Содержание к диссертации
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ 15
1.1.1. ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ
ПЦР 16
Структура и совместимость праймеров 16
Денатурация ДНК-матрицы 18
Температура отжига праймеров 19
Количество циклов амплификации 19
1.1.2. ЗНАЧЕНИЕ ПЦР ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ
МУТАЦИЙ И АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ 21
1.1.2.1. Обзор методов детекции мутаций в ПЦР-
ФРАГМЕНТАХ 23
1.1.2.1.1. Полный анализ нуклеотндной
последовательности, проводимый с помощью
секвенироваиия 23
Определение нуклеотндной последовательности методом секвенироваиия по Сетеру 23
Секвенирование, основанное на гибридизации... 24
1.1.2.1.2. Методы, направленные на идентификацию
отличий в нуклсотилиои последовательности или на
определение избранных мутаций 25
1.1.2.1.2.1. Конформационные методы 25
Метод, основанный на локальном плавлениии ДНК 26
Гетеродуплексный анализ 26
Конформационно-чувствительный электрофорез в агарозе 27
Коиформациопиый полиморфизм однонитевых фрагментов ДНК 28
Лигазная цепная реакция 28
Гибридизация и микрочипы 29
Использование рестриктаз для детекции мутаций 31
Микросиквенс 32
Использование белков, узнающих иекомплементарности 32
Химическое расщетснис некомтементариостей 34
Метод "молекулярныхмаяков" (Molecular beacons) 34
1.1.2.1.2.9. Аглель-специфическаяамтификация 35
1.1.3. ПРЕИМУЩЕСТВА «ГНЕЗДОВОГО» МЕТОДА
ПРОВЕДЕНИЯ ПОЛИМЕРАЗНОИ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ 35
АНАЛИЗ ГЕНА RPOB КАК МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ К РИФАМПИЦИНУ У MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS 37
ОПАСНОСТЬ ИНФИЦИРОВАНИЯ ВИРУСОМ ГЕРПЕСА И ЗНАЧЕНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ МЕТОДОВ В ЕГО ДИАГНОСТИКЕ 40
ПРИМЕНЕНИЕ ПЦР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ
ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ 41
АКТУАЛЬНОСТЬ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ В УСЛОВИЯХ СОВРЕМЕННОГО ОБЩЕСТВА 41
ВЫБОР ГЕНЕТИЧЕСКОЙ МИШЕНИ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ YERSINIA PESTIS 42
1.5. ХОЛЕРНЫЙ ЭНТЕРОТОКСИН КАК ФАКТОР
ВИРУЛЕНТНОСТИ И МИШЕНЬ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ43
1.6. РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ГЕПАТИТА А И
ЗНАЧЕНИЕ ПЦР В ЕГО ДИАГНОСТИКЕ 44
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ 46
2.1. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ И ВИРУСНЫЕ ШТАММЫ,
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ, ИСТОЧНИКИ
КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ 46
2.2. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК И РНК 51
Выделение ДНК из М. tuberculosis 52
Выделение РНК вируса гепатита А 54
Выделение ДНК Y. pestis, V. choleraew вируса герпеса 55
ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ПЦР 56
ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР И СОВМЕЩЕННЫХ РЕАКЦИЙ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ С ПЦР 57
СЕКВЕНИРОВАНИЕ ГЕНА RPOB MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS 66
АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ АМПЛИФИКАЦИЯ 68
АНАЛИЗ КОНФОРМАЦИОННОГО ПОЛИМОРФИЗМА (SSCP) 69
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 71
3.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ К РИФАМПИЦИНУ У MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS 71
3.1.1. ХАРАКТЕРИСТИКА СПЕКТРА МУТАЦИЙ,
ОБУСЛАВЛИВАЮЩИХ УСТОЙЧИВОСТЬ К
РИФАМПИЦИНУ. 71
