Содержание к диссертации
Введение
1. Введение
2. Обзор литературных данных 11
2.1. Строение пнк 11
2.2. Строение и свойства дуплексов пнкуднк и пнк/рнк 14
2.3. Строение и свойства триплексов пнкуднк. 18
2.4. Бис-пнк 20
2.5. Биологические действия пнк 23
2.6. Применение пнк 28
2.7. Специфичность триплексов шш2/днк 32
2.8. Стабильность триплексов пнк2/днк 39
2.9. Полиморфизм комплексов, образуемых бис-пнк с днк 42
2.10. Задачи данной работы 43
3. Материалы и методы 45
3.1. Препараты пнк 45
3.2. Препараты днк 47
3.3. Образо bah ие комплексов пнк/днк 47
3.4. Плавление 48
3.5. Кинетика диссоциации 51
3.6. Изучение полиморфизма комплексов пнк с днк 52
4. Исследование стабильности триплексов пнк,/днк: термодинамические параметры стабильности; факторы, влияющие на стабильность. 54
4.1. Плавление триплексов пнкуднк. Термодинамические параметры стабильности. 54
4.2. Влияние электростатических взаимодействий на стабильность триплексов инк с однонитевой и двунитевой днк 64
4.3. Влияние структурных модификаций инк на стабильность триплексов бис-пнк/днднк 72
5. Исследование полиморфизма комплексов бис-пнк с днк 77
5.1. Полиморфизм комплексов, образованных на двунитевой днк. 77
5.2. Полиморфизм комплексов, образованных на однонитевой днк. 92
5.3. Закономерности полиморфизма комплексов бис-пнк/днк 101
Выводы 105
- Строение и свойства дуплексов пнкуднк и пнк/рнк
- Применение пнк
- Препараты днк
- Влияние электростатических взаимодействий на стабильность триплексов инк с однонитевой и двунитевой днк
Введение к работе
Актуальность проблемы. Усилия исследователей в течение последних десятилетий были направлены на поиск агентов, способных связываться с определенными участками молекул ДНК и РНК и управлять их функциями. Конечной целью подобных исследований является создание диагностических и генно-терапевтических средств, направленных против бактериальных и вирусных инфекций, наследственных болезней, онкологических заболеваний. ПНК1 превосходит другие подобные средства как по прочности комплексов, которые она образует на комплементарных сайтах ДНК и РНК, так и по специфичности связывания. В настоящее время ПНК применяется в различных областях молекулярной биологии, биотехнологии и диагностики. Поэтому исследование стабильности её комплексов не только представляет интерес с точки зрения фундаментальной науки, но и является весьма актуальным для выбора оптимальных условий практического применения. Среди комплексов ПНК с нуклеиновыми кислотами особое место занимают триплексы ПНК/ДНК, образующиеся при взаимодействии гомопиримидиновой ПНК с комплементарным сайтом однонитевой и двунитевой ДНК. Благодаря двустадийному механизму образования, триплексы ПИК/ДИК могут обладать уникальным сочетанием очень высокой стабильности и сильной специфичности.
В качестве характеристики стабильности комплексов нуклеиновых кислот чаще всего используется температура их плавления Тш. Однако при плавлении триплексов ПНК/ДНК наблюдается сильный гистерезис, что делает невозможным получение равновесных кривых плавления. В связи с этим точные количественные характеристики плавления триплексов ПНК/ДНК долгое время оставались не измеренными.
Стабильность триплексов существенно зависит от ряда факторов, таких как состав ПНК и последовательность оснований, особенности строения
1 Спичи «нфлшсннн IIJIK- пенники н) клеиномл кнетхм: он ДНК -г трщіфаНІЩИОНАЛЬНААі щ дцк.
СН&ЛИОТЕКА
СП«т*Р
о»
арль
основной цепи ПНК, а также линкера в случае бис-ПНК, температура, ионная сила и рН раствора. Варьирование этих факторов дает возможность получать как более, так и менее стабильные комплексы в зависимости от конкретных практических целей. В свете постоянно растущих возможностей применения ПНК исследование зависимости стабильности триплексов от этих факторов является весьма актуальным.
Ранее малоизученное явление полиморфизма комплексов гомопиримидиновой бис-ПНК с ДНК заключается в том, что при определенных условиях на одной и той же мишени ДНК молекулы бис-ПНК одновременно образуют несколько типов структурно-изомерных комплексов. Это явление ранее отмечалось в нескольких работах, однако на момент начала наших исследований не было опубликовано ни одной работы, посвященной его изучению. Между тем, совершенно очевидно, что явление полиморфизма не только вносит новый уровень сложности во все задачи, связанные с ПНК, но и может оказать существенное влияние на потенциальное применение ПНК, особенно в терапевтических целях. Таким образом, поставленная задача изучения полиморфизма комплексов бис-ПНК с ДНК является актуальной, а все полученные результаты - новыми.
Цели и задачи исследования. Основной целью настоящей работы было исследовать стабильность и явление полиморфизма триплексов, образованных молекулами гомопиримидиновой ПНК с ДНК. В работе решались следующие задачи:
1. Исследовать стабильность триплексов ПНК/ДНК методом
равновесного плавления. Найти термодинамические параметры стабильности
триплекс ов ПИК/ДИК
-
Исследовать путем измерения эффективного времени жизни влияние электростатических взаимодействий на стабильность триплексов ПНК/ДНК.
