Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Структура ДНК и факторы, опрвделящие её стабильность 11
1.1. Конформационные особенности ДНК 11
1.2. Гидратная вода и стабилизация структуры ДНК 21
1.3. Ионы металлов в ДНК 32
1.4. Внутримолекулярное плавление ДНК (экспериментальные данные) и проблемы стабилизации двойной спирали. 38
1.5. Плавление ДІЖ (теория) 49
Глава 2. Экспериментальная часть 59
2.1. Дифференциальный сканирующий микрокалориметр. 59
2.2. Использованные препараты 69
Глава 3. Влияние нейтральных солей на термодинамические параметры перекода спиралъ/клтбок днк 72
Глава 4. Влияние концентрации днк и homdu-t) cua-t) на тшюджммческие параметры процесса их внутримолекулярного плавления 103
Глава 5. Шфокалорйметрическое исследование тепловых свойств синтетических п0лвде30кси-рибонуклеотіщов в широкой области концентрации шмтральшх солей 115
Выводы 128
Литература.: 131
- Гидратная вода и стабилизация структуры ДНК
- Внутримолекулярное плавление ДНК (экспериментальные данные) и проблемы стабилизации двойной спирали.
- Влияние нейтральных солей на термодинамические параметры перекода спиралъ/клтбок днк
- Влияние концентрации днк и homdu-t) cua-t) на тшюджммческие параметры процесса их внутримолекулярного плавления
Введение к работе
Настоящая работа посвящена изучению влияния концентрации нейтральных солей и полимера на термодинамические параметры перехода спираль-клубок ДНК и синтетических полидезоксирибо-нуклеотидов. Знание энергетических характеристик внутримолекулярного плавления в широкой области условий внешней среды, позволяет сделать определенные выводы, касающиеся природы сил, стабилизирующих структуру нуклеиновых кислот, а также сделать выбор между различными возможными моделями их конформационных переходов.
Возможности метода сканирующей дифференциальной микрокалориметрии в области изучения конформационных превращений биологических объектов (белков, нуклеиновых кислот и т.д.) хорошо известны и общепризнанны. Первая модель микрокалориметрической установки была создана под руководством академика. АН ГССР Э.Л. Андроникашвили в Институте Физики АН ГССР еще в 1964 г. Поскольку у настоящей работы нет претензий, на принципиальное усовершенствование методики, основное внимание нами будет уделено изложению экспериментальных результатов по тепловым свойстваїл ДНК и их интерпретации с учетом имеющихся на сегодняшний день литературных данных.
Диссертационная работа состоит из общей характеристики работы, пяти глав и выводов. Первая глава - обзорная. В ней анализируются работы, посвященные исследованию структуры и структурному полиморфизму ДЕК, проблемам гидратации и локализации молекул воды и ионов металлов в структуре двойной спирали, внутримолекулярному плавлению и проблеме стабильности нуклеи-
новых кислот. Особое внимание в этой главе наряду с данными по изучению термодинамических параметров процесса внутримолекулярного плавления полинуклеотидов уделено современным кристаллографическим данным об ионо-гидратной оболочке ДЕК.
Во второй главе кратко описан метод сканирующей дифференциальной микрокалориметрии, дается характеристика используемых препаратов и описаны условия проведения экспериментов.
Третья, четвертая и пятая главы посвящены изложению экспериментальных результатов исследования переходов спираль-клубок ДНК с различными составами оснований и синтетических полинуклеотидов; поли dA d,T, поли сЦА-Т) d(A-T), поли Ж(А-Ц) СІ(Г-Т) и поли сЦТ-Г), в широкой области концентраций нейтральных солей и полимера, что дало возшжность получить количественные данные о зависимости стабильности изученных объектов от условий окружающей среды. Особое внимание уделено результатам по калориметрическому изучению феномена изменения относительных стабильностей AT и ГЦ - пар.
В выводах суммированы все основные результаты и заключения данного исследования.
