Введение к работе
Актуальность темы
Комплексы ДНК с золотыми наночастицами (ЗНЧ) получают химической конъюгацией через тиольные производные или физической адсорбцией. Такие комплексы нашли применение как средство внутриклеточной доставки генетических векторов и зондов, для усовершенствования технологии ПНР-анализа, для развития методов генной диагностики (обнаружения ДНК-мишеней) на уровне продуктов ПНР-анализа, в биосенсорике с использованием аптамеров и флуоресцентных меток, а также в исследовании трехмерных кристаллических структур на основе блоков ЗНЧ-ДНК (Mirkin et al., 1996). Применение золотых наночастиц в биомедицинских приложениях обусловлено их уникальными химическими и физическими свойствами. В водных растворах цитрат-стабилизированные частицы коллоидного золота (КЗ) имеют отрицательный поверхностный заряд, что способствует физической адсорбции макромолекул за счет электростатических взаимодействий. Максимум поглощения на длине волны плазмонного резонанса около 520 нм определяет ярко-красный цвет золей КЗ. Длины волн максимумов поглощения и рассеяния индивидуальных частиц можно настраивать за счет изменения размера, формы и структуры частиц.
Образование комплексов ДНК-ЗНЧ часто сопровождается агрегацией частиц, что приводит к изменениям цвета раствора и значительным изменениям в спектрах экстинкции и рассеяния за счет оптического взаимодействия частиц в кластерах. Эти изменения могут быть зафиксированы визуально или методами спектроскопии (колориметрии). Фактически, эта простая физическая картина лежит в основе всех вариантов колориметрического метода изучения комплексов ЗНЧ-ДНК. Наряду с колориметрией, образование агрегатов ЗНЧ можно исследовать методом динамического рассеяния света (ДРС), основанного на измерении флуктуации рассеянного света, обусловленных броуновским движением рассеивателей.
Большинство работ по использованию комплексов ЗНЧ-ДНК в биомедицинских исследованиях носят фундаментальный характер, и лишь немногие нашли применение в лабораторной или клинической практике. В литературе описаны следующие варианты колориметрического детектирования ДНК: использование частиц КЗ, функционализованных через тиольные производные одноцепочечных ДНК (оцДНК) (Mirkin et al, 1996, Sato et al., 2005, Baptista et al, 2006), и использование немодифицированных ЗНЧ (Li, Rothberg, 2004, Xia et al, 2010, He et al., 2008). Использование функционализации ЗНЧ посредством тиольных производных оцДНК было предложено в работе (Mirkin et al., 1996) и реализовано в виде трехмерных самособирающихся ЗНЧ для чувствительной детекции ДНК-мишеней. Дальнейшее развитие этого подхода проходило с использованием систем с конъюгатами частиц КЗ одного типа, функционализованных через тиольные производные на 3' или 5' концах зондовых оцДНК в работах (Sato et al, 2005, Baptista et al., 2006, Song et al, 2010). Использование немодифицированных частиц КЗ основано на исследовании авторов работы (Li, Rothberg, 2004), показавших, что при высокой ионной силе, оцДНК защищает немодифицированные частицы КЗ от агрегации в отличие от двухцепочечной ДНК (дцДНК). Совсем недавно, авторы работы (Xia et al, 2010) описали новый вариант этой стратегии, с использованием оцДНК зонда, немодифицированных частиц КЗ и положительно заряженного полиэлектролита для детектирования молекул ДНК, белков, низкомолекулярных веществ и неорганических ионов.
В описанных выше методах детекции ДНК-мишеней использовались цитрат-стабилизированные отрицательно заряженные частицы КЗ. В работе (Не et al., 2008) описана новая версия использования немодифицированных частиц путем применения положительно заряженных золотых наностержней (ЗНС). Специфичность реакции подтверждалась отсутствием спектральных изменений при добавлении некомплементарных ДНК и зависимостью степени агрегации от точечных мутаций. Согласно литературным данным, имеется большой разброс в оценках предела обнаружения ДНК от 0.1 нМ до 0.1 пМ.
Наряду с изменениями цвета (спектров поглощения и рассеяния света), агрегация ЗНЧ может быть зарегистрирована по изменению интенсивности свечения флуоресцентных меток, связанных с ДНК-зондом или находящихся в растворе (Zhang et al., 2011).