-
Исследовать полиморфизм комплексов бис-ПНК/ДНК
Научная новизна работы. В данной работе впервые проведено систематическое исследование стабильности триплексов ПНК/ДНК методом равновесного плавления. Найдены термодинамические параметры плавления. Показано, что значение свободной энергии стабилизации триплексов превышает соответствующее значение для дуплексов ПНК/ДНК в 2-3 раза. Путем измерения эффективного времени жизни изучено влияние на стабильность триплексов бис-ПНК/ДНК величины и локализации на молекуле бис-ПНК положительных зарядов. Изучено явление полиморфизма комплексов, образуемых молекулами гомопиримидиновых бис-ПНК на однонитевой и двунитевой ДНК. Исследованы образование, стабильность и превращения всех структурных изомеров. Построена кинетическая модель диссоциации изомеров, позволяющая определить параметры распада. Обнаружено явление стабилизации структурно-стехиометрическо го изомера S1 в присутствии комплементарного к бис-ПНК однонитевого олигонуклеотида. Предложена структура стабилизированного изомера S1. Исследована зависимость выхода изомеров S1 и S2 на онДНК от концентрации бис-ПНК и сформулирована кинетическая модель их образования.
Публикации. Основные результаты проведенных исследований отражены в пяти печатных работах, в том числе в трех статьях в рецензируемых журналах.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из Введения, Обзора литературных данных, методического раздела, двух разделов, посвященных изложению и обсуждению результатов, и Выводов. Работа изложена на 118 страницах, включает 4 таблицы и 33 иллюстрации. Библиография включает 87 наименований.
Строение и свойства дуплексов пнкуднк и пнк/рнк
Строение и свойства дуплексов ПНК/ДНК и ПНК/РНК ПНК с произвольной последовательностью оснований образует с комплементарными молекулами однонитевой ДНК и РНК дуплексы, стабильность которых, благодаря нейтральности основной цепи ПНК, превышает стабильность дуплексов ДНК/ДНК. ПНК может связываться с нуклеиновыми кислотами как в параллельной, так и в антипараллельной ориентации (Nielsen & Egholm, 1999; Peffer et al, 1993; Egholm et al, 1993). Ориентация называется параллельной, если N-конец ПНК и 5 -конец олигонуклеотида направлены в одну сторону. Схема дуплекса ПНК/ДНК в антипараллельной ориентации приведена на рис. 3. Структура антипараллельного ПНК/ДНК дуплекса H-GCTATGTC-NH2-5 d(GACATAGC) была определена при помощи ЯМР (Eriksson & Nielsen, 1996), Она представляет собой правую уотсон-криковскую двойную спираль. Длина витка спирали составляет приблизительно 42 А, на виток приходится 13 пар оснований, диаметр спирали около 23 Л. Карбонильные группы линкеров оснований ориентированы вдоль остова в направлении С-конца. Первичные амидные основания находятся в транс конфигурации. Подобно В-форме ДНК, сахарные кольца цепи ДНК преобладают в С2 -эндо конформации. Однако торсионные углы основания а, р\ у, I; и С, близки к тем же углам в А-форме ДНК (Eriksson & Nielsen, 1996). Таким образом, дуплекс ПНК/ДНК не может быть описан ни как А, ни как В форма, а скорее, обладает особенностями обеих. Отметим, что структура параллельных ПНК/ДНК и ПНК/РНК дуплексов существенно отличается как от структуры аналогичных антипараллельных дуплексов, так и от двунитевой ДНК (Hyrup & Nielsen, 1996, Egholm et al, 1993). Стабильность комплексов, образуемых ПНК, часто оценивается по их температуре равновесного плавления Т1П, которая определяется как температура, при которой распалось 50% комплекса. Как правило, измерение температуры плавления проводится по поглощению в ультрафиолетовом диапазоне (UVM). При низких значениях ионной силы температура плавления антипараллельного 15-членного дуплекса ПНК/ДНК смешанного состава может превышать Тш дуплекса ДНК/ДНК на несколько десятков градусов (Eriksson & Nielsen, 1996).