РАЗРАБОТКА УПРОЩЕННОЙ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МУТАЦИЙ УСТОЙЧИВОСТИ К РИФАМПИЦИНУ НА ОСНОВЕ КОНФОРМАЦИОННОГО ПОЛИМОРФИЗМА И АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АМПЛИФИКАЦИИ 73
ВЫЯВЛЕНИЕ ЗНАЧИМОСТИ РЕДКИХ МУТАЦИЙ 84
ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МУТАЦИЙ В ПЦР-ПРОДУКТАХ. 85
3.2. РАЗРАБОТКА ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ
ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ
ЧУМЫ И ИСПЫТАНИЕ СОЗДАННОЙ ТЕСТ-
СИСТЕМЫ НА КОЛЛЕКЦИОННЫХ ШТАММАХ 87
СОЗДАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ГНЕЗДОВОЙ ПЦР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ДНК VIBRIO CHOLERAE И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ АНАЛИЗА ВИРУЛЕНТНОСТИ ВИБРИОНОВ 90
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГНЕЗДОВОЙ ПЦР ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА ЧЕЛОВЕКА I И II ТИПА (HSVI HHSV2) 100
ИСПЫТАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ
7 ПЦР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА А..109
ВЫВОДЫ 126
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ Русские
АТФ (англ. АТР) -аденозиптрифосфорная кислота
ИФА - иммуноферментный анализ
МКК - монононуклеарные клетки крови
ПЦР - (англ. PCR)- полимеразная цепная реакция
Английские
А - аденин
АТР - аденозиптрифосфорная кислота
BLAST - Basic Local Alignment Search Tool (Базовый инструмент поиска сходства последовательностей, основанный на принципе локального сопоставления)
Ьр- нуклеотидная пара-пара комплементарных нуклеотидов, находящихся напротив друг друга в двух цепях ДНК
С-цитозин
CMV - цитомегаловирус
d АТР - дезоксиаденозинтрифосфорная кислота
dCTP - дезоксицитидинтрифосфорная кислота
dGTP — дезоксигуанозинтрифосфорная кислота
dTTP - дезокситимидинтрифосфорная кислота
EBV - вирус Энштейна-Барра
G-гуанин
HAV - вирус гепатита А
HBV - вирус гепатита В
I1HV6 - вирус герпеса типа VI
HI V-1 — вирус иммунодефицита человека типа I
HSV1 -вирус простого герпеса человека I тина
HSV2 - вирус простого герпеса человека II типа
HTLV-1 -Т-лимфотропный вирус человека типа I
HZV - вирус герпеса зостер
NCBI - National Center for Biotechnology Information (Государственный Центр Биотехнологической Информации, США)
RT-PCR - совмещенная реакция обратной транскрипции (RT)h ПЦР (PCR)
SDS - додецилсульфат натрия
SSCP - single-strand conformation polymorphism (конформацнонпый полиморфизм однонитевых фрагментов ДНК)
Т-тимин
Введение к работе
1. Актуальность проблемы.
Важнейшим элементом диагностики инфекционных болезней, бактерионосительства, санитарного контроля, экологического мониторинга окружающей среды является детекция инфекционного агента. Среди способов определения возбудителей главенствуют классический микробиологический и иммуноферментный методы. В последнее время в диагностике микрорганизмов применяют выявление специфического фрагмента нуклеотидной последовательности возбудителя, который можно идентифицировать, используя как индикатор его наличия, способность к воспроизведению in vitro в присутствии ДНК-полимеразы, праймеров и дезоксирибонуклеотидов. Этот процесс, подобный процессу естественной репликации хромосом и отличающийся от него исключительно быстрым экспоненциальным накоплением короткого фрагмента ДНК, называется полимеразной цепной реакцией (ПЦР) [104].
По чувствительности, быстроте, простоте и дешевизне ПЦР сопоставима с иммуноферментным анализом или даже превосходит его. В некоторых, случаях ПЦР оказывается предпочтительным или единственно возможным методом детекции возбудителя.