Хотя опубликованные работы показали определенные преимущества подхода с использованием немодифицированных ЗНЧ, несколько важных вопросов оставались нерешенными до начала исследований, описанных в данной работе. В частности, не было исследовано влияние формы наностержней на результаты колориметрии, и не был дан ответ на естественный вопрос: нельзя ли заменить положительно заряженные стержни более простыми (по синтезу) положительно заряженными сферическими золотыми наночастицами? Подобные частицы можно получить, например, из обычных цитратных частиц КЗ функционализацией молекулами цетилтриметиламмония бромида (ЦТАБ).
Таким образом, к моменту начала исследований, описанных в данной диссертации, имелся ряд нерешенных вопросов, связанных с проблемой использования ЗНЧ для детектирования молекул нуклеиновых кислот без модификации поверхности наночастиц и в минимальный промежуток времени. Этим определяется актуальность и научная значимость темы диссертации. Круг решаемых в данной работе задач включает разработку генодиагностических систем, основанных на изменении оптических свойств водных дисперсий комплексов ДНК-ЗНЧ, индуцированных реакцией гибридизации.
Исходя из вышесказанного, целью диссертационной работы было исследование взаимодействия ДНК с золотыми наночастицами в растворах методами спектроскопии и динамического рассеяния света на примере модельных систем олигонуклеотидов и положительно заряженных наночастиц коллоидного золота и золотых наностержней.
Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи исследования:
исследовать влияние размера, формы и поверхностного заряда золотых наночастиц на воспроизводимость колориметрического теста;
разработать метод детектирования олигонуклеотидов с использованием комплексов положительно заряженных золотых наночастиц и ДНК, а также методов спектроскопии поглощения и динамического рассеяния света;
получить калибровочные кривые для определения олигонуклеотидов методами
спектроскопии поглощения и динамического рассеяния света и оценить возможность
детектирования точечных мутаций методом динамического рассеяния света;
определить значения «золотых чисел» для препаратов РНК, выделенных из зрелых зерен ячменя, и оценить их корреляцию с морозостойкостью сортов;
сравнить чувствительность флуоресцентного метода определения ДНК-мишеней с колориметрическим тестом. Выяснить механизмы изменения интенсивности флуоресценции в системах ДНК+ЗНЧ+флуоресцентная метка.
Научная новизна полученных результатов заключается в следующем:
впервые показано, что морфология золотых наностержней является критическим фактором для колориметрической детекции ДНК и что агрегация наностержней сопровождается изменениями спектров рассеяния, не описанными в литературе;
разработан новый метод детектирования олигонуклеотидов, защищенный патентом РФ, основанный на использовании положительно заряженных ЦТАБ-покрытых наночастиц золота;
показано, что концентрационные пределы детектирования ДНК с использованием спектроскопии поглощения и динамического рассеяния света составляют 100 и 10 пМ, соответственно.
Научно-практическая значимость работы определяется тем, что в ней получены новые экспериментальные данные о свойствах комплексов ДНК+ЗНЧ, которые могут быть использованы для разработки простых диагностических тест-систем колориметрического типа, в том числе и для анализа ПНР-продуктов. Полученные в работе наностержни улучшенной сигарообразной формы используются в ИБФРМ РАН, Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского, Институте проблем лазерных и информационных технологий РАН, Отделении перспективных лазерных технологий (ИПЛИТ РАН, г. Троицк). Получен патент РФ на способ колориметрического детектирования олигонуклеотидов с использованием катионных золотых наносфер.
Достоверность научных результатов подтверждается воспроизводимостью экспериментальных данных и их соответствием теоретическим расчетам, а также качественным и количественным согласием с результатами независимых исследований других авторов.