Общая характеристика работы
Актуальность исследований структуры и структурных превращений ДНК определяется её значением для понимания механизмов. функционирования этой «самой главной" из биологических макромолекул. Анализ литературных данных показывает, что несмотря на. обширный материал, накопленный к настоящему времени, детальные молекулярные механизмы4 стабилизации ДЗК до сих пор ос-
таится непонятыми. Ценную информацию о взаимодействиях, определяющих структуру двухспиральных молекул ДЕК и силах, их стабилизирующих, дает изучение денатурации ДНК, при этом значительный интерес представляют интенсивно исследуемые в последние годы разные упорядоченные формы ДНК в пределах двухтяжево-го состояния (А, В, ) и их переходы из упорядоченного в клу-бкообразное состояние. Исходя из того факта, что жизнеспособность клетки в существенной степени определяется стабильностью генома к воздействию различных факторов окружающей среды, представляется чрезвычайно актуальным получение непосредственных термодинамических величин процессов конформационных переходов в ДНК в широком интервале таких параметров внешней среды как концентрация полимера (или воды) и ионов солей. В связи с этим проведение исследований по влиянию ионов солей, влажности и температуры на изменение структуры и стабильности ДНК различного происхождения, равно как и полинуклеотидов с .заданной последовательностью оснований, является важной задачей.
Актуальность подобного исследования определяется также тем, что изучение стабильности концентрированных растворов ДНК, на наш взгляд, позволяет более адекватно моделировать процессы влияния различных факторов на ДНК In VIVO , поскольку в любых биологических системах ДНК существует в компактном состоянии, т.е. различные участки полинуклеотидной цепи находятся в условиях сильного межмолекулярного взаимодействия, что существенным образом определяет эффект влияния концентрации ионов и воды на структуру ДНК.
В условиях, создающих предпосылки для изменения относительных стабильностей AT и ГЦ - пар (высокие концентрации опреде-
ленных солей и полимера) особенно важным является получение непосредственных данных о термодинамических величинах конфор-мационных изменений для правильной экстраполяции результатов к ситуации, близкой к условиям функционирования ДНК ІГІ ViVO Кроме того, детальное исследование термодинамических параметров денатурации ДНК в условиях равенства стабильное тей AT и ГЦ - пар (т.е. в условиях, когда гетероголимерная двухспиральная структура превращается в мгомополимерную") представляет самостоятельный физический интерес и является акутальной для физики ДНК.
Целью настоящей работы являлось детальное микрокалориметрическое исследование процесса конформационных изменений природных ДЕК с разным ГЦ-с о держанием, с тем, чтобы подробно описать механизмы и характер внутримолекулярного плавления при экстремальных внешних условиях - высоких концентрациях солей и самих полимеров. Кроме того, для выяснения роли последовательностей нуклеотидов на эти процессы было необходимо проведение термодинамического исследования синтетических ДЕШ с разным чередованием оснований.
Конкретной задачей при этом являлось:
1. Получить термодинамические параметры перехода спираль-
клубок для ДЖ различного происхождения (ДЯК из тимуса телен
ка, М-LisodeLictLGu,s,T.ІРі|г-1^ог/іпгІс, , фатов: Т2, Т4, Сд и Т7),
в широкой области концентраций нейтральных солей (^Нр^ІМВс,
Ыг , CsOt , Cs2S04, Nc^SOz,, NaCeO^. и др.).
2. Провести микрокалориметрическое исследование процесса
внутримолекулярного плавления синтетических полидезоксирибо-
нуклеотидов: поли СІА СІТ, поли d(A-T) d(A-T), поли
dXA-Ц) СІ(Г-Т) и поли (і(Т-Г) в широкой области концентрации солей (C2H5)4NBu-. nNaCb .
3. Изучить влияние концентрации ДНК из тимуса теленка и
на процесс их внутримолекулярного плавления в присутст
вии разных количеств соли - NaC/.
