Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1. Общие сведения о наноматериалах 12
2.2. Оценка воздействия нанотехнологий и наноматериалов на биообъекты окружающей среды 18
2.3. Характеристика влияния наноматериалов на животный организм 24
2.3.1. Пути проникновения в организм и основные механизмы действия наночастиц 24
2.3.2. Влияние отдельных наноматериалов на ткани и органы 30
2.3.2.1. Особенности эффектов на организм углеродных наноматериалов 35
2.3.2.2. Воздействие наноматериалов на репродуктивную систему 40
3. Основное содержание работы 46
3.1. Организация работы 46
3.2. Характеристика исследуемого материала 49
3.3. Методы исследования 50
3.4. Методы вариационно-статистического анализа полученных данных 55
4. Результаты собственных исследований 56
4.1. Дозозависимые эффекты УНМ «Таунит» на организм самок белых мышей...56
4.2. Анатомо-морфологические изменения у белых мышей при воздействии УНМ «Таунит» 4.2.1. Морфометрические показатели тела 70
4.2.2. Гистологическая картина паренхиматозных органов 73
4.3. Состояние периферической крови и печени мышей при поступлении в организм УНМ «Таунит»
4.4. Влияние УНМ «Таунит» на поведенческие реакции белых мышей 81
4.5. Особенности репродуктивной функции самок белых мышей при поступлении в организм УНМ «Таунит» 84
4.6. Постнатальное развитие потомства первой генерации белых мышей, подвергшихся воздействию УНМ «Таунит» 89
4.7. Сравнительная оценка биоэффектов УНМ «Таунит» и углеродного наноматериала другой структуры 96
5. Обсуждение результатов исследований 99
Заключение 112
Практические рекомендации 114
Список сокращений 115
Список литературы
- Характеристика влияния наноматериалов на животный организм
- Влияние отдельных наноматериалов на ткани и органы
- Методы вариационно-статистического анализа полученных данных
- Состояние периферической крови и печени мышей при поступлении в организм УНМ «Таунит»
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Развитие нанотехнологий и
создание наноматериалов, являясь важнейшим направлением научно-
технического прогресса будущего, в то же время ставит вопрос взаимодействия
последних с живым организмом. В течение последних десятилетий создано
более 2000 разновидностей наноматериалов, в связи с чем возросла
возможность воздействия наночастиц на животных, человека и окружающую
среду (Powers K.W., Brown S.C., 2006; Гусев А.А., Емельянов А.В., 2008;
Пиотровский Л.Б., 2008). Такие антропогенные источники, как
металлургическая, цементная промышленность; сгорание каменного угля, полимерных соединений, нефти, газа, дизельного топлива и другие процессы значительно увеличили содержание наночастиц в окружающей среде (Sahoo S.K. et al., 2007; Иншаков, О.В., Фесюн А.В., 2009). В процессе производства наноматериалов, их транспортировки, производственных процессах, ремонте, а также утилизации объектов, содержащих наночастицы, все чаще имеет место контакт и воздействие наноматериалов на животный организм.
Общепризнано, что изменения физических свойств вещества при
переходе в форму наночастиц закономерно сопровождаются изменениями его
биологических эффектов. В частности, установлена существенная задержка
наночастиц в легких, поскольку из-за малых размеров этих частиц, механизмы
выведения их респираторной системой организма неэффективны. Показана
способность наночастиц проникать через легкие в другие системы и проходить
кожные барьеры; наличие у них так называемого «воспалительного
потенциала» (Русаков Н.В., 2008; Takeda K. et al., 2011). Небольшие размеры и
разнообразие их форм способствуют связыванию с нуклеиновыми кислотами и
белками; встраиванию в мембраны клеток, изменяя функции биоструктур.
Наличие у многих наноматериалов гидрофобных свойств и электрического
заряда усиливает как процессы адсорбции на них различных веществ, так и
способность проникать через барьеры организма. Важным свойством
наночастиц является высокая способность к аккумуляции, поскольку
вследствие малых размеров эти вещества могут не распознаваться защитными системами организма, и, следовательно, не подвергаться биотрансформации (Сычева Л.П., 2008; Miyawaki J. et al., 2008; Gomes S.I. et al., 2013).
Перечисленное свидетельствует о высокой актуальности изучения влияния наноматериалов, в том числе углеродных, на животный организм с оценкой состояния различных органов и систем, в частности, репродуктивной.
Степень разработанности темы. В настоящее время усилия исследователей сосредоточены преимущественно на изучении начальных этапов процесса взаимодействия животного организма с наночастицами: идентификации и характеристике последних на основе биологических и фармакологических эффектов, полученных на моделях животных. Изучаются пути проникновения наночастиц в организм – респираторный, чрескожный, пероральный; критические органы-мишени (легкие, кожа, сердечно-сосудистая
и нервная системы); оценивается влияние наноматериалов на
физиологическое состояние и исследуются специфические механизмы действия некоторых наночастиц (Радилов А.С. и др., 2009; Lim D. et al., 2012). Ведутся работы по обоснованию и разработке санитарно-гигиенических требований к содержанию наночастиц в воздухе (Малышева А.Г., 2008).
