Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Характеристика популяционно-генетических исследований в целом 8
1.2. Популяционно-генетическая характеристика изученных ираноязычных и 10 восточно-славянских групп
1.2.1. Историко-демографические сведения 10
1.2.2. Характеристика иранской и славянской групп индо-европейской языковой семьи. 12
1.2.3. Характеристика исследуемых групп по однородительским генетическим маркерам . 14
1.2.4. Полиморфизм молекулярно-генетических маркеров в иранских популяциях 17
1.3. Структурно-функциональные характеристики исследуемых генов 18
1.3.1. Ген алкогольдегидрогеназы ADH1B 19
1.3.2. Ген лактазы LCT 20
1.3.3. Ген хемокинового рецептора CCR5 22 1.3. 4. Ген аполипопротеина Е АРОЕ 24 1.3. 5. Ген ангиотензиногенаЛСГ 27
1.3.6. Ген метилентетрогидрофолатредуктазы MTHFR 28
1.3.7. Ген рецептора дофамина DRD4 28 1.3.7. Ген гидролазы амидов жирных кислот FAAH 29
2. Материалы и методы 31
2.1. Материалы для исследования 31
2.2. Приборы и реактивы 32
2.3. Методы 33
2.3.1. Условия хранен ия биологических образцов 33
2.3.2. Выделение ДНК из цельной крови 34
2.3.3. Электрофоретический анализ ДНК в горизонтальном агарозном геле 35
2.3.5. Полимеразная цепная реакция 36
2.3.6. Рестрикциопный анализ 37
2.3.7. Лигазная аллель-специфичная реакция LDR-TaqMan 38
2.3.8. Статистический анализ данных 39
3. Результаты и обсуждение 40
3.1. Полиморфизм гена алкогольдегидрогеназы ADHlB*Arg47His в выборках восточнославянских и ираноязычных групп 40
3.1.1. Определение частот аллелей и генотипов гена алкогольдегидрогеназы ADHlB*Arg47His в выборках восточнославянских и ираноязычных групп 40
3.1.2. Сопоставление установленных частот трех аллелей у восточных славян с популяциями мира. 41
3.1.3. Возможность использования аллельспецифичных праймеров для генотипирования ADHIB*Arg47His 43
3.2. Определение частот аллелей и генотипов полиморфзма C/T-I3910 гена 45
лактазы LCT в выборках русских, украинцев, белорусов, иранцев и памирцев, и исследование распределения частот аллелей этого гена в популяциях мира
3.3. Полиморфизм CCR5delta32 гена CCR5 в выборках иранцев и памирце. 49
3.4. Полиморфизм гена^РОЕв выборках иранцев и памирцев. 50
3.5. Полиморфизм гена AGT в выборках русских, украинцев, белорусов и иранцев. 53
3.6 Полиморфизм гена MTHFR в выборках русских, украинцев, белорусов, памирцев и иранцев. 55
3.7. VNTR-полиморфизм гена DRD4 у иранцев. 56
3.8. Полиморфизм гена FAAH в выборках русских, украинцев, белорусов, памирцев и иранцев 58
3.9. Заключение 59
Выводы 60
Список использованной литературы
- Характеристика популяционно-генетических исследований в целом
- Характеристика исследуемых групп по однородительским генетическим маркерам
- Условия хранен ия биологических образцов
- Полиморфизм гена алкогольдегидрогеназы ADHlB*Arg47His в выборках восточнославянских и ираноязычных групп
Введение к работе
Полиморфные ДНК-маркеры - основа связи выявленных генотипических черт индивида с его фенотипическими признаками. Особенно актуально исследование ДНК-маркеров, ассоциированных с такими признаками человека как различные заболевания, при этом важны как моногенные признаки, так и мультифакторные. Риск развития болезни зависит как от присутствия определенных аллелей генов у индивида, так и от общего генетического фона, на котором эти аллели проявляются. Количественная оценка связи носительства данного аллеля (генотипа) с вероятностью развития заболевания на данном генетическом фоне различна для разных народов и поэтому должна решаться как задача самостоятельная для каждого народа.
