Введение к работе
Актуальность
Кислородный статус злокачественных новообразований является одним из ключевых факторов, определяющих прогноз заболевания и эффективность лечебных воздействий (Vaupel et al., 2005, 2008). Гипоксию опухоли (снижение парциального давления кислорода менее 10 мм.рт.ст.) необходимо рассматривать как следствие дисбаланса между высокой потребностью опухолевой ткани в кислороде и недостаточной его доставкой аномально сформированным сосудистым руслом опухоли (Brown, Giaccia, 1998). Гипоксия является независимым источником формирования агрессивного опухолевого фенотипа благодаря своему влиянию на различные метаболические, молекулярно-генетические, патофизиологические процессы, в том числе пролиферацию, апоптоз, неоангиогенез и метастазирование (Horsman, Overgaard, 2002). Кроме того, гипоксия является источником устойчивости новообразований к различным терапевтическим агентам (Hockel, Vaupel, 2001).
Возрастающее понимание роли гипоксии в клинической и экспериментальной онкологии дало толчок исследованиям, посвященным созданию новых методов диагностики и возможностям коррекции данного патофизиологического состояния. На сегодняшний день существует две группы методов определения уровня насыщения крови кислородом - ex vivo (гистоморфометрия, криоспектрофотометрия, иммуногистохимическое исследование) и in vivo (прямое полярографическое измерение парциального давления кислорода, позитронно-эмиссионная томография, магнитно-резонансная томография). В течение последних двадцати лет достаточно широкое распространение в эксперименте и клинике получили оптические методы диагностики гипоксии, в частности, метод оптической диффузионной спектроскопии (ОДС) (Тучин, 2001, Rogatkin, Lapaeva, 2003, Tromberg et al. 2005, Vishwanath et al., 2009, Roblyera et al., 2011).
Метод ОДС заключается в расчете оптических характеристик биологических тканей (показателей рассеяния и поглощения) путем использования информации о многократно рассеянном свете, прошедшем сквозь объект (Тучин, 1998, Boas et al., 2001, Taroni et al, 2004, Intes, Chance, 2005). Спектроскопические данные позволяют оценить концентрацию основных тканевых хромофоров, характеризующих кислородный статус (оксигемоглобин, дезоксигемоглобин). На основе полученной информации рассчитывается уровень насыщения крови кислородом. Метод ОДС может быть реализован в конфигурации "на отражение" (ближняя инфракрасная спектроскопия) и в конфигурации "на просвет". Второй вариант позволяет получать информацию о кислородном статусе глубоко расположенных тканей (максимальная глубина зондирования составляет 10 см) (Durduran et al., 2010). Метод позволяет оценить соотношение основных компонентов, характеризующих баланс доставки кислорода к тканям (оксигемоглобин) и его потребления (дезоксигемоглобин), а также кровенаполнение тканей (общий гемоглобин) (De Blasi et al., 1993; Lu et al., 2004).
Неинвазивное определение кислородного статуса экспериментальных опухолей необходимо для решения задач мониторинга и прогнозирования эффективности противоопухолевых воздействий (облучение, химиотерапия, фотодинамическая терапия), а также для разработки новых методов диагностики и лечения злокачественных новообразований (Brown, 1999, Eriksen et al, 2006, Wouters et al, 2007, Choe et al., 2005; Zhu et al, 2013). Однако, до настоящего времени не имеется прямых доказательств, что уровень насыщения крови кислородом (StO2), рассчитанный при исследовании методом ОДС, корректно отражает уровень парциального давления кислорода в соответствующих биологических тканях. Не разработана методика исследования кислородного статуса экспериментальных опухолей в конфигурации "на просвет". Данные о динамике кислородного статуса опухолей в процессе естественного роста и при различных противоопухолевых воздействиях являются неполными и в достаточной мере противоречивыми.
Цели и задачи
Целью работы было изучение динамики кислородного статуса экспериментальных опухолей методом оптической диффузионной спектроскопии в процессе естественного роста и на фоне проведения терапевтических воздействий. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. Исследовать возможности метода оптической диффузионной спектроскопии для оценки уровня оксигенации ткани в модельном эксперименте и на экспериментальных опухолях in vivo. Верифицировать результаты, полученные с использованием ОДС, с помощью стандартных методов определения кислородного статуса.
2. Провести исследование изменений уровня оксигенации экспериментальной опухоли методом ОДС в процессе ее естественного роста и оценить возможные механизмы выявленных изменений.
3. С помощью метода оптической диффузионной спектроскопии изучить изменения кислородного статуса экспериментальной опухоли в ответ на противоопухолевые воздействия (ионизирующее излучение, цитостатическое воздействие).
4. С помощью метода ОДС изучить динамику кислородного статуса экспериментальной опухоли под воздействием кислород-модифицирующего агента.
5. Разработать методику использования оптической диффузионной спектроскопии в конфигурации "на просвет" для задач определения кислородного статуса экспериментальных опухолевых моделей.
Основные положения, выносимые на защиту
1) Метод оптической диффузионной спектроскопии позволяет корректно определить уровень оксигенации биологических тканей и выявить тканевые механизмы возникающих изменений.