Исключительная стабильность комплексов ПНК/ДНК объясняется электронейтральностью остова молекулы ПНК и, следовательно, отсутствием электростатического отталкивания между ПНК и ДНК. Анализ кривых плавления в рамках модели двух состояний позволяет определить термодинамические параметры плавления дуплексов ПНК/ДНК (Schwarz et al., 1999; Chakrabarti & Schwarz, 1999). Эти данные будут приведены ниже в сравнении с экспериментальными данными, полученными в настоящей диссертационной работе для триплексов ПНКз/ДНК. Антипараллельные дуплексы ПНК/ДНК образуются значительно быстрее аналогичных параллельных дуплексов и обладают большей термической устойчивостью (Nielsen & Egholm, 1999; Тотас et al., 1996). Разница в температуре плавления 15-членных дуплексов ПНК/ДНК разной ориентации составляет более 15С (Eriksson & Nielsen, 1996). Таким образом, антипараллельная ориентация является предпочтительной. Температура плавления дуплексов ПНК/ДНК с повышением ионной силы немного снижается (Egholm et at, 1993). Этот эффект имеет обратный знак и значительно слабее соответствующего эффекта, известного для комплексов ДНК/ДНК. Зависимость Тт от ионной силы для дуплексов ПНК/ДНК и ДНК/ДНК представлена на рис. 4. Наибольшая разница в температурах плавления достигается при минимальных значениях ионной силы, при повышении ионной силы до 1 OOOmM Na+ зависимости сходятся. Зависимость Tm от ионной силы для дуплексов ПНК/ДНК носит энтропийный характер. Эта зависимость указывает на выход противоионов в раствор при образовании комплексов ПНК/ДНК (Тотас et al.s 1996). В обратную зависимость, наблюдаемую для двунитевой ДНК, вносит вклад как энтропийный эффект связывания противоионов из раствора, так и степень прямого экранирования электростатического отталкивания. В комплексах ПНК с нуклеиновыми кислотами выполняются все правила уотсон-криковского спаривания. Мисметчи в дуплексах ПНК/ДНК приводят к большей дестабилизации, чем в случае ДНК/ДНК (Dueholm & Nielsen, 1997). Мисметч в середине пентадекамера ПНК/ДШС приводит к снижению температуры плавления на 8-20С (Нугир & Nielsen, 1996). На практике для образования комплексов с нуклеиновыми кислотами используются молекулы ПНК длиной 10-12 оснований. Такой длины достаточно для обеспечения высокой стабильности комплексов в сочетании с высокой специфичностью. В работе (Chakrabarti & Schwarz, 1999) стабильность дуплексов ПНК/ДНК изучена методом дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Полученные значения температуры перехода и термодинамических параметров в пределах точности измерений совпали с аналогичными данными, измеренными методом плавления (UVM). Следует отметить, что экстраполяция этих данных к комнатной температуре приводит к расхождению с результатами, полученными методом изотермической титрующей калориметрии (ITC). Это связано с различиями в структуре молекул одноцепочечных ПНК и ДНК при температуре плавления комплекса ПНК/ДНК и при комнатной температуре (Schwarz et ah, 1999; Chakrabarti & Schwarz, 1999; Tomac et ah, 1996). Две комплементарные цепи ПНК могут образовывать очень стабильные ПНК/ПНК - дуплексы. В этом случае антипараллельная ориентация цепей также более предпочтительна. Однако и дуплексы с параллельной ориентацией значительно более стабильны, чем соответствующие дуплексы ДНК/ДНК с той же последовательностью оснований (Eriksson & Nielsen, 1996; Нугир & Nielsen, 1996; Wittung et ah, 1994). Высокая специфичность указывает на то, что образование дуплексов ПНК/ПНК подчиняется правилам уотсон-криковского узнавания (Wittung et ah, 1994). Следует отметить, что температура плавления дуплексов ПНК/ПНК практически не зависит от ИОННОР силы, что связано с нейтральностью остова ПНК (Тотас et al, 1996). Дуплексы ПНК/ПНК находятся в так называемой Р-форме, отличающейся от А- и В-форм ДНК большим диаметром спирали (28 А) и числом пар оснований на виток (18 b.p.) (Nielsen & Egholm, 1999). 2.3. Строение и свойства триплексов ПНК2/ДНК.
Гомопиримидиновые ПНК образуют триплексы на комплементарных гомопуриновых сайтах однонитевои и двунитевои ДНК (Nielsen & Egholm, 1999; Eriksson & Nielsen, 1996; Dueholm & Nielsen, 1997; Hyrup &. Nielsen, 1996), В состав таких триплексов входят две нити ПНК и одна нить ДНК. Одна нить ПНК связывается с комплементарной нитью ДНК уотсон-криковскими, а другая - хутстиновскими водородными связями. В случае двунитевои ДНК одновременно происходит вытеснение второй, гомопиримидиновой нити ДНК. Большей устойчивостью обладают триплексы, у которых уотсон-криковская нить ПНК антипараллельна направлению ДНК, тогда как хугстиновская - параллельна. При этом формируются триады Т- А-Т и C+-G-C, структура которых представлена на рис. 5. Наибольший интерес для исследования и практического применения представляет триплекс, образующийся при взаимодействии гомопиримидиновых ПНК с двунитевой ДНК. Как уже было отмечено, гомопиримидиновая ПНК способна вытеснять пиримидиновую цепь ДНК-дуплекса и связываться с пуриновой нитью. При этом вторая нить ПНК ложится в большой желобок образовавшегося дуплекса, образуя триплекс, состоящий из двух нитей ПНК и пуриновой нити ДНК. Этот комплекс получил название триплекса с вытеснением или Р-петли (Nielsen & Egholm, 1999; Eriksson & Nielsen, 1996; Dueholm & Nielsen, 1997; Hyrup & Nielsen, 1996). Его схема приведена на рис. 7. Для исследования структуры таких триплексов и локализации их на молекуле ДНК применялись ферментативное зондирование (нуклеазой SI) (Chemy et al, 1993), химическое зондирование (КМп04 и др.) (Nielsen et al, 1994) и прямое наблюдение в электронный микроскоп (Demidov et al, 1994а). Образование триплексов с днДНК требует локального флуктуационного раскрытия двойной спирали. Поэтому их образование осуществляется обычно при низкой ионной силе (до 50 mM) (Wittung et al, 1996). Энергия активации реакции связывания значительно