Объектом исследования в диссертационной работе явились выборки, представляющие восточных славян (русских, украинцев, белорусов) и народы ираноязычной группы (иранцы, памирцы).
В диссертационной работе исследованы полиморфизмы генов, ассоциированных с наследственной предрасположенностью к широко распространенным либо к социально значимым заболеваниям, что определяет актуальность выбора соответствующих аллелей как объекта диссертационного исследования. Это аллели Arg47His гена алкогольдегидрогеназы ADH1B (толерантность или чувствительность к алкоголю), полиморфизм С/Т.и910 гена лактазы LCT (непереносимость молока - первичная гиполактазия), делеционный полиморфизм CCR5delta32 гена хемокинового рецептора CCR5 (устойчивость к ВИЧ-инфекции), аллели е2, еЗ, е4 гена аполипопротеина Е ЛРОЕ (предрасположенность к болезни Альцгеймера, сердечно-сосудистым заболеваниям), полиморфизмы Thrl74Met и Thr235Met гена ангиотензиногена AGT (эссенциальная гипетрензия), полиморфизм С677Т (Ala222Val) гена метлиентетрагидрофолат редуктазы MTHFR (сердечно-сосудистые заболевания, нарушения развития плода), полиморфизм С385А (Prol29Thr) гена гидроксилазы амидов жирных кислот FAAH (нарушения работы эндоканнабиноидной системы, предрасположенность к развитию наркотической зависимости), и VNTR-полиморфизм 3 экзона гена DRD4 (предрасположенность к развитию некоторых нервно-психических заболеваний, к формированию различных видов химических и поведенческих зависимостей).
Характеристика популяционно-генетических исследований в целом
Восточные славяне (русские, украинцы, белорусы)
Начало формирования славянской этнической общности относится к середине 1-го тысячелетия до н.э. Согласно гипотезам Бунака и Алексеевой [Алексеева, 1999] общие предки всех славянских народов жили на территории между Западной Двиной, Вислой, левыми притоками Дуная и правыми притоками Днепра (рис. 3). Здесь происходило взаимодействие этносов, различающихся в языковом и антропологическом отношении. Из этой области к 5-7 векам нашей эры славяне широко расселились по Европе, смешавшись с проживавшим там населением, что привело к их дифференциации и образованию трех групп (западных, южных и восточных славян). В формировании восточных славян значительную роль играли балтийские (для белорусов), финно-угорские (для русских) и ирано-язычные (для украинцев) субстратные группы [Алексеева, 1999].
Иранцы
Иран (ранее называвшийся Персией по имени Персидской Империи, возникшей в 6 веке до н.э.) расположен в юго-западной части Азии и граничит с Турцией и Ираком на Западе, Азребайджаном, Арменией и Туркменистаном на Севере и Пакистаном и Афганистаном на Востоке. На территории северо-западной части Ирана, входящей в плодородный полумесяц, находится зона ранних неолитических культур. Распространение земледельцев и кочевых скотоводов привело к переходу к земледелию на территориях к западу и к востоку от зоны первоначального возникновения земледелия. Первое государство на территории современного Ирана, Элам, возникло в начале 3-го тысячелетия до н.э., а с середины 2 тыс. до н.э. на территорию Ирана начали проникать племена, говорящие на индо-иранских (арийских) диалектах, что привело к замещению языка, распространенного здесь до этой экспансии (по одной из гипотез - прото-эламо-дравидского). Основное население современного Ирана составляют персы (51%, более 25 млн. человек), азербайджанцы (24%), гилянцы и мазандаранцы (8%), курды (7%), арабы (3%), луры (2%), туркмены (2%) и другие, более малочисленные группы [Cavalli-Sforca et al., 1994; С.И.Брук, 1981; Фрай, 2002; Народы и религии мира, 1998 ].
