Содержание к диссертации
Список сокращений 5
Введение 6
1. Обзор литературы 10
Спонтанная и индуцированная НСГ 10
Трансмиссибельная и трансгенерационная НСГ 12 1.2.1. НСГ регистрируемая в структурных генах 13
Повторяющиеся последовательности ДНК 15
Классификация повторов 15
Семейства повторов 16
Распределение МНС и МКС по геному 17
1.4. Вариабельность повторов 18
1.4.1 .Спонтанная вариабельность МНС и МКС 18
Роль МКС и МНС в функционировании организма 19
Индуцированная вариабельность МКС и МНС 22
1.5. Трансгенерационный полиморфизм МНС и МКС 24
Стадии сперматогенеза и оогенеза 24
Различие стадий сперматогенеза по чувствительности 25 к ИР
Различие чувствительности сперматозоидов и ооци- 27 товк ИР
1.5.4. Влияние облучения ИР самцов или самок на их 28
необлученное потомство
1.6. Применение различных методов ПНР к исследованию 29
НСГ
2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Животные 37
2.1.1 .Характеристика линии BALB/c 37
Содержание животных во время экспериментов. 38
Облучение животных 38
Сбор и хранение образцов тканей животных 38
Оборудование и материалы 39 2.2.1.Оборудование 39 2.2.2.Ферменты и биопрепараты 40 2.2.3.Реагенты 40
Фенольный метод выделения ДНК 41
Препараты для подсчета МЯ в эритроцитах 42
Полимеразная цепная реакция (ПНР) 43
Выбор праймера и оптимизация условий ПЦР 43
Условия ПЦР 45
2.6. Полиакриламидный вертикальный гель-электрофорез 48
(ПААГ)
Окрашивание гелей с помощью азотнокислого серебра 48
Компьютерная обработка изображений 49
Статистическая обработка результатов 51 3. Результаты и обсуждение 53
3.1. Схемы экспериментов 5 3
Схема серии экспериментов по изучению трансгене- 53 рационных эффектов острого гамма-облучения самцов мышей
Схема серии экспериментов по изучению трансгене- 54 рационных эффектов острого гамма-облучения самок мышей
3.2. Влияние облучения на репродуктивные свойства жи- 58
вотных-родителей и жизнеспособность их потомства
Плодовитость самок линии ВALB/c 5 9
Жизнеспособность потомства, родившегося до и по- 62 еле облучения одного из родителей
Численность потомков в помете и половой индекс 65
Полимеразная цепная реакция 69
Систематизация первичных данных 72
Построение гистограмм распределения 74
Полиморфизм длин МКС-ассоциированных повторов в 75 геномной ДНК у потомков при облучении одного из родителей
3.6.1. Полиморфизм длин амплифицированных фрагментов 75
ДНК в разных тканях у потомков при облучении одного из роди
телей
3.6.2. Радиационно-индуцированный полиморфизм длин 80
амплифицированных фрагментов ДНК у потомков при облучении
одного из родителей
Зависимость степени полиморфизма длин амплифици- 85 рованных фрагментов ДНК от пола потомков
Частота встречаемости МЯ у родителей и потомства до 91 и после облучения самок-родителей
Сравнение уровня НСГ у потомства, рожденного после 93 облучения самок - родителей зарегистрированного цитогенетиче-
ским и молекулярно-биологическим методами
Заключение 96
Литература 98
Приложения 125
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АТС — аномальные головки спермиев
ДЛМ — доминантные летальные мутации
ИР - ионизирующая радиация
ЛПЭ - линейная передача энергии
МГЭ - мобильные генетические элементы
МКС - микросателлиты
МНС - минисателлиты
мтДНК - митохондриальная ДНК
НРП - неродительские полосы
% НРП - число неродительских полос в процентах к ОЧП
НСГ - нестабильность генома
ОБЭ - относительная биологическая эффективность
ОЧП - общее число полос
ПААГ - полиакриламидный гель
ПО - программное обеспечение
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РИНГ - радиационно-индуцированная нестабильность генома
РТ - реципрокные транслокации
СХО - сестринский хроматидный обмен
яДНК - ядерная ДНК
AP-PCR - arbitrarily primed polymerase chain reaction
ESTR - expanded simple tandem repeats
MMR - mismatch repair или MMRS - mismatch repair system
RAPD - random amplification of polymorphic DNA
RFLPs - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов
Rf- коэффициент электрофоретической подвижности
STR - short tandem repeats
SSR - simple sequence repeats
SSTR - simple sequence tandem repeats
VNTR - variable number of tandem repeats
Введение к работе
Актуальность темы. Ионизирующая радиация (ИР) в виде естественно- -го радиационного фона Земли является одним из наиболее существенных экологических факторов в процессах адаптации, видообразования и эволюции живого мира в целом. Однако с середины прошлого века характер воздействия ИР на эти процессы резко изменился, что обусловлено глобальным загрязнением среды обитания вследствие радиационных аварий и испытаний ядерного оружия, увеличением количества объектов ядерной энергетики и военно-промышленного комплекса, а также использованием источников ИР в медицине [UNSCEAR 2001; Алтухов и др. 2004; Гераськин и др. 2006]. В человеческой популяции постоянно возрастает доля индивидов, подвергавшихся воздействию ИР. В связи с этим изучение действия ИР в сублетальных дозах на человека очень актуальны [UNSCEAR 2001]. Крайне важным является также выявление и количественная оценка уровня индуцированной трансгенерационной нестабильности генома (НСГ), основу которой, как полагают, составляют повреждения, возникающие в геноме клеток полового пути родителей, подвергшихся радиационному воздействию. [Niwa, Kominami 2001; Shimada, Shima 2004; Barber et al. 2006]. Проведение такого рода экологических исследований затруднено недостаточным количеством эпидемиологических данных. Поэтому для оценки генетического риска в рамках концепции «человек-мышь» многие работы в этой области проводят на животных.