4. Получить микрокалориметрические данные относительно
влияния концентрации синтетического полинуклеотида поли d(A-T)
d(A-T), на термодинамические параметры её денатурации,
5. Проанализировать полученные экспериментальные результа
ты в свете имеющихся на сегодняшний день литературных данных
с целью выявления конкретных структурных и термодинамических факторов, определяющих стабильность двойной спирали полидезо-ксирибонуклеотидов и дифференциальные свойства AT и ГЦ-содер-жащих последовательностей.
Научная новизна. Впервые методом микрокалориметрии проведено детальное исследование тепловых свойств ДНК (ДНК из тимуса теленка, M-LlsocLe'itdlcub,!". P^l-^ot/raLS , фага Сд, фага Т7, фага Т2, фага Т4 и .со&1 ) и синтетических полидезо-ксирибонуклеотидов (поли ІА dT, поли d(A-T) d(A-T), поли СІ(А-Ц) d(r-T) и поли d(T-D в широкой области концентрации полимеров и ионов нейтральных солей.
Подтвержден факт инверсии относительных стабильностей AT и ГЦ-пар ДНК в присутствии бромида тетраэтиламмония. Предложены два новых метода точного определения концентраций соли и полимера соответствующих точке инверсии.
Показано, что в точке равенства стабильностей AT и ГЦ-пар ДНК, ширина интервала плавления имеет минимальное значение -д.Тт = 0,6 + 0,1, независящее от нуклеотидного состава и
конкретной последовательности.
Предложен энтропийный механизм, объясняющий изменение относительных етабильностей AT и ГЦ-обогащенных участков ДЕК.
Показана возможность инверсии относительных ста,бильностей AT и ГЦ-пар в Na-евой соли ДВК в условиях, когда весь растворитель находится в структурированном состоянии, т.е. при минимуме энтропии системы ионы-вода.
Впервые непосредственно изменены термодинамические параметры плавления синтетического полинуклеотида поли d(T-D.
Эти положения выносятся на защиту.
Теоретическая и практическая ценность. Полученные результаты имеют фундаментальное значение для биофизики ДНК, т.к. показано, что в широком интервале условий внешней среды, молекула ДНК является термодинамически устойчивой системой, что чрезвычайно выгодно для хранения наследственной информации. Выявленные в работе закономерности конформационных переходов ДНК в зоне инверсии относительных етабильностей AT- и ГЦ-пар, должны быть учтены при синтезе и использовании ряда фармакологических препаратов, действие которых предназначено как актива,-торов, так и ингибиторов генной экспрессии. Обнаруженный меха,-низм инверсии относительных етабильностей AT и ГЦ-пар двойных спиралей при воздействии ионов солей в условиях дегидратации двойной спирали и результаты по изучению влияния концентрации ионов на внутримолекулярное плавление синтетического полидезо-ксирибонуклеотида, следует учесть также и при интерпретации данных, касающихся механизмов образования и закрепления мутаций, приводящих к трансформации нормальных клеток в опухолевые.
Апробация работы. Основные результата диссертационной ра-
боты докладывались и обсуждались на: Шестой Всесоюзной конференции по калориметрии (Тбилиси, 1973), Втором Всесоюзном совещании по конформационным изменениям биополимеров в растворах (Тбилиси, 1973), Четвертой международной конференции по химической термодинамике (Монрелье, Франция, 1975), Третьем Всесоюзном совещании по конформационным изменениям биополимеров в растворах (Тбилиси, 1977), Четвертом всесоюзном совещании по конформационным изменениям биополимеров в растворах (Телави, 1980).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.
- II -
Гидратная вода и стабилизация структуры ДНК
Первые же рентгенографические данные указали на непосредственное участие молекул воды в формировании пространственной структуры ДНК /50/. В классических работах Фалька с соавторами /51, 52/ было замечено исчезновение характерных максимумов в спектрах кругового дихроизма в образцах, относительная влажность -в которых была ниже определенного критического значения. Этот факт был истолкован как невозможность спаривания комплементарных оснований ДНК в исследуемых условиях.