Горцы Памира
Сведения по населению Западного Памира приводятся по монографии Ю.Г.Рычкова [1969]. В Средней Азии в силу ее географического положения постоянно происходило взаимодействие оседлого земледельческого населения со степными племенами. С конца II - начала I тысячелетия до н.э. Средняя Азия является важной частью иранского мира, а в 6 -7 веках происходит поисходит вторжение тюрок и тюркизации иранского населения этого региона, сопровождающийся его физической монголизацией. Иранские группы отступают из долин в предгорья Западного Памира и далее в горы. Горцы Памира представляют собой изоляты, которые, оставаясь лишь пограничной окраиной великих азиатских государств, были мало затронуты процессами, в них происходившими. Население Западного Памира живет в ущельях-долинах, изолированных друг от друга. Языки горцев Памира относятся к восточно-иранской группе, в отличие от языков Ирана, относящихся к запад но-иранским. Общая численность их на 1959 г. в пределах СССР составляла 42 000 человек [Рычков, 1969]. Самыми большими были группа шугнанцев (18,6 тыс.), рушанцев (5,3 тыс.) и ваханцев (4,5 тыс.), остальные группы имели меньшую численность [Рычков, 1969]. Современная численность изученных в данной работе ирано-язычных и восточно-славянских групп представлена в табл.
Иранские и славянские языки представляют собой отдельные семьи, входящие через определенные промежуточные градации в индоевропейскую языковую семью (классификация индоевропейских языков представлена на сайте http://www.ethnologue.com). Эти языки имеют ряд общих черт, наличие которых объясняется общими закономерностями развития и историческими контактами между носителями иранских и славянских языков.
Иранские языки входят в Индо-иранскую группу Индо-европейских языков. Иранские языки подразделяются на (1) западную группу (живые языки: персидский, таджикские, лурский и бактиярский диалекты, гилянский, мазандеранский, курдский, талышский, татский, дари и другие языки; вымершие: древнеперсидский, мидийский, парфянский) и (2) восточную группу (живые языки: осетинский, ягнобский, ваханский, ишкашимский, шугнано-рушанская группа языков и диалектов, пашто (афганский) и др.; вымершие языки: скифо-сарматские языки, согдийский, хорезмийский, старованджский).
Характеристика исследуемых групп по однородительским генетическим маркерам
Традиционно языковое родство рассматривалось как свидетельство общего происхождения и исторических контактов народов. Генетические исследования позволили проверить это утверждение.
Соотношение между лингвистической и генетической близостью популяций было исследовано Кавалли-Сфорца [Cavalli-Sforza, 1997] с использованием классических генетических маркеров. Были получены данные о корреляции между лингвистической и генетической близостью популяций, однако позже, при использовании однородительских маркеров (мтДНК и Y-хромосомы) для установления родства популяций было показано, что встречаются как совпадение между степенью генетического и лингвистического родства, так и отсутствие какой-либо корреляции между этими показателями. Так, для популяций Сибири лингвистическая близость больше соответствует генетическому родству по Y-хромосомным маркерам, чем географической близости популяций [Karafet et al., 2002]. Для популяций Европы генетическое родство больше соответствует географической близости, чем лингвистическому родству [Rosser et al., 2000; Хуснутдинова, 2003]. Тем не менее у народов, языки которых относятся к индоевропейской языковой семье, отмечено присутствие с частотами от 3.8% до почти 50% гаплогруппы R1 Y-хромосомы ( линии R1 и Rib в Западной Европе и линии Rial в Восточной Европе, в Азии у таджиков, в Иране и Индии) [Rosser et al., 2000; Wells et al., 2001; Степанов, 2002; Деренко и др., 2002]. Хотя гаплогруппа R1 а представлена также и у народов, относящимся к другим языковым семьям, она рассматривается как маркер индоевропейского влияния [Rosser et al., 2000; Степанов, 2002].
