Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Структура ДНК и проблема гидратации двойной спирали 11
1. Структура ДНК и её полиморфизм 11
2. Исследование гидратации ДНК физико-химическими методами 21
3. Теоретические подходы к изучению проблемы гидратации ДНК 35
4. Рентгеноструктурный анализ гидратации ДНК 47
Глава 2. Экспериментальная часть 59
1. Калориметрический метод 59
2. Дифференциальная сканирующая калориметрия . 60
3. Низкотемпературный сканирующий дифференциальный микрокалориметр 62
4. Обработка калориметрических данных . 67
5. Использованные препараты 70
Глава 3. Калориметрическое исследование гидратации нуклеотидов 72
Глава 4.Калориметрическое исследование гидратации синтетических полинуклеотидов 91
Глава 5. Калориметрическое исслщование гвдратации природных днк. гетерогенность гидратной оболочки 105
1. Гидратация ДНК MiySODEIKTICUS 105
2. Гетерогенность гидратной оболочки ДНК 110
3. Сравнение данных микрокалориметрии и рентгено-структурного анализа 115
Выводы 119
Литература 123
- Исследование гидратации ДНК физико-химическими методами
- Теоретические подходы к изучению проблемы гидратации ДНК
- Низкотемпературный сканирующий дифференциальный микрокалориметр
- Калориметрическое исследование гидратации нуклеотидов
Введение к работе
Настоящая работа посвящена изучению гидратации нуклеотидов, синтетических чередующихся AT- и ГЦ- полинуклеотидов и природных ДНК методом адиабатической низкотемпературной сканирующей микрокалориметрии. Возможности метода низкотемпературной микрокалориметрии при исследовании гидратации биологических макромолекул (белков, нуклеиновых кислот и др.) и более сложных биологических объектов (клетки, ткани и т.д.) хорошо известны и изложены достаточно подробно [1-4]. Поэтому основное внимание нами будет уделено не методическим аспектам проблемы, а изложению и интерпретации экспериментальных результатов исследования гидратации двойных спиралей и субкомпонентов ДНК и сравнению данных микрокалориметрии с результатами других мощных физико-химических методов, применяемых для изучения гидратации макромолекул (рентгеноструктур-ный анализ, ЯМР, ИК-спектроскопия, диэлектрическая спектроскопия, акустические методы и др.).
Диссертационная работа состоит из общей характеристики работы, пяти глав и выводов. Первая глава - обзорная. В ней анализируются работы, посвященные исследованию структуры ДНК, её полиморфизму, изучению механизмов взаимодействия двойной спирали с молекулами растворителя, условиям, приводящим к переходу ДНК в различные упорядоченные конформации. Особое внимание в этой главе уделено современным кристаллографическим данным о гидратации двойной спирали, находящейся в различных формах, и расчетам гидратации отдельных оснований, нуклеотидов и фрагментов ДНК. С первого взгляда может показаться, что конформационному анализу и расчетам уделено в обзорной части слишком большое внимание. Однако, следует учесть, что роль расчетных методов резко возрастает, когда речь
- 5 -заходит о структурной интерпретации экспериментальных данных, полученных в растворе. Действительно, в этом случае прямое сравнение экспериментов с обнаруженными кристаллографическими закономерностями затруднительно, и требуется как можно более полная информация о конформационных возможностях ДНК и динамике гидратной оболочки. Именно такую информацию и дают конформационные расчеты. Таким образом, структурная интерпретация данных калориметрического эксперимента в растворах проводится на основе имеющихся расчетных и кристаллографических данных.
Во второй главе кратко описан метод низкотемпературной сканирующей микрокалориметрии.
Третья, четвертая и пятая главы посвящены изложению экспериментальных результатов исследования фазовых переходов растворителя в замороженных растворах нуклеотидов, синтетических полинуклео-тидов и природных ДНК в нативном и денатурированном состояниях, что дало возможность получить количественные данные о гидратации этих соединений, выявить специфику гидратации отдельных пар оснований в составе двойной спирали и сопоставить их с расчетными и кристаллографическими данными.
