Введение к работе
Актуальность темы. Современная биофизика представляет собой бурно развивающуюся междисциплинарную область знаний, определяемую быстрым развитием новых методов исследований структур и их взаимодействий, проявляющихся в биологических процессах. Прежде всего, это связано с возникновением в биофизике и молекулярной биологии нового направления -протеомики, изучающей взаимосвязь биологической активности белков и их структуры на молекулярном уровне. Это чрезвычайно важно как для фундаментальной науки, так и для биотехнологии. Другое важное и интенсивно развиваемое направление биофизики связано с исследованием нового класса низкоразмерных структур - полупроводниковых квантовых точек (ПКТ), фуикциопализировапных биоспецифическими лигандамн (в частности, пептидами), обладающими строгим сродством к клеточным структурам. Всё возрастающий интерес к такому классу материалов связан с уникальными флуоресцентными свойствами ПКТ в сравнении с традиционными органическими флуорофорами, что позволяет создавать эффективные биомаркеры и биосенсоры, средства адресной доставки лекарственных препаратов к клеткам-мишеням и онкологические диагностикумы. Развитие таких новых нанобиотехнологий немыслимо без фундаментальных структурных исследований и детального понимания физических процессов, протекающих как в отдельности в исходных системах - белковых молекулах и ПКТ, так и в целостной функционализированной структуре.
Структурные свойства белков на молекулярном уровне исследуются практически всеми самыми современными физическими методами такими как, рассеяние рентгеновских лучей, нейтронов, синхротронного излучения, электронная микроскопия, ЯМР-, оптическая- и ИК-спектроскопии и др. При этом требуются дорогостоящее оборудование и высококачественные кристаллы белков, имеющие большие линейные размеры. Для их получения необходимо использовать достаточно трудоемкие методы. Одним из наиболее важных и перспективных методов изучения вторичной структуры белков и закономерностей их конформационного поведения является лазерная спектроскопия неупругого (рамановского) рассеяния света (НРС) на колебаниях отдельных молекул. Исследование колебательных мод, зависящих от массы атомов и сил межатомного взаимодействия биомолекул, позволяет получить ценную информацию о механизмах химического, внутримолекулярного и межмолекулярного взаимодействия, о вторичной, а также третичной структуре белков. Это в первую очередь, связано с зависимостью спектральных параметров различных характеристических линий от конформации и локального окружения макромолекул, от механизмов межмолекулярных взаимодействий. Метод быстро развивается вместе с прогрессом лазерных, оптоэлектронных и компьютерных технологий. В настоящее время он становится все более привлекательным для выполнения разнообразных структурных исследований на молекулярном уровне. Дальнейшее совершенствование спектроскопии НРС в биомолекулах может играть важную роль в создании высокочувствительных аналитических методов, необходимых для развития перспективных направлений молекулярной диагностики. Высокая значимость и недостаточная разработанность указанных проблем протеомики определяет актуальность выбранной темы исследований.
Основная цель работы:
1. Получить и исследовать спектры неупругого рассеяния света микрокристаллов модельных белков лизоцима и RecAEc в низкочастотном диапазоне
внутрирещеточных колебаний молекул в элементарной ячейке и высокочастотном диапазоне молекулярных колебаний различных атомов, образующих химические связи. Установить спектральные параметры, позволяющие определять степень структурной упорядоченности белков и дающие информацию о механизмах внутри- и межмолекулярных взаимодействий.
-
Методами спектроскопии НРС, люминесценции и оптического поглощения с использованием разработанных подходов исследовать суспензии ПКТ, сопряженные с короткими пептидами.
-
Исследовать специфичность взаимодействия с раковыми клетками ПКТ, функционализированных пептидами, имеющими сродство к интегринам раковых клеток.
Научная новизна работы:
-
Впервые получены и сопоставлены с данным по лизоциму спектры неупругого рассеяния света микрокристаллов белка RecAEc. При этом кристаллизация RecAEc также осуществлена впервые модифицированным методом «висящей капли». В спектрах RecAEc выделены узкие линии и полосы, позволяющие определить с высокой точностью относительное содержание аминокислот в белке в а-, /?- и у-конформациях и удостоверить высокую степень совершенства выращенных микрокристаллов.
-
Впервые с применением спектральных методов (в том числе спектроскопии неупругого рассеяния света) и разработанных подходов исследованы ПКТ CdS, функционализированные пептидами с различной степенью сродства к интегринам раковых клеток MDA-MB-435. Выявлены особенности электронных, оптических и колебательных свойств таких наноструктур. Показано, что взаимодействие таких ПКТ с раковыми клетками строго дискриминируется по наличию или отсутствию флуоресценции, отвечающей экситонному переходу между основными уровнями размерного квантования lS3/2(h) - lS(e).