В то же время, превалируют сообщения, посвященные изучению свойств наноматериалов in vitro на уровне молекул (селективная адсорбция высокомолекулярных соединений, стабилизация и изменение с их помощью активности ферментов) и клеточных культур (выявление механизмов взаимодействия с клеточной мембраной, влияние на экспрессию отдельных генов) (Barua S. et al., 2013; Gomes S.I. et al., 2013).
Исследования эффектов различных наноматериалов на организменном уровне единичны и несистематизированы, практически отсутствуют работы по изучению влияния многостенных углеродных нанотрубок (МУНТ) на биосистемы, их фармакокинетике и фармакодинамике; не установлены четко органы-мишени, не описан генез изменений, происходящих при поступлении в организм наночастиц, механизмы развивающихся при этом компенсаторно-приспособительных реакций. В зарубежной научной литературе имеются лишь отдельные сообщения о воздействии МУНТ на репродуктивную функцию организма (Ema M. et al., 2010; Keelan J.A., 2011; Gao G. et al., 2012;), тогда как отечественные работы такого плана вообще отсутствуют.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилась оценка физиологических аспектов влияния углеродного наноструктурного материала (УНМ) «Таунит» (многостенных углеродных нанотрубок) на организм самок белых мышей и их потомство первого поколения при пероральном введении.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
-
Оценить физиологические эффекты самок белых мышей при введении различных доз УНМ «Таунит» (дозозависимый эффект).
-
Изучить структурно-функциональные изменения систем крови, выделительной, пищеварительной, сердечно-сосудистой и иммунной у белых мышей под воздействием многостенных углеродных нанотрубок.
-
Исследовать поведенческие реакции самок белых мышей и их потомства при пероральном поступлении многостенных углеродных нанотрубок.
-
Определить влияние УНМ «Таунит» на репродуктивную функцию самок белых мышей и показатели развития их потомства первой генерации.
-
Сравнить эффекты перорального поступления УНМ «Таунит» и углеродного наноматериала другой структуры.
Научная новизна. Впервые проведена комплексная оценка
физиологических эффектов УНМ «Таунит» при пероральном поступлении в животный организм. Получены новые данные о состоянии внутренних органов
и систем организма; его функциональных и морфологических изменениях в условиях длительного поступления многостенных углеродных нанотрубок.
Выявлен дозозависимый эффект наноматериала «Таунит» при
поступлении в организм белых мышей, проявлявшийся отклонениями массы внутренних органов; продемонстрированы реактивные изменения иммунной системы.
Впервые получены данные о влиянии УНМ «Таунит» на репродуктивную систему самок мышей, в частности, увеличении массы соответствующих органов (матки с яичниками), а также количества особей в приплоде, их морфометрических показателей; снижении смертности молодняка, числа неродивших самок и доли самцов в потомстве.
Показано отсутствие изменений в гамето- и эмбриогенезе белых мышей, постимплантационной гибели, развитии плодов и потомства первой генерации при поступлении в организм УНМ «Таунит».
Теоретическая и практическая значимость работы. Получены данные
о развитии компенсаторно-приспособительных реакций и
морфофункциональных аспектах взаимодействия наночастиц с органами и тканями белых мышей.
Результаты опытов могут быть использованы для дальнейшего совершенствования нормативной базы по работе с наноматериалами. Они расширяют существующие знания о воздействии на организм нанодисперсных материалов, позволяют совершенствовать подходы к гигиеническому нормированию при использовании этих веществ.
Представленные сведения позволяют разработать стратегию оптимизации действия наноразмерных веществ на животный организм.
По результатам исследования получен грант по проекту № 07-03/2012
«Состояние дисперсной фазы в водных суспензиях нанопорошков для
разработки методик тестирования наноматериалов в физиологических
жидкостях» в рамках проведения III Межвузовского конкурса
исследовательских проектов (15.03.2012-15.11.2012 гг.); проект «Разработка инструкции по безопасному применению углеродного наноструктурного материала в качестве компонента дактилоскопических порошков для судебной медицины и криминалистики» получил поддержку ФГБУ «Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере» по программе «У.М.Н.И.К.» (2011-2013 гг.).
Информации, полученные в результате экспериментального
исследования, используются в учебном процессе на кафедре физиологии ФГБОУ ВПО «Тамбовский государственный университет имени Г.Р. Державина» при чтении лекций и проведении семинарских занятий. Разработан
и внедрн факультативный курс лекций «Нанотехнологии и безопасность» в 10 классах МОУ СОШ № 30 г. Тамбова.
Методология и методы исследования. Методология исследования включала оценку физиологического влияния многостенных углеродных нанотрубок на организм самок белых мышей. Эксперименты проведены с соблюдением всех принципов доказательной медицины (рандомизация и формирование групп подопытных животных, обработка результатов методами вариационной статистики). Подробно методики описаны в разделе 3.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
УНМ «Таунит» при пероральном поступлении в организм мышей вызывает дозозависимые морфофункциональные изменения в сердечнососудистой, пищеварительной, выделительной и иммунной системах.
-
В условиях поступления УНМ «Таунит» в организм самок белой мыши на 14 сутки потенцируются процессы возбуждения, что проявляется в виде снижения порога эмоциональных реакций и увеличения количества локомоций с последующим их восстановлением и угнетением общей двигательной активности к концу 45 суток потребления наноматериала.