Многообразие вариантов полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяет перейти от традиционного цитогенетического анализа хромосомных аберраций и микроядер (МЯ) к выявлению мутаций в кодирующих локусах, а также количественно оценивать уровень генетической изменчивости (мутации, а также полиморфизм ДНК) и в неэкспрессируемых областях. К таким областям относятся, например, гипервариабельные минисателлитные (МНС) и микросател-литные (МКС) повторы, занимающие подавляющую часть генома животных и
растений. Повышенная природная вариабельность МКС и МНС, делает их информативными генетическими маркерами. Такие маркеры, одновременно характеризующие геном по множеству локусов, называются мультилокусными. Их использование позволяет значительно повысить вероятность обнаружения изменений в геноме и уменьшить число объектов в обследуемых выборках, особенно, при исследовании эффектов ИР в сублетальных дозах [Алтухов и др. 2004]. Работы Дуброва и соавторов показывают передающееся по наследству увеличение вариабельности специфических и гипервариабельных ESTR (expanded simple tandem repeats) мышиных локусов в результате облучения [Dubrova et al. 1993, 1996, 1998, 2000, 2002, 2005]. Дуброва и коллеги успешно применили этот подход и при исследовании семей, проживавших на загрязненной после Чернобыльской аварии территории Могилевской области Белоруссии [Dubrova et al. 1996, 1997]. Есть и другие работы, где удачно использовалась полиморфная ДНК для оценки генетической нестабильности, возникающей у потомков облученных родителей [UNSCEAR 2000; Niwa et al. 2001; Kodaira et al. 2004].
Помимо анализа вариабельности определенных МКС и МНС локусов довольно широкое распространение получил метод оценки генетической нестабильности по полиморфизму длин фрагментов ДНК. В литературе метод упоминается как arbitrary primed PCR (AP-PCR) или random amplified polymorphic DNA (RAPD). Ранее нами, с помощью AP-PCR, нами было показано увеличение генетического полиморфизма длин фрагментов ДНК у потомков мышей линии ВALB/c, хронически облученных ИР в дозах 0,1 — 0,5 Гр [Безлепкин и др. 2000]. Необходимость исследования последствий острого облучения родителей для потомства обусловлена тем, что эффекты хронического и острого облучения различаются [Безлепкин и др. 2004]. Кроме того, слабо изученными остаются тканеспецифические последствия действия ИР на потомков облученных родителей. Также вызывает большой интерес наличие различий в эффектах
от ИР у разнополых облученных родителей, а также их разделенных по полу необлученных потомков.
Таким образом, актуальность работы определяется тем, что она отвечает потребности глубокого изучения разнообразных генетических последствий влияния острого облучения ИР родителей на их потомков.
Цель и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в сравнении уровня радиационно-индуцированой нестабильности генома (НСГ) у потомков мышей линии BALB/c, рожденных после облучения сублетальными дозами ИР самцов- или самок-родителей.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Выявить возможное влияние сублетальных доз ИР на плодовитость облученных мышей - родителей и жизнеспособность их потомства.
Оценить индуцированную НСГ у потомства, рожденного от самцов - или самок - родителей, облученных в сублетальных дозах (50, 100 и 200 сГр) по уровню полиморфизма длин МКС-ассоциированных повторов.
Сравнить полиморфизм размеров повторов в некоторых постмитотиче-ских (кровь, головной мозг, легкие) и пролиферирующих (селезенка, кончик хвоста) тканях потомства самцов и самок, подвергавшихся воздействию ИР в сублетальных дозах.
Выявить возможные половые отличия в уровне полиморфизма длин МКС-ассоциированных повторов, определяемом по числу неродительских полос (НРП) у потомства, рожденного от облученных самцов - или самок - родителей.
5. Сравнить уровень НСГ, выявляемый по молекулярно-генетическим (по
лиморфизм МКС) и по цитогенетическим (частота встречаемости МЯ)
маркерам, у потомства самок, облученных ИР в сублетальных дозах.
Научная новизна и практическая значимость. Впервые продемонстриро
вана возможность применения AP-PCR анализа для оценки индуцированной ИР
вариабельности длин МКС-ассоциированных повторов. Впервые проведен
сравнительный анализ радиационно-индуцированной НСГ потомства, облученных ИР в области сублетальных доз от 50 до 200 сГр самцов и самок мышей линии BALB/c методом оценки полиморфизма длин фрагментов ДНК, ампли-фицированных с праймером из последовательности, фланкирующей МКС-локус на 11-ой хромосоме мышей. Нами обнаружены связанные с типом ткани и полом различия в уровне полиморфизма длин повторов у потомков, родившихся до и после облучения одного из родителей в сублетальной дозе 200 сГр. Для обработки результатов впервые было использовано специально разработанное программное обеспечение (ПО), позволяющее значительно уменьшить влияние субъективных факторов и сильно ускорить анализ и статистическую обработку большого массива данных. Результаты работы могут быть использованы для экстраполяции данных с целью оценки генетического риска воздействия острого облучения в малых и умеренных дозах на человека. Кроме того, полученные результаты позволяют рассматривать метод AP-PCR в качестве одного из важных компонентов эффективных систем радиоэкологического мониторинга и расчета экологических рисков.