В выводах суммированы все основные результаты и заключения данного исследования.
Общая характеристика работы Актуальность темы. Успехи, достигнутые в последние годы в кристаллографии и физико-химии ДНК, свидетельствуют о том, что знание только статической структуры двойной спирали совершенно недостаточно для описания ее свойств, которые определяются деталями вторичной структуры ДНК, её конформационной гибкостью и динамическими характеристиками. Одним из центральных вопросов физи-
ки и физико-химии ДНК является выяснение конкретных механизмов взаимодействия структурных субъединиц двойной спирали с водно-ионным окружением. Именно эти взаимодействия, наряду с нуклеотид-ным составом и характером чередования оснований вдоль полинуклео-тидных цепей, определяют принадлежность ДНК к той или иной упорядоченной форме (структурный полиморфизм двойной спирали) и термодинамическую стабильность данной упорядоченной формы ДНК. Существенно, что характер взаимодействия двойной спирали с водно-ионным окружением различен для различных форм ДНК, что ставит вопрос о необходимости учета роли растворителя как при конформационных переходах ДНК в пределах двухтяжевого состояния, так и при описании перехода "спираль-клубок". Данные о координатах и типе динамики воды в ДНК, несомненно, помогут понять механизмы специфического и неспепифического взаимодействия важнейшей в функциональном отношении молекулы с белками - репресоорами и активаторами и нуклеотид-специфическими веществами и белками-рецепторами, определяющими включение систем клеточной и тканевой дифференцировки. Все перечисленные факторы свидетельствуют о чрезвычайной актуальности исследования детальной картины гидратации ДНК, определения примуще-ственных мест локализации молекул растворителя в структуре двойной спирали, выяснения их пространственной взаимоупорядоченности и динамики и говорят в пользу того, что расшифровка структуры гид-ратной воды в ДНК является необходимым этапом выяснения физических свойств и механизмов её функционирования.
Цель работы состоит в экспериментальном изучении гидратации природных и синтетических ДНК, в определении термодинамических параметров растворителя вблизи "поверхности" двойной спирали и в объеме и в установлении корреляции между параметрами гидратации двойной спирали и ГЦ-содержанном молекулы. Основными и конкретными
задачами при этом являются:
установление гидратных чисел (т.е. количества связанных молекул воды) для четырех нуклеотидов (АМФ, ТШ>, ГМФ, ІЩФ) в водных растворах, при различной их концентрации и оценка относительного влияния этих соединений на окружающие слои воды;
выяснение влияния отрицательно заряженных фосфатных групп
и оснований на термодинамические свойства и структуру близлежащих слоев воды;
определение термодинамических параметров фазового перехода воды в водных растворах синтетических AT- и ГЦ- полинуклеотидов и сравнительная оценка влияния этих гомополимэров на окружающие слои воды;
определение гидратных чисел для AT- и ГЦ- гомополимеров;
выяснение роли воды и стэкинг взаимодействия в увеличении термостабильности ДНК при увеличении ГЦ-содержания;
выяснение характера изменения гидратации двойных спиралей при их переходе в состояние статистических клубков;
определение параметров гидратации для природных ДНК с различным ГЦ-содержанном и установление эмпирическим путем возможной корреляции между параметрами гидратации двухспиральных структур
и нуклеотидным составом молекул природных ДНК.