На основе ИК-спектров ДНК, полученных при различных относительных влажностях, Фальком с соавтораїли /53/ были представлены первые данные о гидратации разных реакционных центров в двойной спирали (Рис.4).
В связи с уточнением молекулярных моделей ДНК и интенсивным изучением природы конформационных переходов двойной спирали, на сегодняшний день выяснение мест локализации молекул воды в структуре ДНК становится особенно актуальным.
Для решения проблемы гидратации ДНК применяются самые различные методики и подходы. Наиболее полный обзор литературных данных по этому вопросу приведен в работах /54, 55 и др./, которые указывают на обширность полученного различными лсследователями материала. В частности, Малеевым с соавторами методом ИК-спектроскопии изучены структурные превращения сахарофосфат-ной цепи и азотистых оснований гидрата ДНК с изменением относительной влажности /56/. Показано /57/, что азотистые основа,-ния в некоторой степени могут гидратироваться и при очень низких значениях относительной влажности. Ими же /58/ при исследовании термостабильности гидратных структур ДНК тимуса теленка в интервале температур 0-Ю0С методом термогравиметрии показано, что удаление молекул гидратной воды с повышением температуры образца протекает трехстадиино: первая стадия соответствует интервалу температур 20-32С и связана с потерей 19 молекул воды на нуклеотид; вторая, которая охватывает интервал 70-95С, сопровождается потерей только 6-7 молекул воды на нуклеотид. Наиболее сильно связанные 5-6 молекул воды на нуклеотид удаляются с ДНК в интервале температур 105-П6С. По мнению авторов, для стабилизации двунитевой структуры ДНК нужны минимум 10-19молекул воды на нуклеотид.
На факт дегидратации и переориентации молекул воды в структуре ДНК в различных процессах указывают данные Любас и Вилчока /59-61/, полученные методом ЯМР. В частности, в /59, 60/ было показано, что процесс тепловой денатурации сопровождается уменьшением количества пневращательно связанных 1 молекул воды, а полученные в /61/ результаты дали авторам повод предположить, что энергия, вводимая в раствор ДЖ до плавления спирали, используется не только на денатурацию молекул, но и на транслока-циго диполей молекул воды в гидратной оболочке ДНК.
В изучении гидратации ДНК успешно применяются расчетные методы. В частности, в работе /62/ найдены преимущественные места связывания молекул воды в основаниях, которые присутствуют в молекуле ДНК, а в работе /63/ такие же центры экспериментально найдены в пмини-дуплексе" В-формы двойной спирали. Методом Монте-Карло /64/ для одной из. двухцепочечных форм В-ДНК построены пространственные модели гидратированных спиралей. Проведены расчеты электростатического потенциала для В-ДНК и левоспи-ральной Z. -ДНК /26/, а также для ряда синтетических полинук-леотидов /65, 66/. В /26/ делается вывод, что участки ДНК с наиболее глубоким минимумом электростатического потенциала располагаются у В-ДНК в широком желобе, а, у Е -ДНК - в узком. В работе /65/ найдено, что у „додекамера Дикерсона" минимум электростатического потенциала проходит в малом желобке, в центре молекулы. Результаты /66/ указывают на существенное отличие электростатических потенциалов для полинуклеотидных цепей с различным нуклеотидным составом как в желобках, так и вблизи фосфатных групп.
Естественно предположить, что существование вдоль молекулы ДНК участков с различным электростатическим потенциалом, т.е. с разной реакционноспособностью, может привести к гетерогенности в структуре гидратной воды и близлежащих слоев растворителя. В пользу данной концепции говорят результаты Туманяна и Мянника /67/, которые, применив метод Фурье-синтеза, пришли к весьма важному выводу об ассимметрии в гидратации широ-. кого и узкого желобков двойной спирали, показав предпочтительную гидратацию АТ-богатого малого желобка, К аналогичному выводу экспериментально пришли Тунис и Херст еще в 1968 г. /68/, которые показали, что гидратация ДНК растет с ростом доли АТ-пар.