Апробация работы. Обоснованность и достоверность результатов работы подтверждается их обсуждением на отечественных и международных конференциях и публикациями в ведущих реферируемых журналах. Результаты докладывались на следующих конференциях: 11-ой Международной конференции по рассеянию фононов в конденсированных средах, С-Петербург, 2004; 14-ом Международном симпозиуме «Наноструктуры: физика и технология», 2005, С-Петербург; Конференции Европейского общества по материаловедению - «Современные направления в нанонауках - от материалов к применениям», секция «Нанобиотехнологии», Ницца, Франция, 2006; 10-ом Международном венчурном семинаре «Российские технологии для промышленности» 2006, С-Петербург; 3-ей Международной конференции науки о материалах, 2006, Кишинёв; Конференции -«Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня» Бреслеровские чтения II, 2007, С-Петербург; Международной конференции по функционализированным материалам и нанотехнологиям, 2007, Рига; Европейском симпозиуме международного общества оптических технологий (SPIE) по микроэлектронике для нового тысячелетия, 2007, Масполамос, Испания; Международной конференции «Химия и применения наноструктур», 2007, Минск; 8-ой Российской конференции по физике полупроводников, «Полупроводники-2007», Екатеринбург; 14-ой Международной конференции по биоинженерии и медицинской физике, 2008, Рига; Европейской конференции по нанотехнологиям стран Северной Европы, 2008, Копенгаген, Дания; Международной конференции «Комбинационное рассеяние - 80
лет исследований, 2008, Москва и Международном форуме по нанотехнологиям «Rusnanotech 08», Москва, 2008.
Основные научные положення, выносимые на защиту:
1. В полученных впервые спектрах НРС микрокристаллов белка RecAEc
спектральные параметры линий Phe при 1004 см"', Тгр при 1554 см"' и при 1664,6 см"'
(линия Амида I) позволяют определить структурные характеристики белка и степень
совершенства таких микрокристаллов.
2. Измерения спектров оптического поглощения и люминесценции ПКТ
позволяют отбирать структуры, обладающие малой полушириной линии
люминесценции и высокой относительной эффективностью излучения, а
комплексные исследования оптическими методами оптимизированных комплексов
таких ПКТ, фунциаиализированиых короткими пептидами позволяют установить
особенности электронных, оптических и колебательных свойств таких наноструктур.
3. Функционализация ПКТ пептидом, последовательность 4-х концевых
аминокислот которого имеет сродство к мембранным интегринам раковых клеток,
обеспечивает селективное связывание таких
ПКТ с раковыми клетками, обнаруживаемое по флуоресценции, отвечающей экситонному переходу между основными уровнями размерного квантования lS3/2(h) - Ще).
Достоверность и надежность результатов обеспечивается тщательной комплексной проработкой технического обеспечения экспериментов с разработкой прецизионных методик получения микрокристаллических образцов модельных белков лизоцима и RecAEc и проведением высокоточных измерений, а также выполнением тестовых измерений с проверкой воспроизводимости результатов. Помимо этого, такая цель достигалась сопоставлением с результатами, полученными при одинаковых экспериментальных условиях на исходных образцах, начиная с буферного раствора, а также на модельных образцах белка лизоцима. С этой же целью для всех 20 стандартных аминокислот создан собственный банк спектральных данных и основные научные положения экспериментально и теоретически обоснованы.
Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 21 работе в отечественных и зарубежных изданиях.
Личный вклад автора: Научные результаты исследований, содержащиеся в диссертации, получены автором на равных правах с соавторами и при его непосредственном участии на всех этапах работы. Он принимал участие в постановке задач, в работах по усовершенствованию методики получения микрокристаллов лизоцима и белка RecAEc, в измерениях спектров НРС в таких микрокристаллах и полупроводниковых наноструктурах, функционализированных различными пептидами, в измерениях спектров люминесценции, в обработке, анализе полученных данных и интерпретации результатов. Доля участия автора в опубликованных по теме диссертации работах составляет от 30% до 80%.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав («Литературный обзор», «Экспериментальные подходы и подготовка объектов исследования», «Лазерная спектроскопия неупругого рассеяния света микрокристаллов лизоцима и белка RecAEc», «Оптические свойства полупроводниковых квантовых точек CdSe/ZnS и их специфическое взаимодействие с раковыми клетками MDA-MB-435»), Заключения, Выводов и Списка цитированной литературы, включающего 136 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена на 133 страницах и включает 23 рисунка и 3 таблицы.