Научная новизна. В работе метод низкотемпературной сканирующей микрокалориметрии впервые применен для одновременного изучения гидратации отдельных нуклеотидов, синтетических полинуклеотидов и ряда природных ДНК, что позволило одним и тем же физическим методом подойти к решению проблемы гидратации ДНК и её субкомпонентов. Последнее дало возможность проследить за изменением параметров гидратации двухтяжевых молекул ДНК по мере усложнения её организации. Впервые получены микрокалориметрические данные о гидратации
- 8 -
отдельных нуклеотидов. Показано, что по гидратационной способно
сти отдельные нуклеотиды располагаются в следующем ряду:
ТМФ > ГМФ > ЩФ >= АМФ. Выявлена роль метильной группы в гидра
тации синтетических чередующихся полинуклеотидов (поли- [d(A-T)]
и поли- у.(Г-Ш] ). Показано, что АТ-полимер характеризуется го
раздо большей гидратацией, нежели ГЦ- полимер ( ГТдТ«28.0 Ш^О/ШО;
ПГ|1в *6.0 MHg0^0)* Изучено денатурационное изменение гидрата
ции для AT- и ГЦ- полимеров. Показано, что увеличение термоста
бильности ДНК при росте ГЦ- содержания определяется, помимо воз
растания количества внутримолекулярных Н- связей, увеличением
стакинг-взаимодействий между парами. Уточнена эмпирическая зависи
мость параметров гидратации двойной спирали ДНК от ГЦ-содержания,
установленная ранее в ИФ АН ГССР. Показано, что гидратная "оболоч
ка" двойной спирали состоит из внутреннего ("структурного") и
внешних гидратных слоев. Впервые охарактеризованы все термодина
мические параметры фазового перехода лёд-вода в замороженных вод
ных растворах нуклеотидов, полинуклеотидов и некоторых природных
ДНК (напр., ДНК M.LySODEIKTIGUS ) в широком интервале кон-
центраций и температур. Впервые построена диаграмма состояния в координатах: температура - ГЦ-содержание - количество связанных молекул воды для водных растворов ДНК в интервале температур 0*100С и 0*100$ ГЦ-содержания.
Практическая и научная ценность. Экспериментально обнаруженная в работе микрогетерогенность гидратной оболочки двойной спирали ДНК, зависящая, в первую очередь, от ГЦ-содержания и чередования оснований, может играть важную роль при переходах ДНК из основной ("базисной") В-конформации в другие упорядоченные формы. Частично это обстоятельство нашло подтверждение установлением взаимосвязи между гидратацией, ГЦ-содержанием и способностью ДНК принимать
- 9 -различные упорядоченные формы. Выявленные в работе структурные особенности гидратной оболочки ДНК требуют внимательного анализа влияния на свойства гидратных слоев различных низко- и высокомолекулярных веществ, что чрезвычайно важно для понимания проблем организации, устойчивости, функционирования ДНК и установления кодов их специфического взаимодействия. Так, на основе полученных в данной работе результатов в ИФ АН ГССР были поставлены и реализованы эксперименты по изучению теплоемкости волокон ДНК при гелиевых температурах [5,6] и по выяснению специфики гидратации ГЦГЦ...-полимеров на их способность принимать левозакрученную кон-формацию ( 2 -ДНК), при высоких концентрациях солей [7] . Обнаруженные в работе закономерности гидратации ДНК крайне важны для правильной интерпретации результатов, свидетельствующих об изменении гидратации ДНК опухолевых клеток и изменении гидратных свойств опухолевых клеток по сравнению с нормальными [8-Ю]. Наконец, полученные в работе данные о характере фазового перехода лёд-вода в водно-солевых растворах нуклеотидов, полинуклеотидов, природных ДНК и выявленные нами особенности в низкотемпературных тепловых свойствах этих соединений, имеют крайне важное практическое значение для молекулярной криобиофизики, в частности, при решении проблемы консервации геномов высших организмов, с помощью низких и сверхнизких температур.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на пятом совещании по ковформационным изменениям биополимеров в растворах (Телави,1980 г.), на международном симпозиуме по биофизике нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов (Таллин, 1981 г.), на международном сипмозиуме по биокалориметрии (Тбилиси,1981 г.), на второй международной конференции по состоянию воды и ионов в биологических системах (Бухарест, 1982 г.,), на первом Всесоюзном
- 10 -биофизическом съезде (Москва, 1982 г.), на тестом Советско-фран цузском симпозиуме по структуре и функции белков и нуклеиновых кислот (Цхалтубо, 1982 г,), на школе по молекулярной биофизике (Харьков, 1983 г.).
Публикации. По диссертационной теме опубликовано 7 работ.
