скрининга 6.5 млн. новорожденных в 13 странах мира (таблица 1) (Levo et al., 1997; van der Kamp et al., 2004; Ambroziak et al., 2010; Tsai et al., 2011; Ariachery, 2013). При этом 60% случаев с классической формой дефицита 21-гидроксилазы приходится на сольтеряющую форму, а 33% - на простую вирильную, а частота гетерозиготного носительства – 1:60 (Concolino et al., 2010). В России «классическая» форма ВДКН встречается со средней частотой 1:8662 новорожденных (Новиков, 2008), в Республике Башкортостан - 1:8974 (Рамова, 2010).
Полимеразная цепная реакция
Для анализа 11 наиболее распространенных «классических» мутаций гена CYP21A2, обусловленных генными рекомбинациями между активным геном и псевдогеном локуса CYP21: large gene deletion (delA2), large gene conversion (LGC), p.Pro30Leu, I2splice, G110del8nt, p.Ile172Asn, E6cluster, p.Val281Leu, p.Gln318X, p.Arg356Trp и p.Pro453Ser применены различные виды ПЦР на амплификаторах «Eppendorf» (Германия) и «BioRad» (США) с использованием праймеров, описанных ранее (Evgrafov et al., 1995; Lee et al., 2000; Pinterova et al., 2000; Lee, 2001; Stikkelbroeck et al., 2003), и, если это было необходимо, с последующим рестрикционным анализом.
ПЦР проводили в 25 мкл общего объема смеси, содержащей 25 мМ Tris-HCl, pH 8.4, 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 0.2 мМ четырех основных dNTP, 5 пМ каждого из праймеров и 0,3 единицы Taq ДНК-полимеразы по схеме: начальная денатурация (94оС, 5 мин.); 27 циклов амплификации со следующими параметрами: 1) денатурация - 94оС, 40 секунд; 2) отжиг – 57-69оС, 40 секунд; 3) синтез - 72оС, 1 минута; после чего инкубировали 5 минут при 72оС. Перечень исследуемых локусов, последовательности праймеров, размеры амплифицируемых фрагментов приведены в таблице 2. Таблица 2 Праймеры, использованные в работе, и условия амплификации
Делецию около 30 тпн (delA2) и большие конверсии (LGC) анализировали с помощью полуколичественной ПЦР с праймерами, позволяющими амплифицировать фрагмент, содержащий 3 экзон, как активного гена CYP21A2, так и псевдогена CYP21P (Evgrafov et al., 1995). В 3 экзоне псевдогена локализована делеция размером 8 пн, поэтому при амплификации этого экзона обоих генов образуются 2 фрагмента: первый размером 150 пн соответствует пседогену, второй - 158 пн – активному гену. После проведения электрофореза в 8% ПААГ (исходное соотношение акриламида и метиленбисакриламиду 29:1.3) и окраски бромистым этидием сравнивалась интенсивность свечения при УФ обоих фрагментов. Соотношение ген-псевдоген 1:2 (количество копий) свидетельствует о делеции гена в гетерозиготном состоянии, 1:3 – о возможной конверсии между этими двумя генами, наличие только одного фрагмента 150 пн – о делеции или конверсии в гомозиготном состоянии. Так как интенсивность свечения и размер фрагмента определяется субъективно, то точно идентифицировать вид мутаций с помощью этого метода невозможно. Необходимо подтверждение полученных результатов с помощью блот гибридизации по Саузерну или мультиплексной амплификации лигированных фрагментов MLPA (multiplex ligation dependent probe amplification), которая позволяет определять число копий гена. Учитывая, что и конверсия (LGC), и делеция (delA2) являются мутационными повреждениями гена CYP21A2, приводящими к нулевой ферментативной активности 21-гидроксилазы, мы эти мутации не стали подразделять, обозначив их как delA2orLGC.
Так как все «классические» точковые мутации гена CYP21A2 являются результатом их переноса с псевдогена на ген вследствие генных конверсий, то для их идентификации в активном гене необходимо было амплифицировать только фрагменты активного гена. Для этого были использованы праймеры, позволяющие синтезировать только активный ген вследствие того, что в состав одного из них включена последовательность нуклеотидов, комплементарная делеции 8 пн в 3 экзоне псевдогена (Lee, 2001) (таблица 2).
Для идентификации мутации p.Ile172Asn применили аллель специфичную ПЦР с праймерами, с помощью которых амплифицируются фрагменты, соответствующие как норме, так и мутации. Кроме того, обязательно использовали контрольный праймер, который в случае отсутствия мутации или нормы показывает наличие амплификации. Амплификацию проводили в 2-х пробирках с использованием 4 праймеров.