В последующих работах многих авторов /ІЗ, 69-71/ уже исследовались как роль гидра.тной воды в стабилизации той или иной .. формы ДЖ, так и влияние конкретной нуклеотиднои последовательности на гидратацию и структуру спирали.
В работах, выполненных в лаборатории Мревлишвили /72-75/, было показано, что при рассмотрении природы гидра,тации ДНК, кроме определения преимущественных мест локализации молекул воды в структуре двойной спирали, необходимо учитывать и гетерогенность её гидратной оболочки, зависящую от ГЦ-содержания и чередования пар нуклеотидов вдоль цепи. Методом низкотемпературной сканирующей микрокалориметрии ими изучены термодинамические параметры процесса фазового перехода воды в водных растворах натриевых солей нуклеотидмонофосфатов ( СІАМФ, СІТМФ, dJM, СІЦМФ), чередующихся полинуклеотидов Na-поли d(A) и Na-поли сЦГ-Ц), а также природных Na-ДїїК (фага Т2, KUjsoieiiCt. и тимуса теленка).
Внутримолекулярное плавление ДНК (экспериментальные данные) и проблемы стабилизации двойной спирали.
ДНК весьма стабильна в широком диапазоне условий среды /112/. На границах зоны стабильности под влиянием кислых и щелочных значений рН, больших концентраций ионов, органических растворителей и температуры происходит денатурация ДНК, приводящая к разделению двойной спирали на две цепи /ИЗ/, обладающие гораздо большей гибкостью, чем в составе двойной спи- рали /114/. Статистический сегмент для них включает несколько мономеров звеньев. Процесс денатурации часто называют переходом спираль-клубок или просто плавлением ДНК. Процесс плавления ДНК сопровождается уменьшением вязкости и оптической активности, исчезновением гиперхроизма. /113, 115/ и значительным возрастанием электропроводности растворов ДНК /116/,что свидетельствует о выбрасывании противоионов в ходе денатурации /116,; 117/. Денатурация ДНК представляет собой весьма сложный процесс /118/, который сопровождается разрывом водородных, связей между основаниями, исчезновением стэкинг взаимодействий, развертыва-нием цепей, нуклеацией клубковых областей среди спиральных районов и, возможно, какими-то другюли траноконформационными эффектами. Существенную информацию о процессе плавления ДНК дает измерение величины гиперхромного эффекта. Из-за того, что взаимодействие между основаниями, приводящее к обратному гиперхром-ному - гипохромному эффекту - очень быстро спадает с расстоянием, величину эффекта можно с хорошей точностью считать пропорциональной числу спиральных участков.
Показано /119/, что в гиперхромный эффект основной вклад вносят внутритяжевые взаимодействия, а не водородных связи. Наиболее полно исследована тепловая дена.турация ДНК, т.е. переход спираль-клубок при нагревании. Кривую зависимости доли расплавленных звеньев (1-6) от температуры называют кривой плавления. Основными характеристиками кривой плавления являются температура плавления Т и ширина интервала, плавления дТ , которая для спектрофотометрических кривых определяется как T = тт т— , а для микрокалориметрических, как ширина пика lEPflwax на полувыеоте. Используя уравнение сЛТ tna Trvv =AHVH , можно определить Вант-гоффовскута энтальпию перехода - AHVH . Соотношение AHv н. к дН , вычисленной из калориметрической кривой, определяет длину кооперативного участка. Большое количество экспериментальных исследований посвящено изучению зависимости температуры плавления ДЕПС от различных факторов. Важнейшей из зависимостей такого рода является установленная Мармуром и Доти /120/ зависимость Ту от ГЦ-содержання, которая оказалась настолько четкой, что в дальнейшем измерения температуры плавления в стандартных условиях (ISG С), часто использовались для определения ГЦ-состава вновь выделенных ДНК. При изменении концентрации нейтральной соли зависимость Мармура и Доти нарушается - изменяется температура плавления ДЕПС. В работе /121/ установлена следующая связь между Тт (U[NaJ и ГЦ-содержанием молекул ДНК- Хо . где: Т - выражена в С [Na]- концентрация ионов в молях.