Актуальность представленной диссертационной работы обусловлена необходимостью повышения достоверности, чувствительности и скорости выявления возбудителей. Вариант метода ПЦР, называемый nested или гнездовой ПЦР, нацелен на исключение ошибочных реультатов и обладает повышенной чувствительностью. Суть гнездовой ПЦР заключается в проведеними двух последовательных реакций, при которых исходным материалом для второй реакции является продукт (ампликон) первой [166]. Так обеспечивается двойной контроль результата анализа, практически исключающий вероятность ошибки. Кроме этого, гнездовая ПЦР обладает дополнительным преимуществом. Оно состоит в том, что при использовании аллель-специфических праймеров во время второй реакции гнездовой ПЦР, благодаря структурной простоте матрицы,
становится возможным определение мутаций, удаленных от З'-конца праймера[114].
Создание новых методов тестирования, на наш взгляд, прежде всего необходимо для возбудителей пяти особо опасных или социально значимых инфекций - чумы, холеры, гепатита А, простого герпеса I и II типа (HSVI и HSVII), а также устойчивого к рифампицину Mycobacterium tuberculosis.
Например, выявление с помощью гнездовой ПЦР возбудителя чумы в тестируемом материале позволит своевременно применить экстренные меры профилактики и терапии [90].
Трудоемкость, длительность и относительно высокий риск ошибок при использовании на практике традиционного двухэтапного подхода, применяемого для обнаружения вирулентных штаммов Vibrio cholerae у больных, вибрионосителей, в объектах окружающей среды также делает гнездовую ПЦР предпочтительным методом анализа. В данном случае ПЦР позволяет идентифицировать возбудителя непосредственно в клиническом материале, прошедшем бактерицидную обработку, минуя стадию подращивания и клонирования этого опасного микроорганизма.
Нужно отметить, что для Mycobacterium tuberculosis характерен медленный рост на питательных средах. Это не позволяет своевременно выявить у пациентов лекарственноустойчивые штаммы, в частности, штаммы, устойчивые к рифампицину - одному из ведущих противотуберкулезных препаратов [173]. Возможной альтернативой остается определение мутаций, вызывающих устойчивость к лекарству. [8, 70, 146] Для определения таких мутаций необходим быстрый, недорогой и нетрудоемкий метод. В этом случае также может быть применена гнездовая ПЦР с использованием аллель-специфических праймеров, перекрывающих несколько мутанті і ых сайтов, дополненная методом конформационного полиморфизма ДНК (single-strand conformation polymorphism, SSCP).
Герпетическая инфекция человека — болезнь, дающая серьезные осложнения. При этом, патологические состояния, вызванные HSV I и
HSV II, неодинаковы по своим проявлениям и последствиям [2]. ПЦР позволяет проводить дифференциальную диагностику HSV I и HSV II, а ее гнездовой вариант- исключить ошибки при анализах.
Результаты, полученные при детекции вируса гепатита А в крови пациентов с помощью ИФА, требуют подтверждающего теста, который также может быть выполнен методом ПЦР.
Цель работы. Разработка и испытание методов гнездовой ПЦР и конформационного полиморфизма ДНК (SSCP) как инструментов детекции генов, специфичных для пяти возбудителей инфекционных болезней человека: чумы, холеры, туберкулеза, герпеса и вирусного гепатита А.
Задачи исследования.
Определить спектр мутаций устойчивости к рифампицину у штаммов Mycobacterium tuberculosis, циркулирующих в России, и разработать упрощенный метод определения данных мутаций на основе сочетания аллель-специфической амплификации и SSCP.
Разработать чувствительный и специфичный метод комбинированной гнездовой ПЦР и обратной транскрипции для детекции РНК вируса гепатита А. Сопоставить результаты, полученные методами ИФА и гнездовой ПЦР при анализе форменных элементов крови и сывороток у больных гепатитом А или смешанными формами гепатита.
Создать метод гнездовой ПЦР для дифференциальной диагностики вируса простого герпеса I и II типа и проверить его чувствительность и специфичность. Получить данные о распределении I и II типа вируса между различными клиническими группами больных и между различными типами материала, полученного от больных и носителей.