- II -
Исследование гидратации ДНК физико-химическими методами
В последнее время в работах, посвященных конформационным расчетам структуры ДНЕ в различных формах и изучению конформационных переходов в ДНЕ, все большее внимание уделяется проблеме гидратации этой макромолекулы, т.к. становится ясным, что без учета специфики взаимодействия пар оснований в составе двойной спирали с водной средой невозможно дать адекватное описание механизмов стабилизации спиральных структур, их динамическим свойствам и природе конформационных переходов.
Несмотря на то, что в отдельных случаях удалось получить монокристаллы фрагментов ДНК в различных формах с известной последовательностью оснований и методом рентгеноструктурного анализа определить координаты всех атомов в ДНК, а также молекул воды, находящихся в кристаллах, на сегодняшний день проблема гидратации макромолекул ДНК в растворе полностью не решена ни теоретически, ни экспериментально.
Взаимодействие ДНК с молекулами растворителя осуществляется различными путями. В первую очередь следует иметь в виду дально-действующий электростатический эффект, обусловленный заряженными фосфатными группами и их противоионами. Отметим, что молекулы растворителя наиболее сильно связываются именно с этими группами ДНК. Показано, что в пленках ДНК каждая фосфатная группа сильно связывает около двух молекул воды [37], а при высоких значениях ОВ эта величина достигает шести молекул воды на каждую фосфатную группу [38]. Относительный вклад дальнодействующего электростатического взаимодействия в общую гидратацию ДНК зависит от плотности заряда на поверхности полиэлектролита и от активности растворителя. При денатурации плотность заряда на поверхности ДНК уменьшается [39,40], что приводит к уменьшению гидратации этого типа.
Короткодействующее электростатическое взаимодействие и связывание с помощью образования водородных связей ( И-связей) между молекулами воды могут внести существенный вклад в общую гидратацию ДНК. Молекулы воды и нейтрализованные фосфатные группы могут вступать в диполь-дипольное взаимодействие. Образование водородных связей может быть весьма обширным, поскольку группы азотистых оснований и Сахаров, которые экспонированы в растворитель, могут образовать водородные связи с молекулами воды как в нативном, так и в денатурированном состояниях ДНК. В нативном состоянии дипольний момент макромолекулы, вероятно, хорошо экранирован [4l], а в денатурированном состоянии становятся возможными диполь-дипольные и заряд-дипольные взаимодействия, т.е. при денатурации ДНК возможно увеличение количества молекул воды, принадлежащих к гидратному слою этого класоа.
На сегодняшний день строго не установлено, какой вклад в общую гидратацию ДНК вносит т.н. "гидрофобная гидратация". Однако очевидно, что в стабилизации спиральной структуры ДНК важную роль играют стэкинг-взаимодействия оснований [42]. В их основе лежат гидрофобные эффекты, возникающие в стопке азотистых оснований вдоль главной оси спирали ДНК [42]. Эти взаимодействия приводят к "гидрофобной гидратации": основания предпочитают взаимодействовать друг с другом за счет Ван-дер-Ваальсовых и дисперсионных сил и выстраиваются стопкой; они сохраняют минимальный контакт с растворителем, что приводит к перераспределению молекул воды вблизи таких ассоциатов и упрочнению водного каркаоа в близлежащих слоях растворителя.
Первые работы по изучению механизмов взаимодействия ДНК с водным окружением появились сразу же после того, как Уотсон и Крик предложили двухспиральную модель этой молекулы. Так, в работе [43] подчеркивалось, что существует некоторое соответствие между спиральной структурой ДНК и межмолекулярной структурной симметрией жидкой воды. Был сделан вывод о том, что при растворении ДНК двойная спираль "вписывается" в ажурную структуру воды. (Утверждение явно спекулятивное с точки зрения динамических свойств растворителя и ДНК, сыгравшее, однако, положительную роль в разработке новых экспериментальных методов и подходов). Дальнейшие исследования водных растворов ДНК методами ядерного магнитного резонанса (ЯМР) [44] и диэлектрической проницаемости показали, что в действительности происходит некоторое "упорядочение" структуры воды, вызванное присутствием ДНК. По мнению авторов, это вызвано образованием "гидратных оболочек" вокруг макромолекулы.