-
При пероральном введении УНМ «Таунит» у самок белых мышей изменяется морфофункциональное состояние репродуктивной системы (увеличиваются масса репродуктивных органов (матки с яичниками), количество особей в приплоде, морфометрические показатели потомства; снижаются количество неродивших самок, смертность молодняка и доля самцов в помете). При этом эмбриогенез и постимплантационная гибель плодов не меняются.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность
результатов исследований определяется адекватным количеством
биологических объектов, рандомизацией; корректным формированием групп экспериментальных животных и адекватными методами исследования; длительными сроками наблюдения и объективными методами вариационно-статистической обработки результатов экспериментов. Сформулированные выводы, положения и рекомендации аргументированы и логически вытекают из системного анализа результатов выполненной работы.
Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на: Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы контроля качества природной и техногенной сред» (Тамбов, 2009); 14-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2010); III-м Международном форуме по нанотехнологиям Rusnanotech 2010, (Москва, 2010); 2-й Международной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина» (Московская обл., 2011); V-й Международной научно-практической конференции «Современные проблемы контроля качества природной и техногенной сред» (Тамбов, 2012); 17-й Международной Пущинской школе – конференции молодых ученых (Пущино, 2013).
По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 5 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования РФ.
Характеристика влияния наноматериалов на животный организм
Вышеприведенные данные свидетельствуют о том, что наноматериалы, обладающие иными физико-химическими свойствами и биологическим действием по сравнению с традиционными аналогами, следует отнести к новым видам материалов и продукции. Однако, для большинства из них гигиеническая характеристика либо отсутствует, либо представлена ограниченным числом тестов, методология выполнения и результаты которых зачастую несопоставимы. В то же время, многие специалисты сходятся во мнении, что такого рода данные должны основываться на результатах, полученных при выполнении большого объема исследований in vitro и in vivo, включая длительные эксперименты на животных (Радилов, А.С. Экспериментальная оценка токсичности и опасности наноразмерных материалов / А.С. Радилов, А.В. Глушкова, С.А. Дулов // Нанотехнологий. Экология. Производство. - 2009. - № 1. - С. 86-89; Онищенко, Г.Г. Обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия населения в условиях расширенного использования наноматериалов и нанотехнологий / Г. Г. Онищенко // Гигиена и санитария. - 2010. - № 2. - С. 4-7). При этом ежегодное увеличение номенклатуры наноматериалов, производимых промышленностью, делает практически невозможным получение в ближайшие годы исчерпывающих данных о биологических эффектах всех важнейших наноматериалов, поскольку для этого потребовалось бы привлечение неприемлемо огромных трудозатрат и материальных ресурсов (Онищенко, Г.Г. Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 23 июля 2007 г. № 54 «О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и содержащей наноматериалы» [Электронный ресурс]. URL: http://www.rospotrebnadzor.ru/documents/postanov/1209/). В связи с этим, в настоящее время разрабатываются шкалы приоритетов, то есть методические подходы (алгоритмы), позволяющие на основе имеющейся научной информации о свойствах наночастиц и их биологическом действии прогнозировать их эффекты на организм человека. В свою очередь результаты такого прогнозирования позволяют осуществлять ранжирование наноматериалов по степени воздействия: для объектов с низкой степенью воздействия целесообразно проведение только отдельных, критически важных тестовых исследований, для наночастиц, характеризуемых средней степенью воздействия, круг планируемых исследований должен быть существенно расширен и, наконец, для наноматериалов с высокой степенью воздействия, гигиеническая характеристика должна осуществляться в полном объёме (Русаков, Н. В. Эколого-гигиенические проблемы отходов наноматериалов / Н. В. Русаков // Гигиена и санитария. - 2008. - № 6. - С. 20-21).
Имеющееся незначительное количество исследований в этом направлении указывает на то, что наноматериалы могут оказывать большие биологические эффекты в сравнении с их эквивалентами в обычной форме в этой концентрации (Hussain, S.M. The interaction of manganese nanoparticles with PC 12 cells induces dopamine depletion I S.M. Hussain, A.K. Jovorina II Toxicol. Science. - 2006. - Vol. 92, N2. -P. 456-463.).
Размеры НЧ и свойства их поверхностей позволяют им вступать в прямой контакт на молекулярном уровне с биологическими тканями и системами, с микробными агентами (Roy, I. Optical tracking of organically modified silica nanoparticles as DNA carriers: a nonviral, nanomedicine approach for gene delivery I I. Roy, T.Y. Ohulchanskyy, D.J. Bharali et al. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. -Vol. 102. - P. 279-284), эндотоксинами, токсинами, в том числе микотоксинами (Oberdorster, G. Systemic effects of inhaled ultrafme particles in two compromised, aged rat strains I G. Oberdorster II Inhal Toxicol. - 2004. - Vol. 16, N 6/7. - P. 461 20 471), а также с различными химическими соединениями органической и неорганической природы, протеинами и отдельными структурами клеток (липидами и нуклеиновыми кислотами, в частности ДНК) (Kabanov, A.V. Polymer genomics: an insight into pharmacology and toxicology of nanomedicines I A.V. Kabanov II Adv. Drug Deliv. Rev. - 2006. - Vol. 58, N15. -P. 1597-1621; Dutta, D. Adsorbed proteins influence biological activity and moleculer targeting of nanomaterials I D. Dutta, S.K. Sundaram, J.G. Teeguarden, B.J. Riley II Toxicol Sci. -2007. - Vol. 100, N 1. - P. 303-315; Lynch, I. The nanoparticle-protein complex as a biological entity; a complex fluids surface science challenge for the 21 st century 11. Lynch, T. Cedervall, M. Lundqvist II Adv. Colloid Interface Sci. - 2007. - Vol. 31. - P. 167-174).