В последние десятилетие стали доступны популяционно-генетические данные о спектре и частотах молекулярно-генетических маркеров Y-хромосомы для иранцев и памирцев [Wells et al., 2001] и мтДНК [Metspalu et al., 2004, Quintana-Murci et al., 2004]. Для восточных славян опубликованы данные о спектре и частотах гаплогрупп мтДНК [Orekhov et al., 1998; Malyarchuk, Derenko, 2001; Малярчук и др. 2001; Малярчук, 2001; Belyaeva et al., 2003] и Y-хромосомы [Rosser et al., 2000; Semino et al., 2000; Karafet et al., 2002; Харьков, 2005; Харьков и др., 2004, 2005] (табл. 2 и табл. 3).
Эти данные показывают, что в генофонде иранцев и памирцев представлены общеевропейские генетические линии мтДНК и Y-хромосомы. Однако по частотам этих гаплогрупп иранцы более сходны с другим популяциям Ближнего Востока (арабам, евреям) [Wells et al., 2001; Metspalu et al., 2004] и отличаются от родственных им по языку Восточных славян [Orekhov et al., 1998; Хуснутдинова и др., 1999; Wells et al., 2001; Malyarchuk et al., 2002; Belyaeva et al., 2003, Metspalu et al., 2004; Quintana-Murci et al., 2004]. Кроме того, в генофонде иранцев имеется небольшая доля южноазиатских (индийских) и восточно-евразийских гаплогрупп [Quintana-Murci et al, 2004]. Характерная для населения Индии гаплогруппа М достигает частоты 20% у восточных иранцев [Малярчук и др., 2002]. Горцы Памира (шугнанцы) по частотам Y-хромосомных маркеров занимают промежуточное положение между иранскими и восточно-славянскими популяциями [Wells et al., 2001], и имеют небольшую долю восточноеврайзийских линий мтДНК [Quintana-Murci et al., 2004].
Популяционно-генетические данные по распределению классических генетических маркеров в популяциях Евразии, в том числе иранцев, горцев Памира, русских, украинцев, белорусов обобщены как в монографиях [Cavalli-Sforza et al., 1994; Рычков и др., 2000, 2003; Балановская и др., 2001а, 20016, Лимборская и др., 2002], так и в базах данных - электронный атлас "Генофонд и гепогеография народонаселения России и сопредельных стран" Лаборатории генетики человека ИОГен РАН http://humgenlab.vigg.ru/Atlas/default.htm; База данных The Human Population Genetics Database (HPGD)B Стэнфордском университете, США, http://hpgl.stanford.edu/projects.html ; База данных Allele Frequency DataBase (ALFRED) http://alfred.med.yale.edu/alfred/index.asp в Йельском университете.
В иранских популяциях изучен также полиморфизм ряда молекулярно-генетических маркеров, описанию которых посвящен следующий раздел обзора.
Условия хранен ия биологических образцов
Для выделения ДНК из образцов крови объемом более 1 мл использовали стандартный фенол-хлороформный метод выделения. При объеме образца менее 500 мкл применялся метод с использованием готового набора реагентов DIA/o/и DNA Prep2Q0, который позволяет выделить ДНК из малых объемов с низкой потерей ДНК. а. Метод фенольной экстракции
Для выделения ДНК из крови применяли метод фенольной экстракции (Maniatis et al., 1982). К 200 мкл цельной крови добавляли 300 мкл свежеприготовленного буфера, содержащего 100 mM NaCl, 50 тМ Tris-HCl, рН=8Д ЮтМ ЭДТА, 1% SDS. Добавляли 5 мкл протеиназы К (15mg/ml). Инкубировали в течении 12-16 часов в термостате при 37С. После инкубации к лизату добавляли равный объем фенола, хорошо перемешивали и центрифугировали 5-8 мин. при 14000 об/мин, Супернатант переносили в чистую пробирку, и проводили последовательно экстракцию фенол-хлороформом (1:1) и затем хлороформом, так же равными объемами к супернатаиту. После этого к супернатанту добавляли два объема этилового спирта, 1/10 объема ЗМ NaAcO и .оставляли на один час на холод. Центрифугировали ДНК 15 мин. при 14000 об/мин, промывали осадок этанолом, высушивали при 65С в течение 1-2 мин. (Maniatis, 1982). К осадку добавляли 50 мкл стерильной деионизированной (или бидистиллированой) воды, либо ТЕ буфера. Тщательно суспендировали на вортексе 5-10 сек. и инкубировали 15 мин при 37С.