Значительный вклад в понимание гидратации ДНК внесли фундаментальные работы Фалка и др. С помощью различной экспериментальной техники была изучена гидратация ориентированных волокон ДНК. Используя гравиметрический метод определяли вес воды, адсорбированной на Ма- и Li-солях "твердой" ДНК в зависимости от QB [45]. На рис.5 показана эта зависимость. Авторы пришли к заключению, что каждая фосфатная группа жестко связывает 2 молекулы воды с энергией связи приблизительно на 2 ккал/моль больше, чем энергия связи для молекул воды, адсорбированных на ДНК при высоких значениях влажности среды. Исчезновение гистерезиса адсорбции выше 80$ QB указывает на то, что при данных влажностях вода целиком заполняет "пустоты" в структуре ДНК, и двойная спираль полностью насыщается водой.
Теоретические подходы к изучению проблемы гидратации ДНК
В течение последнего десятилетия определенный успех был достигнут путем теоретических расчетов конформации и гидратации биомакромолекул, в частности фрагментов ДНК и отдельных нуклео-тидов. Ниже будут описаны основные результаты, полученные двумя подходами, которые нашли наибольшее применение: 1) "супермолекулярннй" подход 2) подход с применением метода Монте-Карло.
В "супермолекулярном" подходе [71-72] оценивается эффект отдельных молекул растворителя на исследуемую систему, в противоположность "континуальному" подходу, в котором тем или иным путем оценивается объемный эффект молекул растворителя на гидратируе-мую молекулу. Супермолекулярный подход, вероятно, весьма полезен для решения проблемы "связанной" воды, поскольку его целью является обнаружение наиболее вероятных мест локализации молекул воды в структуре биомакромолекул, энергетически наиболее выгодных способов взаимодействия вода-биополимер и учет влияния гидратации на конформацию и стабильность биомакромолекул.
Одним из самых эффективных подходов для изучения гидратации биополимеров является моделирование системы биополимер-вода с помощью метода Монте-Карло [73]. Метод оказался весьма удобным, поскольку моделируются случайные процессы, достаточно приближенные к реальным ситуациям в растворе. Он позволяет определять термодинамические параметры исследуемой системы, моделировать структуру растворителя при изменении температуры и конформацМн-нне превращения биомакромолекул, вызванные изменением свойств растворителя, т.е. изучает динамические характеристики системы.
С помощью указанных методов были смоделированы гидратные схемы азотистых оснований, Уотсон-Криковских пар оснований и фрагментов ДНК. Несмотря на то, что подобные расчеты связаны со значительными трудностями, вызванными сложностью исследуемых систем, с большими временами счета на ЭВМ и др., и результаты часто оказываются ориентировочными, во многих случаях они достаточно хорошо согласуются с экспериментальными данными.
Методом линейной комбинации молекулярных орбит в приближении самосогласующего поля АВ INITIO (ЛКШ СШ) был проведен полный квантовомеханический расчет гидратации пуринових и пиримиди-новых оснований ДНК (А,Г,Ц и Т) [74]. Были локализованы наиболее вероятные места гидратации этих соединений и посчитаны энергии взаимодействия молекул растворителя с участками оснований. Показано, что взаимодействие основание- О более благоприятно в случае, когда молекула воды лежит в плоскости основания.