На защиту выносятся следующие основные положения и результаты:
в отличие от золотых наностержней с морфологией «dog-bone», наностержни улучшенной сигарообразной формы имеют низкую коллоидную стабильность в гибридизационных условиях и не пригодны для реализации колориметрического метода детектирования ДНК;
функционализованные молекулами ІДТАБ положительно заряженные наночастицы золота с диаметрами 15-25 нм показывают лучшую воспроизводимость колориметрического и ДРС тестов определения ДНК-мишеней по сравнению с золотыми наностержнями. Функционализация полиэтиленимином и полидиаллилдиметиламмоний хлоридом не дает положительных результатов;
метод динамического рассеяния имеет большую чувствительность в определении ДНК-
мишеней по сравнению со спектроскопией поглощения. Соответствующие минимальные
концентрационные пределы детектирования равны 10 пМ и 100 пМ при объеме пробы
порядка 100 мкл. ДРС-тест с положительно заряженными частицами золота позволяет
дифференцировать наличие одно- и трехбуквенных несоответствий в исследованных
модельных молекулах ДНК-мишеней;
тушение флуоресценции при ДНК-инициированной агрегации наночастиц золота
обусловлено действием двух факторов: собственно тушением молекул флуорофора на
частицах золота и эффектом внутреннего фильтра.
Личный вклад диссертанта и результаты, полученные совместно с другими исследователями:
Экспериментальные результаты получены лично автором в сотрудничестве с д.б.н. В.А. Богатыревым, д.б.н. Л.А. Дыкманом, д.ф.-м.н. Б.Н. Хлебцовым, д.б.н. В.К. Плотниковым, к.ф.-м.н. В.А. Ханадеевым. Общее планирование экспериментов, их
обсуждение и подготовка результатов к публикации проводились совместно с д.ф.-м.н., проф. Н.Г. Хлебцовым и д.б.н. В.А. Богатыревым. На защиту вынесены только те положения и результаты, в получении которых роль автора была определяющей.
Работа выполнена в лаборатории нанобиотехнологии ИБФРМ РАН по планам НИР в рамках бюджетной темы: «Нанобиотехнология частиц с настраиваемым плазмонным резонансом: синтез, функционализация, оптические свойства, применения в биологии и медицине», № гос. регистрации 01200904392 (рук. д.ф.-м.н. профессор Хлебцов Н.Г.).
Государственные контракты и гранты: данная работа была частично поддержана грантами РФФИ (07-04-00301а, 07-04-00302а, 08-02-0399а, 09-02-00496а, 11-02-00128а); программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки -медицине»; Правительства Российской Федерации для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования (научн. рук. член.-корр. РАН Никитов С.А., научн. рук. направления от ИБФРМ РАН д.ф.-м.н. профессор Хлебцов Н.Г.); госконтрактом № 02.513.11.3043 в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», контрактом № 24.439.11.0/ИБФРМ в рамках ФЦП «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 гг.)» (рук. д.б.н. Дыкман Л.А.).
Апробация результатов:
Основные результаты диссертации представлялись автором на следующих научных конференциях:
Saratov Fall Meeting - International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser
Physics & Biophysics, Saratov (Саратов, 2007-2011 два устных доклада и один стендовый доклад).
Отчетная конференция по итогам завершенных тем НИР ИБФРМ РАН. (Саратов, 12-14
мая 2009, устный доклад).
Всероссийская молодежная выставка-конкурс прикладных исследований, изобретений и
инноваций. (Саратов, 27-28 октября 2009, стендовый доклад).
2-ой Международный форум по нанотехнологиям, (Москва, 6-8 окт. 2009, стендовый
доклад).
Всероссийский Форум «Селигер 2010» (Тверская область, 10-19 июля 2010, инновационный проект).
V Всероссийская конференция молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 28 сент. - 1 окт. 2010, устный доклад).
Конкурс молодежных инновационных проектов на получение национальной премии в
области инноваций - Зворыкинская премия (Саратов, 13 окт. 2010, устный доклад).
Открытый урок по нанотехнологиям в биологии в Гимназии №87 (Саратов, 10 дек. 2010,
устный доклад).
Workshop of Local Cluster Saratov (Рабочее совещание в рамках Европейского проекта
Photonics4Life FP-7, Саратов, 11 марта 2011, стендовый доклад).
Семинар с представлением устного доклада Bio-Medical Micro/Nano Fluidic Device Lab
(Gwangju Institute of Science and Technology, Gwangju, Republic of Korea, 22 ноября 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ, в том числе три статьи в рецензируемых журналах и патент РФ.
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, основной части, содержащей 4 главы, заключения и списка использованных литературных источников (129 наименований). Работа изложена на 121 странице, иллюстрирована 33 рисунками и включает 5 таблиц.