Приведенная эмпирическая зависимость оказывается справедливой, по крайней мере, в области концентрации Na от 6 х 10 до 0,3 М. Температура, соответствующая середине термодинамического т перехода спираль-клубок, когда Q = -=- , отвечает равенству СВОбОДНЫХ ЭНерГИЙ ЭТИХ ДВУХ СОСТОЯНИЙ, Т.Є. дН - TmASrvV = О, где: лН - энтальпия плавления, Тт.- температура плавления, Д-эщ- энтропия плавления. Добавление нейтральной соли к двухкомпонентной системе вода-ДНК может изменить термодинамические потенциалы компонент по закону Гиббса-Дюгема и сдвинуть вышеуказанное равновесие свободных энергий либо в одну, либо в другую сторону. Сдвиг, естественно, будет выражаться в изменении Тп путем изменения суммарной энтальпии или суммарной энтропии, или же путем изменения обеих величин. При низких концентрациях солей ка.тионы экранируют отрица,-тельно заряженные фосфатные группы преимущественно нативной ДНК, стабилизируя спиральную форму значительно сильнее, чем клубкообразную. Исследования влияния I:1-валентных электролитов на Т в ДНК показали, что при сравнительно низких концентрациях солей она увеличивается прямо пропорционально логарифму их концентрации /122/. Показано, что катионы солей по стабилизирующему действию на нативную структуру ДПК располагаются в ряд: (СН3) N " (С КІН -С ІЛ /123/, в порядке убывания ионного радиуса и увеличения гидратируемос-ти. Ряд приведен для ионной силы 0,ЗМ. Расположение ионов в ряд зависит от ионной силы и автором работы /123/ это объясняется проявлением лиотропного действия солей уже при низких концентрациях. В обла.сти концентраций 0,3-ІМ лиотропные эффекты начинают преобладать над электростатическими, приобретая решающую роль при концентрациях Ш /124/.
Влияние нейтральных солей на термодинамические параметры перекода спиралъ/клтбок днк
Из результатов, приведенных в обзорной части работы (гл.1, 1.5), следует вывод о разной стабильности AT и ГЦ пар в ДЖ /161, 166/. Экспериментальные и теоретические исследования перехода спираль-клубок в ДНК и синтетических полинуклеотидах . показали, что основным параметром, определяющим форму кривой- плавления заданной нуклеотидной- последовательности, является именно это отличие в термостабильности пар.AT и ГЦ (Гл.I п.1.5). В связи с этим, для дальнейшего, более глубокого понимания-процесса перехода спираль-клубок,, существенный интерес представляет нахождение способов изменения относительной стабильности AT и ГЦ-пар без заметного изменения структуры молекулы ДНК. . ... Наиболее легко определяемым.экспериментальным параметром, по которому можно судить о разности в термостабильностях поли (ІАТ. И поли .(ІГЦ, является .ширина перехода ДТ . Для точного определения параметра їщ - т., обычно пользуются следующим .. методом /I2Q, 134/: при данной ионной силе ..измеряется температура, плавления набора образцов ДНК с различным ГЦ-содержанием, а затем из наклона графика зависимости. Т от Хрц ( dl/аХщ) определяется Тгц - Тд-р....В работах /179, 194/ предложен более .. простой и удобный метод,.а именно: зная для данной.ДНК величины дТи и Тщ - ТАТ, при некоторых условиях можно посчитать. Тщ - ТАТ. для других значений ионных сил, исходя из ширины интервала плавления. Уже в работе /126/ было отмечено варьирование параметра j - в различных растворителях. Если при стандартных ионных . условиях дифференциальная стабильность тЪ- = 0,41, в дестабилизирующих солях она увеличивается: для концентрированных растворов до 0,56, а в растворах NaCf CO до 0,60.