Применение пнк
Уникальное сочетание специфичности и стабильности комплексов ПНК с нуклеиновыми кислотами, а также биологическое действие комплексов ПНК обуславливают широкие возможности применения ПНК в молекулярной биологии, биотехнологии и медицине. Многочисленные работы показали, что ПНК не только пригодна для использования практически во всех методах, разработанных на основе олигонуклеотидов, но и дает большое количество преимуществ по сравнению с ними. Так, например, на базе ПНК оказалось возможным разработать систему редкощепящих искусственных рестриктаз, основанных на принципе «Ахиллесовой пяты». Такого рода рестрюстазы позволяют решить задачу расщепления геномных ДНК на небольшое число фрагментов большой длины, что очень важно для работы с большими геномами. Общая схема метода Ахиллесовой пяты заключается в следующем. ДНК в комплексе с агентом, специфически связанным с сайтами метилирования, обрабатывают метилазой. Если применяемый агент защищает занятые им сайты от метилирования, то после инактивации метилазы и удаления агента лишь эти сайты оказываются доступными для рестриктазы, соответствующей использованной метилазе, и по ним происходит разрезание молекулы ДНК. В качестве агентов ранее применялись олигонуклеотиды и некоторые белки. Однако, это не смогло решить проблему получения действительно редко- и специфически-щепящих искусственных рестриктаз. Такого рода агенты требуют больших по длине мишеней. Подобные сайты с заданной последовательностью, к тому же хотя бы частично перекрывающие сайты метилирования и рестрикции или примыкающие к ним, встречаются статистически крайне редко; их вообще может не оказаться в целом геноме. Гомопиримидиновая ПНК оказалась агентом, с помощью которого эта задача была решена (Красильникова и др., 1995; Красилъникоеа и др., 1996). В опытах на ДНК фага Х- и на геномной ДНК дрожжей было показано, что, комбинируя короткие ПНК с соответствующими парами метил аз и рестриктаз, можно получить широкий набор редкощепящих искусственных рестриктаз, количественно расщепляющих геномные ДНК на ограниченное число фрагментов длиной от сотен тысяч до миллионов пар нуклеотидов (Veselkov et al, 1996а; Veselkov et al, 1996b). ПНК позволяет проводить специфическую амплификацию фрагментов ДНК путём так называемого "ПНР- клэмпинга" (PCR-clamping).
Этот метод позволяет обнаружить мутантные гены, отличающиеся на одну пару оснований, при стократном избытке генов дикого типа. " ПЦР- клэмпинг" основан на подавлении амплификации генов дикого типа путем связывания ПНК с сайтом, комплементарным праймеру ПЦР для аллелей дикого типа. При этом используется высокое сродство и специфичность ПНК к комплементарным нуклеиновым кислотам и тот факт, что ПНК не является праимером для ДНК-полимераз (ФгитН., 1999). Относительно гидрофобный характер молекулы ПНК и электронейтральность ее основной цепи позволяют расширить возможности получившего широкое распространение для различных диагностических и исследовательских целей метода in situ гибридизации (Thisted et al, 1999). Показано, что применение ПНК в данном методе позволяет повысить чувствительность гистохимических тестов (Thisted et al, 1996). Патогенетический анализ, основанный на флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с использованием ПНК является достаточно чувствительным и самым быстрым из известных методов (Just et ah, 1998). FISH метод с использованием ПНК может успешно использоваться для микробиологического анализа. Так, в работах (Stender et ah, 1999а; Stender et ah, 1999b) продемонстрирована возможность применения метода для диагностики на примере Mycobacterium tuberculosis. Американская фирма AdvanDx (www.advandx.com) предлагает в настоящее время ряд коммерческих диагностических продуктов, действие которых основано на этом методе. Другим потенциальным применением ПНК в микробиологии является идентификация микроорганизмов, таких как бактерии, водоросли или дрожжи в промышленном производстве. Быстрая детекция этих микроорганизмов имеет большое значение в пищевом производстве (Stender et ah, 2000), виноделии (Stender et ah, 2001a), экологическом мониторинге (Stender et al, 2001b). Методы микробиологического анализа с использованием ПНК активно совершенствуются (Stender et ah, 2001с; Stender et al, 200Id; Perry-O Keefe et ah, 2001; Stender et ah, 2002). Если на двунитевой ДНК сайты связывания двух гомопиримидиновых бис-ПНК находятся на расстоянии нескольких пар нуклеотидов, то две отдельных Р-петли сливаются в одну. В результате внутри днДНК образуется достаточно большой открытый фрагмент(етг й?оу et al, 1993; Nielsen etal, 1993b; Nielsen et al., 1994), a пара бис-ПНК выступает в качестве т.н. ДНК-опенеров. Раскрывшийся участок днДНК становится доступным для уотсон-криковского узнавания с образованием т.