В экспериментах in vitro показано, что действие НЧ на альвеолярный эпителий обусловлено изменением клеточных структур вследствие прооксидантного эффекта и зависит от состава НЧ, заряда и площади их поверхности (Meng, Н. Ultrahigh reactivity provokes nanotoxicity: Explanation of oral toxicity of nanocopper particles I H. Meng, Z. Chen, G. Xing et al. II Toxicology Letters. -2007. - Vol. 175. - P. 102-110).
На основании приведенной информации можно сделать вывод о большем биологическом эффекте наночастиц по сравнению с обычными микрочастицами; способности проникать в неизмененном виде через клеточные барьеры, а также через гематоэнцефалический барьер в центральную нервную систему; циркулировать и накапливаться в органах и тканях, вызывая более выраженные морфологические изменения внутренних органов, а также, обладая длительным периодом полувыведения, крайне медленно выводятся из организма (Онищенко, Г.Г. Обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия населения в условиях расширенного использования наноматериалов и нанотехнологий / Г. Г. Онищенко // Гигиена и санитария. - 2010. - № 2. - С. 4-7; Уйба, В.В. Разработка медико - биологического обеспечения безопасности в области нанотехнологий [Электронный ресурс] /В.В.Уйба // URL: http:// rusnanotech08. rusnanoforum.ru/sadm_files/disk/Docs/l/7/14.pdf; Hussain, S.M. In vitro toxicity of nanoparticles in BRL3A rat liver cells I S.M. Hussain, K.L. Hess II Toxicol, in vitro. -2005. - Vol. 19, N 7. - P. 975-983).
Следует отметить, что при попадании наноматериалов в окружающую среду последствия могут оказаться совершенно неожиданными. Например, наночастицы диоксида титана, которые находят применение в широком диапазоне устройств - от солнцезащитных экранов до перезаряжаемых батарей - поглощают и концентрируют на себе тяжелые металлы, такие как кадмий (Gao, G. Titanium dioxide nanoparticle-induced testicular damage, spermatogenesis suppression, and gene expression alterations in male mice I G. Gao, Y. Ze, X. Zhao et al. II J. Hazard Mater. -2013. - Vol. 15. - P. 258-259; Jiang, Wen. Nanoparticles - mediated cellular response in size - dependent I Wen Jiang, B.Y.S Kim II Nanotechnol. - 2008. - Vol. 3. - P. 145-150). Остаются неясными последствия появления таких наночастиц в атмосфере и их влияние на характер циркуляции других вредных компонентов, загрязняющих окружающую среду (Гусев, А.А. Нанобезопасность - новое направление экологических исследований / А.А. Гусев, А.В. Емельянов // Проблемы экологии в современном мире. - Тамбов, 2008. - С. 39-41; Bottini, М. Biomedical platforms based on composite nanomaterials and cellular toxicity I M. Bottini, A. Magrini II J. Phys. Conf. Ser. - 2007. - Vol.61. - P. 95-98; Ema, M. Reproductive and developmental toxicity studies of manufactured nanomaterials I M. Ema, N. Kobayashi, M. Naya et al. II Reprod. Toxicol. -2010.- Vol. 30, N 3. - P. 343-352).
Влияние отдельных наноматериалов на ткани и органы
Определен спектр веществ, которые могут влиять на репродуктивную систему женских и мужских особей. Это дезаминирующие соединения, цитостатики, алкилы металлов и др. (Джатдоева, Ф.А. Проблемы репродуктивного здоровья россиян / Ф.А. Джатдоева // Мать и Дитя: Материалы VIII Рос. форума. - М., 2006. - С. 624-325).
Эффекты действия химических веществ на женскую репродуктивную систему проявляются широким спектром изменений в половых органах, оплодотворенной яйцеклетке в предимплантационныи период, анатомическими изменениями (Коломейцев, М.Г. Проблемы и перспективы развития репродуктивного образования в системе здоровьесбережения молодежи в России
В последние годы к большому числу факторов, влияющих на репродуктивную функцию животного организма, добавился еще один -наноматериалы, о влиянии которых до настоящего времени практически ничего не было известно (Иншаков, О.В. Нанотрансформация товаров / О.В. Иншаков, А.Р. Яковлев. - Волгоград: Изд-во ВолГУ, 2009. - 32 с). Имеется лишь небольшое количество сообщений, посвященных исследованию этих аспектов биологического действия НЧ; в отдельных работах изучается состояние репродуктивной системы экспериментальных животных - кроликов и крыс (Сычева, Л. П. Оценка мутагенных свойств наноматериалов / Л.П. Сычева // Гигиена и санитария. - 2008. - № 6. - С. 26-28; Boisen, A.M. NanoTIO(2) (UVitan) does not induce ESTR mutations in the germline of prenatally exposed female mice I A.M.Boisen, T. Shipley, P. Jackson et al. II Part. Fibre Toxicol. - 2012. - Vol. 9. - P. 9-19; Hsu, P.С Quantum dot nanoparticles affect the reproductive system of Caenorhabditis elegans I P.C. Hsu, M. O Callaghan, N. Al-Salim, M.R. Hurst II Environ. Toxicol. Chem. - 2012. - Vol. 31, N 10. - P. 2366-2374). Сообщалось о влиянии НЧ на ткань плаценты человека (Juch, Н. Nanomaterial interference with early human placenta: Sophisticated matter meets sophisticated tissues II H. Juch, L. Nikitina, P. Debbage et al. II Reprod. Toxicol. - 2013. - 39 p.).
