Введение к работе
Актуальность работы. Создание производных нуклеиновых кислот (НК), обладающих улучшенными функциональными характеристиками, имеет как фундаментальное, так и практическое значение. Фундаментальный интерес, в первую очередь, связан с желанием расширить представления о физической природе взаимодействий, способствующих формированию двойной спирали ДНК. Практическая значимость обусловлена широким спектром применения олигонуклеотидов (ОН) и их производных. Возможность направленного изменения комплексообразующих свойств путем введения в регулярную структуру биополимера модификаций позволяет повысить эффективность и расширить сферу их использования. Олигодезоксирибонуклеотиды, состоящие из двух или более фрагментов, которые соединены гибкими ненуклеотидными линкерами, - мостиковые олигонуклеотиды (МО), являются перспективными агентами, позволяющими создавать на их основе зонды, с направлено пониженными гибриди-зационными свойствами при сохранении сиквенс-специфичности взаимодействия с НК.
Цель работы. Построение модели расчета стабильности ДНК/ДНК комплексов мостиковых олигонуклеотидов (величин энтальпии (АН), энтропии (AS), свободной энергии Гиббса (AG37) комплексообразования и температуры плавления (Тш) дуплексов) в стандартных условиях (1М NaCl, рН ~ 7) и расширение прогностической способности данной модели на случай использования буферных растворов с различной концентрацией противоионов, в том числе при конкурентном связывании нескольких типов катионов с ДНК.
Научная новизна работы. Проведено систематическое исследование комплексообразующих свойств мостиковых олигодезоксирибонуклеоти-дов, содержащих ненуклеотидные вставки на основе 3-гидрокси-2(гидроксиметил)-тетрагидрофуран-3-фосфата (TF), олигоэтиленглико-лей: бис-, тетракис-, гексакис-(этиленгликоль) фосфатов (DEG, TEG, HEG); или олигометилендиолов: 5-гидрокси-пентил-1- и 10-гидроксидецил-1-фосфатов (PD и DD) и их регулярных повторов. Исследование характеристик равновесного образования дуплексных структур проводили методом термической денатурации с оптической регистрацией сигнала. Кинетические константы комплексообразования определяли, используя метод остановленной струи. Полученные данные позволили впервые построить модели прогностического расчета стабильности комплексов МО с комплементарными последовательностями ДНК. Модели основаны на приближении «ближайших соседей» (БС), которое с высокой точностью позволяет рассчитывать термодинамические параметры комплексообразования МО, несущих ненуклеотидные вставки на основе ди-
этиленгликоля, в стандартных условиях. Разработана модель, используя которую можно определять величину дестабилизирующего вклада ненук-леотидной вставки в энергию комплексообразования МО в зависимости от числа ковалентных связей, формирующих остов вставки.
Впервые создана неэмпирическая модель, учитывающая нелинейность зависимости обратной температуры плавления комплексов олиго-нуклеотидов от логарифма концентрации катионов в растворе. С ее помощью можно с высокой точностью рассчитывать стабильность комплексов нативных и мостиковых олигонуклеотидов при различных концентрациях противоионов в растворе, в том числе в случае конкурентного взаимодействия одновалентных катионов и ионов магния с ДНК.
Предложены новые способы учета вкладов внутримолекулярных комплексов ОН при определении термодинамических и кинетических характеристик формирования межмолекулярных НК-дуплексов, что позволяет определять «истинные» параметры перехода спираль-клубок в ДНК.
Практическая значимость. Предложенные подходы позволяют про
водить расчет величин термодинамических характеристик (АН, AS",
AG37 и Тдл) формирования дуплексных структур ДНК. С их использова
нием оказывается возможным проводить направленный выбор структуры
олигонуклеотидов, например, при создании систем анализа генетического
материала, основанных на методе молекулярной гибридизации. Кроме
того, используя разработанные модели, можно проводить оценку вкладов
отдельных типов взаимодействий (электростатиче-
ских/неэлектростатических) в энергию формирования ДНК/ДНК комплексов.
Основные положения, выносимые на защиту.
Модели расчета термодинамических параметров формирования комплексов МО в стандартных условиях (1 М NaCl, нейтральные значения рН).
Модель пересчета стабильности комплексов нативных и мостиковых олигонуклеотидов из стандартных условий в условия с другими концентрациями одновалентных катионов и ионов магния.
Подходы для учета вклада вторичных структур олигонуклеотидов при определении термодинамических параметров и кинетических характеристик образования дуплексных структур НК.
Личный вклад автора. Все результаты, приведенные в диссертации, получены либо самим автором, либо с его непосредственным участием. Автор участвовал в постановке задач, решаемых в рамках диссертационной работы, в написании и подготовке публикации статей и тезисов кон-
ференций, самостоятельно проводил основные эксперименты и обрабатывал результаты, интерпретировал полученные данные.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 14 конференциях, в том числе: International Conference «Targeting RNA: Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA-interference», 18-21 Июня 2003г., Новосибирск, Россия; «Десятая Всероссийская Научная Конференция Студентов-Физиков и Молодых Ученых», 1-7 апреля 2004 г., Москва, Россия; «1st International Conference on Chemical Biology», 2-7 Июля 2005г., Новосибирск, Россия; «Международная конференция «Физико-химическая биология»» 30 июля-3 августа 2006г., Новосибирск Россия; «Albany 2007: The 15th Conversation», 19-23 Июня 2007г., Олбани, США.
Публикации. Основной материал диссертации опубликован в 5 статьях в рецензируемых научных журналах и в 2 статьях в сборниках трудов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, списка литературы и 7 приложений. Объем диссертации составляет 175 страниц, включая 45 рисунков и 38 таблиц. Библиография содержит 167 наименований.