н. PD-петли (Bukanov et ah, 1998), схема которой представлена на рис. 10. Такая система зависит от специфичного связывания трех лигандов, поэтому она чрезвычайно сайт-специфична. PD-петля может использоваться для выделения днДНК (Demidov et al, 1999; Demidov etal, 2000), для прямого обнаружения специфических ДНК-последовательностей (Broude et al, 1999), для введения в ДНК однонитевой кольцевой олигонуклеотидной метки (Kuhn et al, 1999b; Kuhn et al, 2001; Demidov et al, 2001a), для неденатурирующего секвенирования ДНК (Demidov et al, 2001b). Помимо этого, открытый с помощью ПНК-опенеров участок ДНК становится доступным для ряда ферментов, например для эндонуклеаз, специфичных к однонитевой ДНК. Это позволяет создать еще один тип искусственных редкощепящих рестриктаз, в отличие от метода «Ахиллесовой пяты» не требующий стадии метилирования (Demidov et al, 1993; Demidov & Frank-Kamenetskii, 1999; Demidov & Frank-Kamenetskii, 2002). Корейская фирма Panagene (www.panagene.com) занимается разработкой ПНК-микрочипов. Ясно, что такой продукт будет иметь такой же широкий спектр применения, как и ДНК-микрочипы, но обладать при этом большей точностью и воспроизводимостью результатов, лучшей сохранностью и возможностью повторного использования. Шведская компания LightUp Technologies (www.lightup.se) специализируется на диагностике инфекционных заболеваний с помощью флуоресцентных проб на основе ПНК. Фирма Santaris Pharma (Дания) разрабатывает средства для противораковой терапии, в том числе на основе ПНК (www.santaris.com). Еще раз подчеркнем, что ПНК является перспективным ген-направленным и антисмысловым агентом, и ее применение в медицине может существенно расширяет спектр терапевтических и диагностических средств. 2.7. Специфичность триплексов ПНК2/ДНК Как уже было отмечено, уникальным свойством триплексов ПНК2/ДНК, обеспечивающим самые различные их применения и делающим их на данный момент незаменимыми для решения целого ряда задач, является сочетание высокой стабильности с исключительной специфичностью.
Ниже будут рассмотрены имеющиеся в литературе данные о природе такого сочетания и условиях его реализации, описаны методы измерения стабильности и специфичности. Отдельное внимание будет уделено факторам, оказывающим влияние на стабильность и специфичность. Специфичность триплексов ПНК2/ДНК определяется как отношение числа правильных триплексов, образованных на полностью комплементарной мишени в молекуле ДНК, к числу триплексов, образованных в сайте с одним некомплементарным молекуле ПНК, мисметчным основанием. Для наблюдения за процессом образования триплексов использовались два метода: разрезание с помощью нуклеазы S1 в районе однонитевой Р-петли с последующим определением размеров образовавшихся фрагментов, и метод электронной микроскопии (Cherny et at, 1993; Cherny et ah, 1994; Demidov et ah, 1994a; Красилъникова и Веселкое, 1996). Для визуализации триплекса в последнем случае пользовались биотинилированными молекулами ПНК, С биотином связывается достаточно крупный белок стрептавидин; на электронно-микроскопической картине места расположения триплексов были три этом хорошо видны как точки на нити ДНК. Расположение этих точек отвечало, в пределах экспериментальной погрешности ( 20 п.н.)5 локализации мишеней в ДНК. Эти опыты продемонстрировали возможность применения ПНК для целей картирования гомопуриь-гомопиримидиновых сайтов на длинных геномных ДНК. Однако столь высокая специфичность, когда на электронно-микроскопических снимках наблюдались только совершенные, «правильные» триплексы, достигалась лишь при малых временах инкубации. С увеличением времени инкубации, а также при увеличении концентрации ПНК в растворе, начинают образовываться и непраьильные триплексы, локализованные на других сайтах, отличающихся от комплементарных одним или двумя мисметчами
Препараты днк
Двунитевая ДНК представляла собой фрагмент EcoRI/Hindlll полилинкера плазмиды pUC19 длиной 65 п.н., содержащий вставку dAjo/dTio (мишень для ПНК Ti0 и бис-ПНК 1743) по месту гидролиза ВатНТ или вставку dA2GA2GA4/dT2CT2CT4 (мишень для всех остальных использовавшихся бис-ПНК) по сайту PvuII. Радиоактивную метку Р вводили в оба конца днДНК с помощью фрагмента Клёнова ДНК полимеразы Escherichia coli в присутствии [а- Р]АТФ и трех других, немеченых нуклеотидтрифосфатов (Маниатис и др., 1984) Однонитевая ДНК-мишень для ПНК Т[0 и ПНК 1743 синтезировалась в Лаборатории Молекулярной Биофизики ИМГ РАН. ДНК имела последовательность S -GGATC-AJO-GATCG-S С меткой Р на конце. Метку [у- Р]АТФ вводили с помощью Т4-полинуклеотидкиназы фага X (Маниатис и др., 1984). Для экспериментов по плавлению триплексов ПНКг/ДНК радиоактивная метка в ДНК не вводилась. Мишенью для ПНК 522, ПНК 554, ПНК 2196, ПНК 2197 и ПНК 2199 служила однонитевая ДНК 5 CTCG-AAGAAGAAAACTTC-3 , также синтезированная в ЛМБ и меченная 32Р на конце. Концентрация ДНК определялась спектрофотометрически. 3.3. Образование комплексов ПНК/ДНК В большинстве случаев образование комплексов между ДНК и ПНК проводилось инкубацией наномолярного количества ДНК с избытком ПНК при 37С в течение 60 минут в ЮтМ Na-фосфатном буфере, рН=7,4. В зависимости от условий опыта, для двунитевой ДНК молярный избыток ПНК составлял от нескольких десятков до нескольких тысяч. В случае однонитевой ДНК концентрация ПНК превышала концентрацию ДНК в десятки раз. Исключение составляли эксперименты по плавлению триплекс ов ПНК2/ДНК, для которых образование комплекса бис-ПНК 1743/онДНК проводилось при соотношении молярных концентраций компонентов 1:1. Дело в том, что при концентрациях ПНК и ДНК порядка 10 б М, необходимых для измерения поглощения в ультрафиолетовом диапазоне, для связывания бис-ПНК с однонитевой ДНК не требуется избытка ПНК. Образование комплексов проводилось в том же 10 тМ Na-фосфатном буфере, р№=7,4, время инкубации 60 минут, температура 47С, Отметим, что использование данного буфера обусловлено тем, что его рН лишь очень слабо меняется при нагревании (dpH/dT= - 0,0028 /С (Dawson et al,, J989)), что существенно для измерений при различных температурах. Диапазон рабочих концентраций комплекса бис-ПНК 1743/онДНК составил [0,3 - 24,0] х 10" М. Поскольку при концентрациях, меньших 2 10 6 М и условии эквимолярности концентраций ПНК и ДНК, время полного связывания превышало 1 час, образование комплексов проводили при больших концентрациях с последующим разбавлением. После образования комплекса ионная сила повышалась до рабочих значений путем добавления соответствующего количества 5М раствора NaCl. 3.4.