С увеличением концентрации сульфатов и хлоридов, как показано .. J -г в ра.боте /126/, у ., уменьшается, причем эффективность сульфатов выше. Например, в растворе 4,5 М С62 tv = 0,03. Для использованных.в работе /134/ солей отмечено, что г UXrUn монотонно уменьшается с уменьшением активности воды. Опираясь на данные /195/, согласно, которым, гидратация ДНК - однознач--ная функция активности воды, авторы /134/ наблюдаемое уменьшение 4тг связывают с изменением гидра,тации ДНК. Ме оРУ . Фон Х_ „удалось /196/ в растворах ЗМ. (СН3)4 NG и 2,4 М (%) \1С& .совместить профили кривых плавления ДЇК различного состава, т.е. получить ситуацию, когда . -1 - = 0. При более высоких концентрациях этих солей ГЦ бога-ЛХги, тые ДНК плавятся при.меньших температурах, чем AT - богатые ( V 0) ХРис.12). Интересно.отметить, что концентрация. аДгц, тетраалкиламмониевых (ТАА) солей, при которой происходит инверсия относительных термостабильностей AT и Щ-пар, для ДЯК с различными нуклеотидными составами, с хорошей точностью совпадает друг с другом. Предполагая, что уравнивание дифференциальных стабильностей AT и ГЦ-пар может..происходить вследст-. вие преимущественного взаимодействия ТАА-онов либо с нативны-ми участками, богатыми.АТ-парами, либо с денатурированными участками, богатыми ГЦ-парами, и учитывая результаты /197/, указывающие на некоторую избирательность связывания этих ионов с AT парами, Мелхиор и фон Хиппель вероятной причиной преимущественной стабилизации АТ-богатых участков в ДНК считают специфическое связывание №3)4NCd и (С2Н5)4 МСС с АТ-парами в большом желобке спирали. Однако в механизмах, предложенных в работах /196/ и /134/, оставались непонятными соответственно.следующие факты: 1. Почему молярность растворителя., при которой происходит инверсия, не зависит от содержания ГЦ-пар? 2.
Почему при общем для всех солей уменьшении активности .. воды с увеличением концентрации соли /126, 195/, так по разному действуют они и на общую с табильность ДНК и на параметр Для получения ответов на эти и ряд других вопросов, которые будут обсуждены ниже, с целью получения систематических количественных данных о влиянии концентрации солей различной : по характеру воздействия на стабильность двойной спирали природы на термодинамические параметры. плавления ДНК разного химического состава и с разным характером последовательности нуклеотидов, мы применили вышеописанный метод дифференциальнойt сканирующей микрокалориметрии. Для ряда препаратов, в количестве которых -мы были особо ограничены, проведена спектрофотометрические исследования,, в институте молекулярной генетики АН СССР, в лаборатории Ю.С.Лазуркина, на спектрофотометре и Unlearn, b IP 800" с термостатированной ячейкой.
Влияние концентрации днк и homdu-t) cua-t) на тшюджммческие параметры процесса их внутримолекулярного плавления
Для более глубокого понимания механизма воздействия растворителя на общую стабильность и относительную термостабильность AT- и ГЦ-обогащенных участков ДНК, представляло интерес исследовать, как влияет увеличение концентрации полимера на термодинамические параметры процесса перехода, спираль-клубок. Для этой цели мы провели микрокалориметрические исследования разбавленных и концентрированных растворов и пленок ДНК из тимуса теленка и .00 1 при различном содержании ионов Nof /215/. В качестве соли мы избрали NaCt , т.к. было известно, что она в широких пределах её концентрации, практически не меняет относительную стабильность AT и БД-пар /І34Д На рис.23 приведены кривые теплопоглощения ДНК 6.сои (рН 7,0 3»10 4 иМ NaCt), пересчитанные на I гр.вещества при различных концентрациях полимера. Кривая I соответствует концентрации 10,46. В этом случае процесс плавления охватывает температурный интервал 39-70С с максимумом пика теплопоглощения при 62С. Энтальпия плавления равна 8,1 ккал/моль б.пар. Увеличение концентрации полимера до 30% приводит к увеличению дН iTR ; при дальнейшем увеличении концентрации полимера до 55% дНк и Т остаются постоянными и равными дН = 9,8 ккал/моль б.пар, Т = ЮЗС. При более высоких концентрациях значения этих параметров резко уменьшаются и пики начинают расширяться. Максимальная концентрация, измеренная нами, соетавляет 84%, при более высоких концентрациях полимера тепло-поглощение не наблюдалось, что, естественно, указывает на исчезновение спиральной структуры. Отметим, что при максимально высокой, из измеренных концентраций - 84% - дН = 3,5 ккал/ моль б. пар Т я 79С. Аналогичные измерения были проведены для ДНК .coll при других концентрациях ионов No.