Исследовано воздействие УНМ на репродуктивную функцию самцов мышей (Гусев А.А., 2010). В течение 30 суток животным опытной группы перорально вводился УНМ путем замены питьевой воды на коллоидный водный раствор. Среднесуточная доза исследуемого материала на каждого самца в экспериментальной группе составляла 30 мг/кг. По истечении срока экспозиции к каждой особи подсаживалось по 3 половозрелых неэкспонированных самки. Через 3 суток совместного содержания фиксировали наличие сперматозоидов во влагалищных мазках самок, после чего их отсаживали в отдельные клетки. Внешних изменений в экспериментальной группе отмечено не было. Последующее наблюдение за самками позволило установить, что углеродный наноматериал, вводимый перорально в исследуемой дозировке, вызывает угнетение репродуктивной функции самцов. Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что наряду с такими органами, как печень, селезенка и легкие, органами-мишенями для наночастиц являются и семенники (Гусев, А.А. Гендерные различия физиологического эффекта углеродного наноструктурного материала - перспективного носителя лекарственных препаратов в эксперименте на лабораторных мышах / А.А. Гусев, И.А. Полякова, А.Г. Ткачев и др. // Научные ведомости Белогородского государственного университета. Серия: Естественные науки. - Белгород, 2010. - Т. 21, № 13. - С. 107-112). Присутствие в ткани достаточно длинных и жёстких (многослойных) нанотрубок вызывает изменение активности макрофагов (Насибуллаев, НТК. Фуллерены, их производные и нанотрубки [Электронный ресурс]. URL: http://originweb.info/education/chemistry/fullerenes6.litml).
В результате поступления наноматериала в организм животного, возможно появление хромосомных аббераций, большинство которых возникает у отца (Уйба, В.В. Разработка медико-биологического обеспечения безопасности в области нанотехнологий [Электронный ресурс] /В.В.Уйба // URL: http:// rusnanotech08. rusnanoforum.ru/sadm_files/disk/Docs/l/7/14.pdf). Одним из сопутствующих эффектов воздействия УНМ на мышей является повышенный синтез гормонов - кортикостероидов, катехо л аминов. Гормональные сдвиги способны вызывать адаптивные изменения на уровне ЦНС, в частности в гипоталамусе, в результате чего возможны изменения секреции в нем гормона гонадолиберина; при этом снижается выделение лютеинизирующего гормона, действующего на находящиеся в семенниках клетки Лейдига, которые в ответ выделяют гормон тестостерон. Это впоследствии может обусловить изменения в функционировании репродуктивной системы самцов мыши (Кэттайл, В.М. Патофизиология эндокринной системы / В.М. Кэттайл, Р.А. Арки. - СПб.: Невский диалект, 2001. - 336 с). Таким образом, изменение гормонального баланса под воздействием наноматериала могло привести к угнетению репродуктивной функции на уровне гуморальной регуляции сперматогенеза (Гусев, А.А. Половые различия физиологического эффекта углеродного наноструктурного материала - перспективного носителя лекарственных препаратов в эксперименте на лабораторных мышах / А.А. Гусев, И.А. Полякова, А.Г. Ткачев и др. // Научные ведомости Белогородского государственного университета. Серия: Естественные науки. - Белгород, 2010. - Т. 21, № 13. - С. 107-112).
Эффекты воздействия НЧ серебра на сперматогенез выявлены у экспериментальных животных (Braydich Stolle, L. In vitro toxicity of nanoparticles in mammalian germline stem cells IL. Braydich Stolle, Saber Hussain II Toxicol. Sci. -2005. - Vol. 88, N 2. - P. 412-419; Gomes, S.I. Mechanisms of response to silver nanoparticles on Enchytraeus albidus (Oligochaeta): Survival, reproduction and gene expression profile I S.I. Gomes, A.M. Soares, J.J. Scott-Fordsmand, M.J. Amorim II Hazard Mater. - 2013. - Vol. 15. - P. 254-255). НЧ серебра с бактерицидной целью более 10 лет применяются в медицине в костных имплантантах, перевязочных и других материалах (Alt, V. An in vitro assessment of the antibacterial properties and cytotoxicity of nanoparticulate silver bone cement I V. Alt, T. Bechert, P. Steinrucke II Biomaterials. - 2004. - Vol. 25. - P. 4383-4391).