Плавление Плавление комплекса бис-ПНК 1743/э8ДНК наблюдалось по изменению поглощения ультрафиолетового света с длиной волны 260 нм в спектрофотометре SPECORD М400. Препарат, полученный так, как описано выше, а также буфер сравнения для использования в двулучевом спектрофотометре, предварительно дегазировались в течение 40 минут с помощью форвакуумного насоса для предотвращения появления воздушных пузырьков при последующем нагревании. Затем образцы переносились в кварцевые кюветы. Для обеспечения равновесности наблюдаемые при ультрафиолетовом поглощении коэффициенты экстинкции будут меньше, чем сумма коэффициентов экстинкции отдельных мономеров (Holmen andNorden, 1999). В связи с этим определенные нами спектрофотометрически значения концентраций исходных ПНК и ДНК, вероятно, слегка занижены. Кроме того, в процессе дегазирования также происходит некоторое неконтролируемое изменение концентрации комплекса ПНК/ДНК. Поэтому величину экспериментальной концентрации комплекса Сехр, используемую в дальнейших расчетах, мы определяли по поглощению исследуемого препарата после полного плавления, когда образец имеет температуру около 90С. При этой температуре азотистые основания в молекулах ПНК и ДНК уже не связаны между собой стэкинговыми взаимодействиями, и коэффициенты экстинкции целых молекул практически не отличаются от суммы коэффициентов экстинкции отдельных мономеров. На основании закона Ламберта-Бэра имеем: АПнк СпнкхеПыкх1 Аднк=Сднкхднкх1. Здесь Апнк и Аднк - поглощение расплавленных свободных молекул ПНК и ДНК; єпнк и єднк - коэффициенты экстинкции молекул ПНК и ДНК, равные, на основе вышесказанного, сумме коэффициентов экстинкции отдельных мономеров ПНК и ДНК; 1 - длина оптического пути. С учетом соотношения молярных концентраций ПНК и ДНК 1:1 (т.е. их равенства) получаем для суммарного поглощения после плавления: АКОк = АПнк + Адшс = ОжрХІхЕє и Сстр = Ати/{\хЩ, где Сехр = СПНк= Сднк -экспериментальная концентрация комплекса ПНК/ДНК, 1,е - суммарный коэффициент экстинкции молекул ПНК и ДНК. Следует отметить, что, поскольку, как сказано выше, при приготовлении комплекса ПНК/ДНК мы пользовались несколько заниженными значениями концентраций исходных ПНК и ДНК, может оказаться, что использованное выше равенство молярных концентраций ПНК и ДНК соблюдено не достаточно строго, т.е. одно из веществ может находиться в избытке. Величина наблюдаемого при плавлении комплекса гиперхромного эффекта определяется отношением увеличения поглощения в результате плавления к начальному поглощению. При этом увеличение поглощения происходит только за счет плавления комплекса, а начальное поглощение зависит от количества комплекса и оставшегося несвязанным избыточного вещества. Таким образом, чем больше концентрации исходных веществ и, следовательно, концентрация избыточного вещества после образования комплекса, тем меньшие значения гиперхромного эффекта мы должны будем наблюдать. Однако, как показали измерения, корреляция между концентрацией и величиной гиперхрома отсутствует. Это позволило сделать вывод о незначительности возможных отклонений от равенства молярных концентраций ПНК и ДНК Затем аликвоты раствора в силиконированных пробирках инкубировались при определенной температуре различное время. После инкубации пробы быстро охлаждались и замораживались при -70С. Для предотвращения реакции реассоциации кинетика диссоциации комплексов бис-ПНК/онДНК исследовалась в условиях избытка так называемой «холодной» ДНК, т.е. немеченого комплементарного ПНК олигонуклеотида, идентичного ДНК-мишени (Kosaganov et al, 2000). «Холодная» ДНК служила ловушкой для ПНК, освобождавшейся в ходе диссоциации комплексов! Концентрация «холодной» ДНК превышала концентрацию ПНК в десятки раз. В случаях, когда опыты проводились без олигонуклеотидной ловушки, это будет отмечено отдельно. После завершения инкубации все образцы анализировались гель-электрофорезом в 5%-ном полиакриламидном геле в ТАЕ-буфере. Затем гель высушивался и авторадиографировался.