Для оценки качества и количества выделенной ДНК проводили электрофоретический анализ в 1% агарозных гелях и детекцию ДНК в УФ-свете после окрашивания гелей бромистым этидием. Выход ДНК из стартового объема цельной крови (200 мкл) составляет 10 мкг. Полученная таким образом ДНК может храниться длительное время при -20 С0
Праймеры и специфические условия амплификации для каждого исследуемого локуса приведены в таблице 4. Для амплификации локусов LCT был использован метод ПЦР-ПДРФ с модифицированным праймером (введение однонуклеотидной замены в праймере для получения сайта рестрикции специфичной эндонуклеазы).
При исследовании однонуклеотидных полиморфизмов АРОЕ, ADH1B, LCT, AGT174, после ПЦР проводили рестрикцию соответствующими ферментами в условиях, рекомендованных производителем («Сибэнзим», Россия). Для этого 25 мкл продукта амплификации обрабатывали 3-5 ед. рестриктазы в течение 12-16 часов. Размеры фрагментов ДНК после рестрикции оценивали путем проведения электрофореза в 2% агарозном или 10% полиакриламидном геле в присутствии электрофоретического стандарта длины с последующей окраской бромистым этидием и визуализацией ДНК в проходящем УФ-свете. Условия рестрикции каждого локуса приведены в табл. 5.
Размеры фрагментов ДНК после рестрикции оценивали путем проведения электрофореза в 2% агарозном или 12,5 % полиакрил амид ном геле в присутствии электрофоретического стандарта длины с последующей окраской бромистым этидием и визуализацией ДНК в проходящем УФ-свете
Детекция полиморфизмов методом Ligation detection reaction — TaqMan Assay выполнена совместно с М.В.Соколовой, Детекция проводилась в два этапа: реакции лигирования и последующей амплификации с флюоресцентным зондом, где матрицей для амплификации служат специфично слигировапные олигонуклеотиды, соответствующие каждому из присутствующих аллелей. Флюоресцентный сигнал для каждого из аллелей различный (FAM или ТЕТ), что позволяет одновременно детектировать в одной пробирке оба аллеля. В случае если в ДНК пробе присутствует только один аллель, то лигирование олигонуклеотидов для другого аллеля не происходит и соответственно не происходит образование матрицы для амлификации и детекции флуоресцентного сигнала для этого аллеля.
Транзиция G= A в кодирующей части гена ADH1B приводит к замене в белке аргинина-47 на гистидин. Аллель ADHlB 47His соответствует атипичной алкогольдегидрогеназе, впервые описанной в пуляциях Юго-Восточной Азии. У носителей этого аллеля ускорено превращение этанола в ацетальдегид, что снижает толерантность к спиртным напиткам и вероятность развития алкоголизма.
Для каждого индивида в выборках русских, украинцев , иранцев и памирцев (всего 298 чел.) проведено генотипирование локуса ADHlB Arg47His. Примеры результатов электрофоретического разделения продуктов ПЦР-ПДРФ при генотипировании представлены на рис. 4 .