В работе [75] методом атом-атомных потенциалов были определены схемы гидратации азотистых оснований Г,Ц,А и LL . Показано, что молекулы HgO, лежащие в плоскости оснований,наиболее сильно взаимодействуют с этими лигандами, и сдвиг молекул растворителя из этой плоскости приводит к ослаблению взаимодействия; наибольшее взаимодействие основание- О наблюдается при локализации молекул воды между гидрофильными центрами; в таких случаях взаимодействие /ч/ на 2 3 ккал/моль сильнее по сравнению со случаем Н-связывания с единичными центрами гидратации. Результаты качественно согласуются с данными работы [74І. Показано, что энергия взаимодействия молекул воды с основаниями убывает в следующем порядке: Г Ц А Ы
В работах [76-77] описана эффективная схема определения мест локализации молекул воды в нуклеотидных основаниях и Уотсон-Кри-ковских парах, базирующаяся на модификации метода Монте-Карло с использованием адаптивной процедуры случайного поиска. Найдены области гидратации для Г и Ц, А-Т и Г-Ц пар, а также энергетически наиболее выгодные конфигурации комплекса молекул HgO с этими соединениями. На рис.8 приведены схемы гидратации оснований и пар оснований. Показано, что области гидратации изолированных оснований в целом совпадают с областями гидратации для пар за исключением тех мест посадок молекул 0, которые с помощью Н-свя-зей образуют пары с комплементарными основаниями. Качественно схема гидратации совпадает с найденной в работе [75], однако в данной схеме выявлены также новые области гидратации пар оснований, в которых молекулы Н20 занимают мостиковые позиции между ними; для А-Т пары найдены две такие области, для Г-Ц пары - одна область. Используемый метод позволяет сократить объем вычислений и повысить эффективность нахождения точек гидратации.
Методом Монте-Карло были рассчитаны позиции и ориентации молекул воды, гидратирующих азотистые основания и пары оснований ДНК [78]. Расчеты были проведены для А,Г,Ц,Т в кластере из 40 молекул 0 и для А-Т и Г-Ц пар в кластере из 50 молекул 0. Сравнение данных по гидратации А при Т Ю0 К и "{"«300 К показало, что с увеличением температуры гидратация уменьшается. \ju груп-пы оснований связывают 4 молекулы воды; NH и СО группы на перифериях оснований гидратированы двумя молекулами 0. Полученная схема гидратации азотистых оснований принципиально не отличается от схем, найденных в [75-77], однако поскольку в этом случае растворитель моделируется большим количеством молекул воды, то места их локализации установлены более точно.
Низкотемпературный сканирующий дифференциальный микрокалориметр
В используемой модели калориметра регистрация тепловых эффектов, связанных с фазовыми превращениями растворителя в водных растворах биополимеров, осуществляется путем автоматической записи разности температур между двумя идентичными ячейками дифференциальной ампулы, прогревающихся с одинаковой скоростью (регистрируемая разность температур дТ пропорциональна количеству тепла, передаваемого от одной ячейки во вторую). В одну из ячеек заклады- вается исследуемый препарат, во вторую - эталонное вещество. Для получения дифференциальной кривой фазового перехода растворителя в процессе непрерывного прогрева обеих ячеек между ними осуществляется непрерывная отрицательная обратная связь по тепловому балансу посредством теплового потока через дифференциальную термобатарею, соединяющую ячейки сдвоенной ампулы. Интегрирование полученной таким образом кривой дает величину теплового эффекта, сопровождающего процесс фазового перехода растворителя в исследуемых объектах. На рис.19 приведены схемы калориметрической системы и дифференциальной ампулы. Ампула, детальное описание которой будет дано ниже, на тонких нейлоновых нитях подвешена внутри системы адиабатических экранов, температура которых автоматически следует за температурой дифференциальной ампулы. Экраны изготовлены из тонкой медной фольги и снабжены нагревателями.
Нагревателем служит манганиновая проволока, бифилярно навитая и прикленная (клеем БФ-4) на наружные поверхности экранов. Питание нагревателей осуществляется стабилизированным источником постоянного тока. В качестве датчика температуры калориметра был использован образцовый платиновый термометр сопротивления ТСГ-3, приклеенный на внутреннюю поверхность второго адиабатического экрана; сопротивление термометра при 0С 50 Ом. Температура калориметра измерялась мостом постоянного тока. Тепловой ключ служит для экранирования калориметрической системы от теплопритоков по подводящим проводам. Вся система тепловых экранов помещается внутри медной вакуумной камеры. Вакуумным уплотнением камеры и фланца служит индиевая прокладка. Вакуумная камера с калориметром погружается в металлический криостат, в который заливается хладоагент (жидкий азот). Основным узлом калориметра является дифференциальная ампула. Её корпус, изготовленный из чистой прокатанной меди в форме плоских цилиндров с отвинчивающимися крышками, отполирован и покрыт тонким слоем золота. Датчиком разности температур между ячейками сдвоенной ампулы служит манганин-константановая термобатарея (120 спаев), приклеенная к боковым поверхностям цилиндров по всему периметру ячеек. Расстояние между ячейками составляет 5 мм. Сигнал от термобатареи подается на индикатор нуля (с коэффициентом усиления Ю9), после чего регистрируется на самопишущем электронном потенциометре.