Далее, фрагменты, соответствующие разным полосам, вырезались из высушенного геля, и количество радиоактивности подсчитывалось на сцинтилляционном счетчике Mark Ш с последующей нормировкой, т.е. определением доли комплекса и свободной ДНК в каждой пробе. Под долей комплекса понимается отношение количества соответствующей данному комплексу радиоактивности к сумме радиоактивности всех комплексов и свободной ДНК в образце. Во всех случаях, когда диссоциация комплекса шла по экспоненциальному закону, из кривых диссоциации определялось время жизни т, соответствующее уменьшению доли данного комплекса в е раз1. плавления скорость нагрева была достаточно малой и составляла 1С/3,5 мин. Кривые плавления были получены для различных значений концентрации комплекса бис-ПНК 1743/ss,HHK в указанном выше диапазоне при трех значениях ионной силы 50, 200 и 600 mM Na+. Если определить а как долю расплавившихся триплексов, то экспериментальную зависимость поглощения от температуры можно преобразовать в кривую а(Т), изображая на графике отношение расстояния между нижней базовой линией и экспериментальной кривой к расстоянию между верхней и нижней базовыми линиями для каждого значения температуры. Подобная кривая приведена на рис. 12а. Температура плавления Тт определяется как температура, при которой а = 0.5, т.е. половина триплексов находится в расплавленном состоянии. Для дальнейшего анализа мы использовали также дифференциальные кривые плавления в координатах -Эа/5(1/Т) vs Т (см. рис. 126). Заметим, что мономеры в свободной молекуле ГШК связаны стэкинговыми взаимодействиями, подобно тому, как это имеет место в случае нуклеиновых кислот. Это приводит к гипохромному эффекту, т.е.
Влияние электростатических взаимодействий на стабильность триплексов инк с однонитевой и двунитевой днк
В предыдущем разделе было подробно описано изучение стабильности триплексов бис-ПНК/ДЬЖ с помощью метода плавления. Следующие разделы данной диссертационной работы посвящены изучению некоторых факторов, влияющих на стабильность триплексов бис-ПНК/ДНК. В качестве меры стабильности мы будем пользоваться таким параметром как время жизни триплекса т. Времена жизни различных триплексов измерялись путем изучения кинетики их диссоциации (см. Материалы и методы), имеющим, как было отмечено выше, ряд преимуществ по сравнению с методом плавления. Важно, что наблюдение за плавлением по поглощению света в ультрафиолетовом диапазоне требует достаточно большого объема образцов и при этом микромолярной концентрации комплекса. Метод измерения времени жизни путем наблюдения за кинетикой диссоциации позволяет работать в диапазоне наномолярных концентраций, а также при температурах, при которых еще заведомо не плавится двунитевая ДНК-мишень, что также является существенным преимуществом этого метода. Схематические изображения триплексов, образованных моно-ПНК Тю и бис-ПНК 1743 на одно- и двунитевой мишени ДНК, приведены на рисунке 15. На рисунке 16 изображена зависимость времени жизни исследуемых триплексов от ионной силы раствора. Измерение времени жизни триплексов, образованных бис-ПНК 1743, проведено при температуре 67,5С. Инкубация образцов и гель-электрофорез в этих опытах проведены инженером Н.П. Квитко и дипломницей МФТИ К.А. Случанко. Данные для моно-ПНК Tt0 получены пересчетом результатов работы (Kosaganov et al, 2000) к той же температуре. Напомним, что последовательность оснований этих двух ПНК одна и та же (Тю), моно-ПНК Т]0 имеет по одному положительному заряду на концах цепи, бис-ПНК 1743 имеет по одному полол-сительному заряду на концах цепи и два заряда в середине одной из ветвей. Результаты, полученные для ПНК Тю (Kosaganov et al, 2000), показывают, что в пределах точности эксперимента времена жизни триплексов, образованных этой ПНК с однонитевой и двунитевой ДНК, одинаковы и сравнительно слабо зависят от ионной силы в исследованном диапазоне концентраций Na+ от 50 до 600 тМ. Иная картина наблюдается нами для триплексов, образованных бис-ПНК 1743 на он ДНК.