Оценка биологических эффектов наноматериалов разной природы на репродуктивный потенциал человека и животных неразрывно связана с изучением закономерностей их проявления. На сегодняшний день преобладающее количество работ посвящено изучению свойств наноматериалов in vitro на уровне отдельных молекул (селективная адсорбция высокомолекулярных соединений, стабилизация и изменение с их помощью активности ферментов и т.д.) и клеточных культур (выявление механизмов взаимодействия с клеточной мембраной, влияние на экспрессию отдельных генов и т.д.). В то же время, в доступной литературе практически отсутствуют сведения о влиянии различных видов наноматериалов на организменном уровне, в том числе на ткани и органы репродуктивной системы.
Методы вариационно-статистического анализа полученных данных
В условиях поступления в организм УНМ «Таунит» различных концентраций отклонений в массе легких не выявлено (р 0,05), хотя у экспериментальных животных наблюдалась похожая тенденция: снижение показателя под действием низких доз наноматериала (1,2 мг/кг), с последующей нормализацией (УНМ 6 мг/кг) и увеличением значений (УНМ 30 и 150 мг/кг).
На рисунке 6 представлены среднегрупповые значения массы желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) у самок белой мыши в экспериментальных группах, по отношению к контрольной.
При поступлении в организм УНМ «Таунит» в дозировках 30 и 150 мг/кг наблюдается увеличение массы ЖКТ на 16,5 и 15,9 % соответственно (р 0,05). В то же время увеличение массы отмечалось и у особей в группах № 1 и 2, но данные изменения не являлись достоверными (р 0,05).
При извлечении ЖКТ у самок экспериментальной группы отмечался выраженный специфический запах, который, возможно, свидетельствует о протекающих бродильных процессах и нарушении микрофлоры толстого кишечника в результате перорального поступления УНМ «Таунит».
Среднегрупповые характеристики массы ЖКТ мышей экспериментальных групп по отношению к контрольной (%) Примечание: - различия достоверны (р 0,05) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе.
Очевидно, что влияние многостенных углеродных нанотрубок проявляется в гипертрофии не только тканей ЖКТ, но и других органов, снабженных гладкой мускулатурой.
На рисунке 7 представлены среднегрупповые показатели массы печени самок мышей в условиях поступления в организм УНМ «Таунит» различных доз.
В подопытной группе с дозой УНМ 1,2 мг/кг наблюдалось снижение массы данного органа на 13,9 % по сравнению с контрольной (р 0,05). Более высокие концентрации наноматериала вызывали обратный эффект, что проявлялось тенденцией к увеличению массы печени в группах № 2 и 3, соответственно на 1,9 и 2,0 %, однако данные различия не были достоверны. Возможно, некоторое увеличение органа обусловлено возрастанием массы соединительной ткани, либо происходит за счет увеличения ткани паренхимы.
Примечание: - различия достоверны (р 0,05) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе.
У 35% особей экспериментальных групп цвет печени был несколько темнее, чем у животных контрольной группы, что в свою очередь может быть следствием замедления венозного оттока в данном органе (рисунок 8).
На рисунке 9 показаны среднегрупповые значения массы почки у самок белой мыши экспериментальных и контрольной групп. При концентрации УНМ «Таунит» 1,2 мг/кг выявлено снижение массы данного органа на 14,0 % (р 0,05). При дозе УНМ 6 и 30 мг/кг отмечается разнонаправленные сдвиги показателей (р 0,05). В первом случае наблюдается тенденция к увеличению массы на 8,05 %, во втором - к снижению на 4,9 %. Максимальная доза (УНМ 150 мг/кг) вещества оказывает стимулирующий эффект, вызывая повышение значений на 10 % (р 0,05). A
Печень самки белой мыши при поступлении УНМ «Таунит» Примечание: А - контрольная группа; Б - экспериментальная группа. Основное свойство наноматериалов - это способность к аккумуляции и тропность к различным органам и тканям организма. Так как почки представляют собой основной отдел выделительной системы, возможно, наблюдаемые отличия являются следствием гипо- и гипертрофии, которая в свою очередь развивается за счет изменений в клубочках и извитых канальцах из-за поступления и накопления УНМ «Таунит».
Примечание: - различия достоверны (р 0,05) по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе.
На рисунке 10 представлены среднегрупповые значения массы селезёнки у самок белой мыши в условиях поступления в организм УНМ «Таунит» различных концентраций. Во всех экспериментальных группах отмечена тенденция к снижению показателей данного органа, по мере увеличения дозы наноматериала.
Таким образом, в группах № 1 (УНМ 1,2 мг/кг), № 2 (УНМ 6 мг/кг) и № 3 (УНМ 30 мг/кг) отмечались не достоверное изменение массы селезенки (-6,81...-10,25 %) (р 0,05), тогда как концентрация УНМ 150 мг/кг приводила к уменьшению показателей этого органа на 19,45 % (р 0,01), что, возможно, связано с гипотрофией вследствие истощения иммунной системы при ее перенапряжении в ходе адаптационных процессов.
На рисунке 11 представлены среднегрупповые значения массы тимуса в экспериментальных группах. У всех подопытных животных этот показатель имел тенденцию к увеличению, но его динамика не зависела от концентрации УНМ «Таунит» в растворе.