Анализ мутации I2splice проводили методом ПДРФ-анализа, амплифицируя фрагмент активного гена в 124 пн, который гидролизировали эндонуклеазой рестрикции MwoI (таблица 3). Мутации p.Val281Leu, E6cluster, p.Gln318X и p.Arg356Trp исследовали с помощью амплификации фрагмента активного гена размером 1490 пн с последующим рестрикционным анализом соответствующей эндонуклеазой рестрикции (таблица 3). Для определения мутации p.Pro30Leu амплифицировали фрагмент активного гена в 770 пн и подвергали гидролизу эндонуклеазой AciI (таблица 3). Мутация p.Pro453Ser гена CYP21A2, для идентификции которой нет соответствующей рестриктазы, диагностирована с помощью метода PCR-ACRS (amplification-created restriction site), при котором используются модифицированные олигонуклеотидные праймеры, реконструирующие сайты рестрикции для определенных эндонуклеаз. Для выявления мутации p.Pro453Ser был амплифицирован фрагмент ДНК размером 162 пн с помощью прямого праймера, фланкирующего начало 7 экзона, и обратного праймера, который создает сайт рестрикции для эндонуклеазы RsaI (таблица 2, 3) (Осиновская, 2006). Данная мутация также приводит к появлению сайта рестрикции: при гетерозиготном носительстве выявляются фрагменты размером 162, 140 и 22 пн, при гомозиготном – 140 и 22 пн. Высокая гомология CYP21A2 и CYP21A1P препятствует проведению анализа гена CYP21A2 путем прямого использования геномной ДНК и соответствующих праймеров. Однако существующие различия в последовательностях псевдогена и активного гена позволяют получить фрагмент последнего с помощью ПЦР с использованием CYP21A2 специфичных праймеров (таблица 2) (Charfeddine et al., 2012). Дальнейший анализ осуществляли с использованием разведенного амплификата активного гена (1:500) в 25 мкл общего объема реакционной смеси и праймеров, фланкирующих экзоны и промотерную область активного гена (таблица 3). Для определения мутаций и полиморфных вариантов гена CYP21A2, являющихся однонуклеотидными заменами, в выборке ВДКН и в группе здоровых индивидов использовали метод рестрикционного анализа: амплифицированный фрагмент ДНК подвергали гидролизу соответствующей эндонуклеазой рестрикции (таблица 3). Гидролиз амплифицированного фрагмента ДНК проводился в стандартных условиях: к 10 мкл амплификата добавляли 2.5 единицы фермента и инкубировали при 37оС не менее 12 часов или 65оС не менее 4 часов. В результате этой реакции амплифицированный фрагмент подвергался ферментативному гидролизу. Полученные гидролизаты разделяли электрофорезом в 7-8%-ном полиакриламидном геле (исходное соотношение акриламида и метиленбисакриламиду 29:1), окрашивали бромистым этидием и визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете.
Анализ гена CYP21A2 на присутствие в нем мутаций, приводящих к развитию ВДКН, проводили методом анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP – single strand conformation polymorphism), основанным на различной электрофоретической подвижности однонитевых фрагментов ДНК, различающихся вследствие нуклеотидных замен по конформации молекул, в неденатурирующем полиакриламидном геле (Orita, 1989). Для проведения SSCP-анализа предварительно амплифицировали промоторный регион и экзоны гена CYP21A2 с использованием специфичных праймеров (таблица 2), после чего полученные амплификаты подвергались щелочной денатурации: к 6 мкл амплификата добавляли 2 мкл смеси из 0.5 М NaOH и 0.05М ЭДТА и нагревали в течение 15 минут при температуре 42С, после чего к пробам добавляли 2 мкл формамида, смешанного с 0.5% бромфенолового синего и 0,5% ксиленцианола, и наносили на 8-10% полиакриламидный гель (исходное соотношение акриламида/метиленбисакриламида 29:1.3 или 29:1) с 5% глицерином. В качестве электрофорезного буфера использовали 0.5 ТВЕ. Окраску геля проводили в течение 15 минут 1% азотно-кислым серебром (AgNO3). Далее гель промывали дистиллированной водой и опускали в раствор, содержащий 0.75% формальдегид и 3% гидроксид натрия (NaOH). После проявления гель промывали дистиллированной водой.
Скрининг «классических» мутаций гена 21 -гидроксилазы
Учитывая, что 95% мутаций, приводящих к различным формам недостаточности 21-гидроксилазы, происходят в результате рекомбинаций между активным геном CYP21A2 и псевдогеном CYP21A1 вследствие высокой гомологии их нуклеотидной последовательности был проведен скрининг данных мутаций («классических») у больных ВДКН из РБ. Распределение выявленных мутаций на хромосомах различной этнической принадлежности носило равномерный характер, достоверно значимых различий не обнаружено.