2) Основные механизмы снижения оксигенации в процессе естественного роста опухоли связаны как с увеличением потребления кислорода тканями, так и со снижением поставки кислорода кровью при неизменном уровне кровенаполнения. В основе изменений уровня оксигенации опухоли под воздействием цитостатических препаратов лежит снижение потребления кислорода опухолевыми клетками, находящимися в состоянии дистрофии, что подтверждается стабилизацией уровня потребления кислорода тканью опухоли.
3) Важную роль в развитии изменений кислородного статуса опухоли в течение первых 24 часов после воздействия ионизирующего излучения играют нарушения перфузии, которые могут вызывать снижение оксигенации ткани новообразования. В более поздние сроки основное влияние на уровень оксигенации оказывает снижение потребления кислорода в результате уменьшения количества жизнеспособных опухолевых клеток.
4) В основе улучшения оксигенации новообразования в ответ на введение вазодилатирующего агента лежит повышение кровенаполнения опухоли и увеличение доставки кислорода тканям.
Научная новизна
Впервые метод ОДС в конфигурации "на просвет" адаптирован и реализован в эксперименте на животных. Разработана новая методика использования оптической диффузионной спектроскопии для задач определения кислородного статуса тканей экспериментальных опухолей.
Впервые результаты определения уровня оксигенации тканей методом оптической диффузионной спектроскопии верифицированы на двух опухолевых моделях с использованием иммуногистохимического исследования с экзогенным маркером гипоксии.
Впервые методом ОДС в конфигурации «на просвет» показана динамика изменений уровня оксигенации экспериментальной опухоли в процессе естественного роста и выявлены механизмы указанных изменений.
Впервые методом ОДС проведено in vivo исследование динамики оксигенации экспериментальной опухоли на фоне цитостатического воздействия и показано, что в основе изменений уровня оксигенации после проведения химиотерапии лежит уменьшение потребности ткани опухоли в кислороде.
Проанализирован баланс поступления и потребления кислорода тканями опухоли при воздействии на нее ионизирующего излучения в зависимости от срока после воздействия и показана роль реакции сосудистого русла в развитии радиационно-индуцированных изменений уровня оксигенации.
Продемонстрирована роль повышения кровенаполнения опухоли и увеличения доставки кислорода в механизме улучшения оксигенации новообразования на фоне воздействия препарата, оказывающего влияние на микроциркуляторную перфузию (пентоксифиллин).
Научно-практическая значимость
В работе представлена методика неивазивного определения уровня оксигенации экспериментальных опухолей методом оптической диффузионной спектроскопии. Продемонстрирована возможность ее использования для проведения мониторинговых исследований in vivo на экспериментальных опухолевых моделях для изучения динамики оксигенации новообразований в ходе их естественного роста. Показано, что метод ОДС может дать информацию не только об оксигенации тканей, но и о механизмах развития ее изменений по данным о поставке (оксигемоглобин) и потреблении (дезоксигемоглобин) тканями кислорода. Были выявлены разнонаправленные изменения оксигенации экспериментальной опухоли при различных противоопухолевых воздействиях и рассмотрены механизмы развития этих изменений. В этой связи результаты диссертационной работы могут найти применение в научных исследованиях, посвященных проблеме развития опухолевой гипоксии и разработке методов ее коррекции. Возможно использование разработанной методики в онкологической клинике с целью неинвазивного мониторинга кислородного статуса определенных локализаций злокачественных опухолей и прогнозирования их ответа на лечение. Основные выводы и результаты работы могут быть использованы в учебном процессе при разработке курсов биофизики, радиобиологии, экспериментальной онкологии, лазерной оптики.
Апробация работы
Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на 13-м симпозиуме студентов-биологов Европы «SymBioSE 2009» «Biology: Expansion of Borders» 2009 (Казань, 2009, диплом за инновационный проект), VII Всероссийской межвузовской конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 2010, диплом за лучший устный доклад), Международной весенней школе "Биофизика и биоэлектрохимия для медицины" (Румыния, 2009), 13-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2009), Международной осенней школе "Биофизика и биоэлектрохимия для медицины: основные концепции, новые методы и перспективы применения" (Румыния, 2010), Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2011» (Москва, 2011), III Международном симпозиуме "Topical Problems of Biophotonics" (Санкт-Петербург - Нижний Новгород, 2011, 2013), V Троицкой конференции "Медицинская физика и инновации в медицине" (Троицк, 2012, диплом 1 степени), 31-й конференции Европейского общества радиологии и терапевтической онкологии (ESTRO 31, Барселона, 2012), международной летней школе для аспирантов ("Biophotonics'13, о. Вен, Швеция, 2013")
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 29 работ, в том числе в журналах, входящих в российские и международные системы цитирования - 6 работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из Перечня использованных сокращений, Введения, трех глав (Обзор литературы, Материалов и методов исследования и Результатов и их обсуждения), Заключения, Выводов, Списка литературы (187 источников). Иллюстрационный материал включает 30 рисунков.