Полиморфизм гена алкогольдегидрогеназы ADHlB*Arg47His в выборках восточнославянских и ираноязычных групп
При сравнении олигонуклеотидов, использованные для генотипирования аллеля ADHlB 47his в [Sepeh et al, 2004] (рис. 5), с последовательностями нуклеотидов генов ADH человека мы обнаружили, что в силу высокого уровня гомологии между генами ADH оба олигонуклеотида оказались гомологичными не только последовательности гена ADHIB (OMIM ID 103720), но и последовательности соседнего гена ADHIC таким образом, что лишь один концевой нуклеотид в обоих праймерах остается некомплиментарным (пара А-С). При "пробое" ДНК-полимераза может вести амплификацию не только с гена ADH1B, но и с гена ADH1C и будет идентифицировано носительство аллеля А независимо от того, какой аллель (А или G) гена ADH1B реально присутствует. Ожидаемым результатом является определение любого генотипа как гетерозиготного A/G. Что и отмечено в статье [Sepeh et ah, 2004] - избыток гетерозигот и отклонение от распределения Харди-Вайнберга. Завышение частоты аллеля в статье [Ogurtsov et al., 2001] имеет такие же причины. В нашей работе использовано генотипирование при помощи ПЦР-ПДРФ с праймерами, которые комплиментарны участкам, негомологичным между генами ADH.
Сравнение нуклеотидных последовательностей генов ADH1D и ADH1А (рис. XX) показало, что использование аллель-спицефичных праймеров и с другой стороны от полиморфной позиции может привести к такой же ошибке, то есть амплификации не с целевого гена, а соседнего. Из этого можно заключить, что метод с использованием аллель-специфичных праймеров при генотипировании полиморфизма Arg47His в гене ADH1B либо неприменим, либо требует особой осторожности, чтобы избежать ошибок генотипирования.
Таким образом, установленные нами частоты аллеля ADHlB 47his у русских (3%) и украинцев (8%) находятся в диапазоне, характерном для народов средней полосы Европы и соответствуют имеющему градиенту частоты, повышающейся с северо-запада на юго-восток. Как установлено для изученных выборок русских и украинцев, а также других популяций русских [Osier et al., 2002, Марусин и др., 2003], по частоте аллеля ADHlB 47His, а следовательно, и по особенностям метаболизма этанола, определяемым печеночной алкогольдегидрогеназой, они не отличаются от других народов Европы.
Таким образом, установленные нами частоты аллеля ADHlB 47his у русских (3%) и украинцев (8%) находятся в диапазоне, характерном для народов средней полосы Европы и соответствуют имеющему градиенту частоты, повышающейся с северо-запада на юго-восток. Как установлено для изученных выборок русских и украинцев, а также других популяций русских [Osier et al., 2002, Марусин и др., 2003], по частоте аллеля ADHlB 47his, а следовательно, и по особенностям метаболизма этанола, определяемым печеночной алкогольдегидрогеназой, они не отличаются от других народов Европы.
Частоты аллелей в исследованных ираноязычных популяциях (24% для иранцев и 22 % для памирцев) являются промежуточными между частотами аллеля для народов Европы и Юго-Восточной Азии.
Полученные для восточнославянских и ираноязычных популяций данные позволяют уточнить характер географического распределения частот аллеля ADHlB 47his в Евразии.
Полиморфизм С/Т _13910 в регуляторном участке гена лактазы LCT ассоциирован с гиполактазиеи [Enattah et al., 2002]. Для генотипа С/С сайта С/Т -/зяю гена LCT показана практически полная ассоциация с гиполактазиеи на выборках финнов [Enattah et al., 2002] и немцев [Buning et al., 2005 ].
Частоты аллелей и генотипов іСГ С/Г_із9іо были установлены в выборках иранцев и памирцев. Пример электрофореграммы для детекции ПЦР-ПДРФ продуктов приведен на рис 6. Частоты генотипов и аллелей по полиморфизму LCT C/T_\mo в исследованных выборках представлены в табл. 8.