В частности, концентрация NoXt менялась от 3-Ю go Z М. Особый интерес представляло проведение аналогичных экспериментов на ДЕЖ тимуса теленка - из-за наличия у неё ГЦ обогащенной сателлитной фракции. На рис.24 приведены кривые плавления ДЖ тимуса теленка при различных концентрациях полимера. Как видно, увеличение концентрации ДНК вызывает сдвиг кривой плавления к более высоким температурам с одновременным сужением интервала плавления. Теплопоглощение, соответствующее са,-теллитной фракции (область температур 70-75С при концентрации равной 0,22%), с увеличением концентрации полимера сдвигается по температурной шкале менее интенсивно, относительно основного максимума, и при концентрации ДНК, равной 46,5%, кривая плавления имеет симметричную форму (Рис.24). Энтальпия и температура плавления при этой концентрации равны дН . = 9,6 + + 0,4 ккал/моль б.пар и Тк = Ю4С. Приведенные значения остаются неизменными до концентрации 55%, Дальнейшее увеличение концентрации ДНК приводит к резкому уменьшению дН и ,Тт и к сужению кривой плавления. При концентрации ДЖ 63% процесс плавления протекает в очень узком температурном интервале.и характеризуется следующими параметрами перехода: дН = 5,8 ккал/моль б.пар, Ту = 90С и дТ = 1,0.
В области концентраций 75-80% температурный интервал плавления расширяется и на кривой плавления с низкотемпературной стороны появляется пик, соответствующий плавлению сателлитной фракции (Рис.24). Представленные на рис.25 результаты показывают, что характер зависимостей д =- (С ( +) ж Ui j(PN&) не меняется от концентрации ионов Na в области 3»Ю""4 - 3-Ю"3 М. По мере увеличения концентрации ионов зависимость $(Ci)a) теряет ту колоколообразную форму, которая наблюдалась в образцах с концентрацией ионов 3«Ш 4 - 3 10 М NaC . в случае концентрации Ma , соответствующей 0,1 М раствору NaCft t в интервале концентрации ДНК 0,46 - 20$, наблюдается слабое возрастание дНп и Т (соответствующая кривая на рисунке 25 не нанесена). При концентрациях ДНК, превышающих 20$, дН и Т остаются постоянными, а затем довольно резко уменьшаются в интервале концентраций 30-80$. В случае 2 М N&C1 (Рис.25) дНк практически не меняется, а Тгч меняется сравнительно слабо, в области концентрации полимера 0,46 - 18$. Увеличение концентрации ДНК выше 20$ сопровождается монотонным уменьшением обеих термодинамических параметров, характеризующих переход спираль-клубок в ДНК. Из рис.25 наглядно видно, что если при низких молярностях уменьшение дН и Т происходит в достаточно узкой области концентрации полимера (60-70$), то для 2 М NaCC этот интервал растянут и охватывает область концентраций от 18 до 80$. Величина же энтальпии плавления ДНК, для всех вышеприведенных случа,-ев, уменьшается от своего максимального значения, составляющего дН = 9,8 ккал/моль б.пар до 2,2 ккал/моль б.пар.