При больших значениях ионной силы время жизни таких триплексов совпадает в пределах точности опыта со временем жизни триплексов (моно-ПНК Т]о)2/ДНК. С понижением ионной силы наблюдается стабилизация триплексов бис-ПНК 1743/онДНК: при концентрации Na+ 50 mM время их жизни увеличивается почти на порядок. Еще более сильный эффект стабилизации наблюдается для триплексов бис-ПНК 1743, образованных на днДНК. При том же значении ионной силы 50 mM Na+ время жизни триплексов бис-ПНК/днДНК превышает время жизни триплексов бис-ПНК/онДНК 2 раза. Как показано в (Kosaganov et ей, 2000), влияние ионной силы раствора на время жизни триплексов, образованных моно-ПНК Т,0 на он-и днДНК, имеет энтропийную природу. Поскольку при распаде триплексов бис-ПНК 1743 также происходит связывание противоионов из раствора, ясно, что энтропийный фактор может играть заметную роль и в стабильности триплексов бис-ПНК 1743. В то же время, при невысоких значениях ионной силы, положительные заряды в центре одной из цепей бис-ПНК могут заметно стабилизировать триплекс бис-ПНК/онДНК за счет прямого электростатического взаимодействия с отрицательно заряженным остовом ДНК. Именно так объясняется наблюдаемый при понижении значения ионной силы рост времени жизни триплексов бис-ПНК 1743/онДНК. Об этом свидетельствуют и численные оценки энергии электростатического взаимодействия положительных зарядов бис-ПНК с отрицательными зарядами ДНК. Таким образом, влияние ионной силы на время жизни триплекса приобретает в данном случае существенную энтальпийную составляющую. Стабильность комплексов с двунитевой ДНК еще выше. Это может быть приписано наличию дополнительных электростатических взаимодействий между положительными зарядами в середине одной из ветвей бис-ПНК 1743 и отрицательно заряженной вытесненной нитью ДНК. При концентрации Na+, равной 1000 тМ, заряды полностью экранируются и стабильность всех комплексов одинакова. Следует отметить, что в случае, когда обе нити ПНК в триплексе имеют в средней части дополнительные положительные заряды, стабильность триплексов уменьшается. Такая дестабилизация наблюдалась для триплексов, образованных на онДНК-мишени моно-ПНК 1460, несущей два положительно заряженных остатка лизина в середине цепи (Kosaganov etal, 2000). Этот факт также свидетельствует об электростатической природе стабилизации, т.к. может быть объяснен только взаимным расталкиванием положительных зарядов, находящихся на молекулах ПНК. Итак, введение дополнительных положительных зарядов в основную цепь гомопиримидиновой ПНК не только способствует увеличению растворимости ПНК, но и существенно влияет на стабильность образуемых ПНК триплекс ов. Это влияние может приводить как к электростатической стабилизации, так и к дестабилизации триплексов. Таким образом, введение в ПНК дополнительных зарядов в виде положительно заряженных при нейтральных рН остатков лизина позволяет целенаправленно варьировать стабильность триплексов ПНКУДНК. Для исследования влияния на стабильность триплексов локализации положительных зарядов на молекуле бис-ПНК были использованы бис-ПНК 2196, 2197, 2199, 522 и 554. Как указано в разделе Материалы и методы, эти ПНК имеют одну и ту же последовательность основатши, но отличаются расположением дополнительных положительных зарядов. Помимо положительных зарядов на каждом конце молекулы, в случае бис-ПНК 2196 два положительно заряженных остатка лизина встроены в среднюю часть хугстиновской цепи. Бис-ПНК 2197 имеет два дополнительных заряда в середине уотсон-криковской цепи. Бис-ПНК 2199 содержит дополнительные заряды на конце одной из ветвей. Бис-ПНК 554 имеет 3 дополнительных лизина в линкере (в этой связи данная бис-ПНК отличается от остальных и строением линкера). Бис-ПНК 522 не содержит дополнительных положительных зарядов, помимо одного заряда на каждом конце молекулы. Триплексы, образованные этими пятью бис-ПНК, схематически изображены на рис. 17. образованных с участием описанных бис-ПНК, проводилась при более высокой температуре, а именно при 80С. Времена жизни триплексов одной из пяти бис-ПНК (бис-ПНК 2199) измерены дипломницей МФТИ К.А. Случанко. Приведенные на рис. 18 кривые зависимости времени жизни от ионной силы схожи для всех пяти бис-ПНК. Во всех сериях опытов наблюдается увеличение стабильности триплексов при понижении ионной силы. Характерное время жизни триплексов увеличивается от нескольких минут при концентрации Na+ = 1000 mM до нескольких сотен минут при ионной силе 50 тМ, т.е. величина эффекта составляет два порядка.
Поэтому на рис. 18 зависимости изображены в логарифмическом масштабе. Видно, что основной эффект стабилизации наблюдается при понижении ионной силы от 1000 до 200 тМ; дальнейшее увеличение времени жизни происходит значительно медленнее. Полученные данные не позволяют сделать выводов о влиянии на стабильность триплексов локализации зарядов на уотсон-криковской или хугстиновской цепи ПИК, либо на конце молекулы. Более того, ход зависимости времени жизни от ионной силы в пределах точности измерений практически одинаков для четырех бис-ПНК 2196,, 2197, 2199 и 522, последняя из которых вообще не содержит дополнительных положительных зарядов кроме двух концевых. Этот факт может указывать на незначительную роль прямого электростатического притяжения в стабилизации триплексов, образованных этими бис-ПНК. Наибольшей стабильностью при всех ионных силах обладают триплексы, образованные бис-ПНК 554 с локализацией зарядов в линкере. Не смотря на существенный разброс данных, этот факт хорошо виден на рисунке 19. При невысоких ионных силах время жизни триплексов, образованных бис-ПНК 554, существенно превышает времена жизни триплексов, образованных другими исследованными бис-ПНК. Поскольку данные для этих бис-ПНК в пределах разброса совпадают, на рисунке 19 они представлены в виде заштрихованной области.