Протяженные делеции и крупные генные конверсии delA2orLGC гена CYP21A2 приводят к образованию нефункциональных химерных конструкций ген-псевдоген и во многих популяциях встречаются у больных с классической формой заболевания, а в гомозиготном состоянии, как правило, только у больных с сольтеряющей формой заболевания (Chang et al., 1995; White et al., 2000; Lee, 2005). В Республике Башкортостан делеция/конверсия гена delA2orLGC определены с наибольшей частотой 33.26%, в том числе у 38-и больных с СТФ (42.96%), из них у 17-ти в гомозиготном состоянии, у 11-ти с ПФ (20.37%) и у 5-ти больных с неклассической формой ВДКН (15.3%) в компаунд-гетерозиготном состоянии с другими мутациями (рисунок 7; таблица 4, 5). По литературным данным, у больных из европейских популяций частота делеции/конверсии delA2orLGC выше 20%, варьируя от 22.22% у больных из Словакии до 45,00% - из Великобритании (таблица 6) (Stikkelbroeck et al., 2003; Bas et al., 2008; Chang et al., 2011), за исключением Испании (5.64%) и Франции (19.00%) (Stikkelbroeck et al., 2003; Loidi et al., 2006). В Японии делеция/конверсия гена delA2orLGC обнаружена с незначительной частотой 1.47%, тогда как в Китае – со среднеевропейской частотой 27.00% (Chang et al., 2011).
У больных из Индонезии и Бразилии данные мутации не идентифицированы (Campos et al., 2009; Goossens et al., 2009). Во всех изученных популяциях частота делеции/конверсии преобладала у больных с СТФ. Частота этих мутаций и их распределение между разными формами ВДКН у больных из Республики Башкортостан достоверно не отличалась от средней частоты и распределения у больных из стран Западной Европы.
Мутация сплайсинга I2splice (c.293-13A/C G) гена CYP21A2 является одной из наиболее частых мутаций, приводящих к развитию тяжелой сольтеряющей формы ВДКН вследствие преждевременного сплайсинга интрона и сдвига трансляционной рамки считывания (Higashi et al., 1988; Higashi et al., 1991; New, 2006). Однако в 20% случаев I2splice гена CYP21A2 встречается у больных с простой вирильной формой заболевания, что, возможно, связано с синтезом у данных пациентов некоторого количества активного белка за счет нормального сплайсинга (New, 2006). В нашем исследовании I2splice идентифицирована у 24-х больных с СТФ ВДКН (23.44%) и у 4-х больных с ПФ заболевания (8.65%), общая частота составила 16.05%, тогда как в других популяциях мира частота данной мутации, в основном, превышает 20%-ый порог, за исключением некоторых стран (рисунок 8, таблица 4-6). Наиболее низкая частота мутации сплайсинга I2splice гена CYP21A2 наблюдалась в Италии (6.12%) и Испании (7.64%) (Loidi et al., 2006; Bas et al., 2009). У больных из Словакии данная мутация отвечала за 50% мутантных хромосом (Dolzan et al., 2005). Частота мутации I2splice гена CYP21A2 в выборке больных из РБ была чуть выше, чем в Финляндии (11.80%), Индонезии (13.30%) и Бразилии (14.30%) (таблица 6) (Stikkelbroeck et al., 2003; Campos et al., 2009). Данная мутация, в основном, диагностируется у больных с СТФ, у больных с ПФ и НФ она встречается в компаунд-гетерозиготном состоянии с мутациями, ведущими к более легким формам заболевания, что соответствует и полученными нами данным.
Мутация p.Ile172Asn (c.515T A) гена CYP21A2 с заменой аминокислотного остатка изолейцина на аспарагин приводит к вирилизации наружных половых органов без нарушения электролитного баланса и ассоциирована, главным образом, с ПФ ВДКН и лишь в единичных случаях встречается у больных с сольтеряющей формой (Lobato et al., 1999; Wilson, 2006; Soardi, 2008). В РБ данная мутация идентифицирована на 8.14% хромосом, в том числе у 14-ти больных с ПФ ВДКН с частотой 30.77%, у 1-го больного с НФ заболевания (2.78%) и 1-го больного с СТФ (0.40%) в кластере с мутациями, полностью инактивирующими фермент 21-гидроксилаза (рисунок 11, таблица 4, 5). В целом, частота встречаемости мутации p.Ile172Asn в РБ оказалась ниже средней частоты популяций мира (12.54%), где она варьирует от 1.02 в Италии до 29.40% в Финляндии (таблица 6).
Мутация p.Val281Leu (c.841G T) гена CYP21A2, характеризующаяся заменой валина на лейцин в 281 положении аминокислотной последовательности, приводит к развитию неклассической формы ВДКН. В результате данной мутации активность 21-гидроксилазы сохраняется на 20-50% (Tusie-Luna et al., 1990; Tajima et al, 1997; Wilson et al., 2006). В РБ мутация p.Val281Leu гена CYP21A2 обнаружена только у 7-и больных с НФ ВДКН, что составило 3.49% от общего числа больных (рисунок 12, таблица 4, 5). Частота данной мутации в популяциях мира колеблется в широких пределах: от 0% до 63.47%, достигая своего максимального значения в выборке больных из Испании .