В качестве нагревательных элементов калориметрических ячеек используется манганиновая проволока (диаметром 0,05 мм), бифилярно навитая на донышки обоих цилиндров (основой изоляции служит клей БФ-4). Сопротивление каждого из нагревателей 200 Ом. Их питание осуществляется высокостабилизи-рованным источником питания постоянного тока. В качестве измерительных ячеек использовались вкладыши из нержавеющей стали. В зависимости от консистенции исследуемых веществ применялись вкладыши различных типов. Хороший тепловой контакт между вкладышами и медным контейнером достигался путем прокладывания между ними тонких листов из индия; затем контейнер закрывается крышками. Дифференциальные ампулы, используемые нами, основаны на конструкции, описанной в [98]. Теплоперетоки между калориметрической ампулой и окружающей средой могут быть вызваны следующими причинами: 1) конвекционные теплоперетоки; 2) теплоперетоки по излучению; 3) теплоперетоки по подводящим проводам. Для исключения теплообмена со средой, вызванного конвекцией, из калориметрической системы откачивается воздух и достигается вакуум (10 Ю тор). Тепловые потоки, вызванные излучением, зависят от коэффициента отражения излучаемых поверхностей, от их абсолютной температуры и разности температур между ними. Коэффициент отражения увеличивается за счет покрытия наружной поверхности дифференциальной ампулы и внутренних поверхностей адиабатических экранов тонкими слоями золота и хрома соответственно. Как было отмечено, для уменьшения АТ между ампулой и средой калориметр окружен системой адиабатических экранов. Теплоперетоки по подводящим проводам сведены к минимуму за счет использования тонких проводов, которые перед соединением с ампулой проклеиваются на тепловом ключе и адиабатических экранах. Высокая адиабатность калориметра является результатом точной регулировки температур тепловых экранов по отношению к температуре ампулы. Датчиками разности температур между отдельными узлами калориметра служат тести- и восьмиспаянные манганин-константано-вые термобатареи. Регулировка температур адиабатических экранов производтся электронной автоматической следящей системой, позволяющей поддерживать разность температур между отдельными узлами калориметра с точностью до Ю"4 градуса во всем рабочем диапазоне температур. Применялась схема контроля температуры адиабатического экрана, описанная в работе [98].
Калориметрическое исследование гидратации нуклеотидов
Ранние калориметрические исследования процесса фазового перехода лёд-вода в замороженных водных растворах глобулярных [53,I0l], фибриллярных [53,102] белков, белков мембран [ЮЗ] и нуклеиновых кислот ДНК [53,56-57,104-105] и РНК [Юб] достаточно однозначно показали, что для полного описания этого процесса и установления природы и механизмов взаимодействия биологически активных веществ с близлежащими слоями растворителя совершенно недостаточно наличия результатов одиночных калориметрических измерений; для этого необходимы прецизионные измерения термодинамических параметров процесса плавления растворителя в системе биологическое вещество -вода в широком интервале концентраций растворенных веществ [3-4] . Исходя из этого нами было проведено калориметрическое исследование процесса фазового перехода воды в растворах четырех нуклеоти-дов - АМФ, ГМФ, ТМФ и ЦМФ в широкой области их концентрации [107-108]. На рис.22-25 приведены температурные зависимости избыточной теплоемкости водных растворов этих нуклеотидов в температурной области фазового перехода лёд-вода дСр=$(Т, С) Как видно из приведенных зависимостей, к свойствам растворителя в растворах нуклеотидов следует отнести низкие значения температуры "диффузного" фазового перехода. Процесс плавления льда происходит не при каком-нибудь одном значении температуры, а наблюдается постепенный, диффузный переход типа порядок-беспорядок из твердой в жидкую фазу, причем следует отметить, что температура плавления льда во всех случаях ниже 0С, что говорит о достаточно сильном взаимодействии растворенных веществ с близлежащими слоями воды.