Рисунок 11 - Среднегрупповые характеристики массы тимуса мышей экспериментальных групп по отношению к контрольной (%) Возможно, некоторое увеличение массы тимуса в экспериментальных группах обусловлено разрастанием соединительной и жировой ткани, которое происходит при поступлении в организм УНМ «Таунит» или является результатом активации иммунной системы.
У подопытных животных всех групп наблюдалась тенденция к увеличению массы данного органа, но полученные результаты не являлись статистически значимыми (р 0,05) и не отражали зависимости от дозы вводимого вещества.
Однако мы можем утверждать, что данный орган является щитовидной железой лишь по анатомическому расположению и внешнему строению (рисунок 13), так как реакция с крахмалом не дала должного окрашивания. По-видимому, при поступлении в организм животных МУНТ происходят не только морфологические, но и функциональные изменения тиреоцитов, в результате чего клетки щитовидной железы не усваивают йод, поступающий в организм животного с кормом и питьевой водой. При этом также наблюдалась гипертрофия лимфатических сосудов и узлов, окружающих щитовидную железу. Гипертрофия лимфатических сосудов обусловлена в основном развитием в них пучков гладкой мускулатуры, что наблюдается при застое лимфы и является приспособительной гипертрофией стенок лимфатической системы в условиях ее перегрузки.
Сравнительная оценка среднегрупповых значений массы матки и яичников у самок белых мышей в экспериментальных и контрольной группах показала выраженные отклонения этого показателя от контрольных значений (р 0,001) (рисунок 14).
Поступление УНМ «Таунит» вызывает увеличение массы матки с яичниками во всех подопытных группах. При концентрации УНМ 6 мг/кг наблюдается повышение на 63,21 % (р 0,05); УНМ 30 мг/кг - на 65,49 % (р 0,01); УНМ 150 мг/кг - на 56,7 % (р 0,01).
Таким образом, в результате поступления в организм УНМ «Таунит» в различных концентрациях у самок белой мыши наблюдается дозозависимое изменение показателей массы сердца, ЖКТ, печени, почек, в виде снижения при низких и увеличении - при высоких дозах вещества. Обратная зависимость наблюдается в отношении селезенки, масса которой уменьшается, по мере возрастания концентрации УНМ «Таунит» до 150 мг/кг. 4.2. Анатомо-морфологические изменения у белых мышей при воздействии
Для дальнейшего исследования эффектов УНМ «Таунит» при пероральном поступлении в организм самок белых мышей нами использовалась дозировка 450 мг/кг, исходя из предварительных экспериментов на других тест-объектах, результатов, полученных на 1 этапе работы и литературных данных о подобных опытах (Гусев, А.А. Влияние углеродных нанотрубок на ранние стадии онтогенеза мышей (Mus Domestica Linnaeus, 1758) I А.А. Гусев, А.В. Емельянов, СВ. Шутова и др. // Современные проблемы контроля качества природной и техногенной сред / Материалы Всероссийской научно-практической конференции.- Тамбов, 2009. - С. 78-79; Горшенёва, Е.Б. Углеродный наноструктурный материал - перспективный вектор доставки лекарственных препаратов меняет некоторые функциональные показатели самок Mus musculus L. при пероральном введении / Е.Б. Горшенёва, А.А. Гусев, СВ. Шутова и др. // Вестник тамбовского университета. Серия: Естественные и технические науки. Т. 16, № 1 - Тамбов, 2011.- С. 273-277; Убогов, А.Ю. Углеродные нанотрубки как фактор развития воспалительного процесса в печени мышей / А.Ю. Убогов, И.А. Полякова, А.А. Гусев и др. // Вестник тамбовского университета. Серия: Естественные и технические науки. Т. 16, № 5- Тамбов, 2011.- С. 1338-1343). Исследование показало, что суточное потребление сухого корма и воды подопытными животными при поступлении в организм УНМ «Таунит» (450 мг/кг) не отличалось от показателей контрольной группы (р 0,05). На рисунке 15 представлены среднегрупповые значения метрических характеристик самок белых мышей.
Состояние периферической крови и печени мышей при поступлении в организм УНМ «Таунит»
На первом этапе исследования были изучены макроскопические показатели при поступлении в организм самок белых мышей УНМ «Таунит» в различных концентрациях. Низкие дозы вещества (УНМ 1,2 мг/кг) оказывают угнетающий эффект, который наиболее выраженно проявляется в снижении массы тела (на 7,7 %) на 28 сутки эксперимента. Увеличение дозы УНМ «Таунит» до 150 мг/кг приводит к скачкообразному возрастанию данного показателя, который на 28 и 63 сутки эксперимента достигает максимальных значений (+6,0... +6,2 %) (р 0,05).
Следует отметить, что 28-и суточная экспозиция является критической, что выражается в достоверном изменении показателей (р 0,05). Возможно к этому сроку УНМ «Таунит» аккумулируется в достаточном количестве в органах и тканях.
Оценка динамики длины тела выявила увеличение показателя, сходное у всех исследуемых самок, при этом только у животных группы № 1 (УНМ «Таунит» 1,2 мг/кг) длина тела была ниже на 0,23-0,34 см (р 0,05), чем в других группах (УНМ 6; 30 и 150 мг/кг), начиная с 28 суток и до окончания эксперимента.