Следует отметить, что характер фазового перехода воды и экзотермических переходов, наблюдаемых далеко до начала температурного интервала плавления льда для всех четырех нуклеотидов, отличается друг от друга, что является отражением специфического характера взаимодействия отдельных нуклеотидов с молекулами растворителя. Б конечном счете это обстоятельство приводит к различным значениям гидратации этих веществ. Кривые дС,=3(Т) » полученные при прогреве замороженных водных растворов нуклеотидов, имеют сложный характер. Особенности получаемых при этом тепловых эффектов наглядно иллюстрируются типичной кривой тешюпоглощения, приведенной на рис.26. Видно, что тепловые эффекты, имеющие различную природу, характеризуются тремя температурными точками: Та соответствует середине температурного интервала, в котором при прогреве замороженной системы нуклеотид-вода наблюдается изменение теплоемкости дСр о , сопровождающее переход растворителя в стеклообразное состояние при охлаждении раствора (см. работы [I09-II0] , в которых детально изучены тепловые характеристики подобных переходов в системах, содержащих биоорганические вещества и воду), 7 - соответствует максимуму экзотермического пика, площадь которого пропорциональна количеству выделившегося тепла в процессе рекристаллизации (девитрификация) (см. также работы [і09-П0]). Гпг соответствует максимуму эндотермического пика, наблюдаемого при плавлении льда; площадь под этим пиком пропорциональна теплоте плавления льда в присутствии растворенного вещества, т.е. количеству расплавившейся части растворителя. Принимая во внимание резкое разделение пиков теплопоглощения, обнаруженное в трехкомпонентных системах, содержащих биополимер - І О-соль [57] , можно предположить, что сложный характер теплопог лощения обусловлен переходом определенного количества противоионов в раствор, где они образуют эвтектические смеси соль-лёд разной композиции, либо сильным влиянием заряженных фосфатных групп на объемные слои воды. легко видеть, что термодинамические параметры ( П ,Тд , Тпг , дСр.д , дНд .дНщ. ), характеризующие наблюдаемые тепловые эффекты, существенным образом зависят от типа нуклеотида (см.таблицу 6) и для данного нуклеотида - от концентрации вещества в растворе. С увеличением концентрации нуклеотида в растворе наблюдается: I) смещение всех особых температурных точек в сторону низких температур; 2) уменьшение энтальпии тепловых переходов (как экзотермического дНд , так и эндотермического дНт. ); 3) "смазывание" скачка теплоемкости дСр.д в температурном интер вале стеклования и, наконец, 4) исчезновение всех тепловых эффектов, включая процесс плавления объемного льда в системе (кривые 6(6); б; 7, 5(6) на рис. 3,23,24,25 соответственно). Следует отметить, что критические концентрации (соотношение НдО/нуклеотид), при которых не удается зафиксировать тепловые эффекты, связанные с фазовым переходом лёд-вола даже при самых высоких чувствитель-ностях калориметра ( 4 1СГ6 Дж/сек), разнятся для всех четырех нуклеотидов, что является результатом различия в количестве молекул воды, составляющих гидратные оболочки отдельных нуклеотидов.
Концентрационная зависимость термодинамических параметров процесса плавления льда в системе нуклвотид-вода наглядно показана на рис.27, на примере раствора ТМФ; видно, что с увеличением концентрации нуклеотида энтальпия фазового перехода дНт, уменьшается и при соотношении 0,70 г HgO/r ТМФ энтальпия плавления объемной фракции растворителя становится равной нулю (при таком соотношении вода/нуклеотид вся вода, находящаяся в системе, "связана" с растворенным веществом).