При минимальной (1,2 мг/кг) дозе вещества наблюдается также тенденция к уменьшению массы сердца, с последующим достоверным ростом показателя на 15,6 % (р 0,01) по мере возрастания концентрации УНМ «Таунит» до 150 мг/кг. Возможно, это обусловлено гипертрофией миокарда, что связано с выявленным увеличением массы других внутренних органов (лёгкие, желудочно-кишечный тракт, печень, почки, тимус, щитовидная железа).
В условиях поступления в организм УНМ «Таунит» различных концентраций отклонений в массе легких не выявлено (р 0,05), хотя у экспериментальных животных наблюдалась похожая тенденция: снижение показателя под действием низких доз наноматериала (1,2 мг/кг), с последующей нормализацией (УНМ 6 мг/кг) и увеличением значений (УНМ 30 и 150 мг/кг). УНМ в дозировках 30 и 150 мг/кг вызывает повышение массы ЖКТ на 16,5 и 15,9 % соответственно (р 0,05). Очевидно, что влияние многостенных углеродных нанотрубок проявляется в гипертрофии не только тканей ЖКТ, но и других органов, снабженных гладкой мускулатурой.
В группе № 1 (УНМ 1,2 мг/кг) наблюдалось снижение массы печени на 13,9 % по сравнению с контрольной (р 0,05). Более высокие концентрации наноматериала вызывали обратный эффект, что проявлялось тенденцией к увеличению массы данного органа в группах № 2 и 3, соответственно на 1,9 и 2,0 %, однако данные различия не были достоверны. Возможно, некоторое увеличение органа обусловлено преобладанием массы соединительной ткани, либо происходит за счет возрастания ткани паренхимы.
При концентрации УНМ «Таунит» 1,2 мг/кг выявлено также снижение массы почек на 14,0 % (р 0,05). При дозе УНМ 6 и 30 мг/кг отмечается разнонаправленные сдвиги показателей (р 0,05). В первом случае наблюдается тенденция к увеличению массы на 8,05 %, во втором - к снижению на 4,9 %. Максимальная доза (УНМ 150 мг/кг) вещества оказывает стимулирующий эффект, вызывая повышение значений на 10 % (р 0,05).
Основное свойство наноматериалов - это способность к аккумуляции и тропность к различным органам и тканям организма. Так как почки представляют собой основной отдел выделительной системы, возможно, наблюдаемые отличия являются следствием гипо- и гипертрофии, которая в свою очередь развивается за счет изменений в клубочках и извитых канальцах из-за поступления и накопления УНМ «Таунит».
Во всех экспериментальных группах отмечено снижение массы селезенки, по мере увеличения концентрации наноматериала в растворе. Дозировка УНМ 150 мг/кг приводила к уменьшению показателей данного органа на 19,45 % (р 0,01), что, возможно, связано с гипотрофией вследствие истощения иммунной системы при ее перенапряжении в ходе адаптационных процессов.
Поступление УНМ «Таунит» вызывает повышение массы матки с яичниками во всех подопытных группах. При дозировке УНМ 6 мг/кг наблюдается увеличение показателей на 63,21 % (р 0,05); УНМ 30 мг/кг - на 65,49 % (р 0,01); УНМ 150 мг/кг - на 56,7 % (р 0,01).
В результате поступления в организм МУНТ в различных концентрациях у самок белой мыши наблюдается дозозависимое изменение показателей массы сердца, ЖКТ, печени, почек, в виде снижения при низких, и увеличения при максимальных дозах вещества. Обратная зависимость наблюдается в отношении селезенки, масса которой уменьшается, по мере возрастания концентрации УНМ «Таунит». У всех мышей независимо от дозы вводимого наноматериала было отмечено стойкое увеличение массы ЖКТ, матки с яичниками и снижение массы селезёнки.
На втором этапе была выполнена оценка анатомо-морфологических показателей белых мышей при поступлении в организм УНМ «Таунит» в дозировке 450 мг/кг. Данная концентрация была выбрана исходя из предварительных экспериментов на других тест-объектах, результатов, полученных на 1 этапе работы и литературных данных о подобных опытах (Гусев, А.А. Предварительные результаты комплексного биотестирования углеродного наноматериала - перспективного носителя лекарственных препаратов / А.А. Гусев, О.Н. Зайцева, И.А. Полякова, Е.Б. Горшенёва // Вестник тамбовского университета. Серия: Естественные и технические науки. - Тамбов, 2010. - Т. 15. -№ 5. - С. 1538-1541; Горшенёва, Е.Б. Углеродный наноструктурный материал -перспективный вектор доставки лекарственных препаратов меняет некоторые функциональные показатели самок Mus musculus L. при пероральном введении / Е.Б. Горшенёва, А.А. Гусев, СВ. Шутова и др. // Вестник тамбовского университета. Серия: Естественные и технические науки. - Тамбов, 2011. - Т. 16. -№ 1. - С. 273-277). Установлено отсутствие различий в суточном потреблении сухого корма и воды животными, а также по показателям общей длины тела, длины лап, хвоста, туловища, головы на момент окончания эксперимента (45 сутки) по сравнению с контрольной группой (р 0.05). Однако масса тела в целом была выше на 2,74 г. (р 0,05) у мышей экспериментальной группы, что связано с увеличением массы внутренних органов подопытных животных.