Разработать гнездовую ПЦР, направленную на непосредственную идентификацию гена, кодирующего фактор
вирулентности (энтеротоксин) V. cholerae, у больных,
вибрионосителей и в окружающей среде. 5. Разработать метод гнездовой ПЦР для определения У. pestis, не
дающий перекрестных реакций с У. enterocolitica и У.
pseudotuberculosis. Научная новизна. Научно обоснованы и апробированы методы гнездовой ПЦР с коллекционными штаммами yersinia pestis, Vibrio cholerae, рифампицин-резистентного Mycobacterium tuberculosis, HSV I и HSV II и вируса гепатита А, а также с образцами материала, инфицированного этими микроорганизмами.
Впервые определен спектр мутаций устойчивости к рифампицину в российских штаммах М. tuberculosis. При этом было зарегистрировано необычно высокое относительное количество мутаций в кодоне 516 гена гроВ и была открыта новая, не описанная в литературе двойная мутация.
Показано, что при идентификации точечных мутаций с помощью аллель-специфического праймера возможно определение единичных нуклеотидных замен, удаленных от 3'-конца праймера.
Создан оригинальный метод комбинированной аллель-специфической амплификации и SSCP, при котором единственный аллель-специфический праймер в одном эксперименте способен выявлять любую из шести мутаций, а в едином опыте SSCP можно выявлять любую из пяти других мутаций. Аналогичные подходы могут найти применение на других моделях.
Методом гнездовой ПЦР с обратной транскрипцией получены экспериментальные данные, касающиеся ассоциации вируса гепатита А с мононуклеарными клетками крови, что расширяет возможности выявления этого вируса у человека в случае отрицательного результата при анализе сыворотки пациента.
Выявлена более высокая способность HSVI проникать в различные органы и ткани, сравнительно с HSVII.
Практическая значимость работы. Разработка быстрого,
экономичного метода определения устойчивости к рифампицину в культурах M.tuberculosis, выделенных от больных, позволяет применять адекватные подходы к лечению больных. Метод обеспечивает значительное сокращение срока анализа, если в качестве исходного материала используют чистые культуры возбудителя, выращенные на питательной среде, поскольку отпадает необходимость пересева этих культур на среду, содержащую рифампицин, и последующего ожидания результата в течение нескольких недель или месяцев.
Созданные методы гнездовой ГТЦР позволяют повысить достоверность и чувствительность выявления Y. pestis, V. choleraey HSVI и HSVII, вируса гепатита А в инфицированном материале различного происхождения. Этот метод позволяет проводить анализы с инактивированными возбудителями, не представляющими угрозы для здоровья человека, что очень важно при работе с возбудителями особо опасных инфекций. При этом сокращаются сроки выполнения анализов.
В случае V. cholerae выбор непосредственного фактора вирулентности как мишени для амплификации выгодно отличает разработанный нами подход от применяемых в настоящее время иммуноферментных и микробиологических тестов, имеющих косвенный характер.
Обнаружено, что, в отличие от мазков из урогенитального тракта и клеточного материала мочи, соскобы из урогенитального тракта дают наиболее полную и объективную информацию о совместном присутствии вирусов HSVI и HSV II у больных с диагнозом «герпетическая инфекция».
Высокая чувствительность метода гнездовой ПЦР позволяет проводить поиск возможной аккумуляции вируса гепатита А во фракции мононуклеарных клеток крови при отсутствии возбудителя в сыворотках.
В случае гепатита А и герпеса практическая ценность разработанных методов, в значительной мере, заключается в возможности использовать их как дополнительный тест, подтверждающий результаты ИФА.
Положения, выносимые на защиту.
Разработан оригинальный метод детекции мутаций устойчивости к рифампицину у Mycobacterium tuberculosis с применением подходов, не предполагающих секвенирования ДНК.
Созданы методы гнездовой ПЦР, имеющие преимущества сравнительно с одноступенчатой ПЦР, для тестирования возбудителей простого герпеса I и II типа, холеры, чумы и гепатита А.
Гнездовая ПЦР может быть использована при лабораторной диагностике для обнаружения в клиническом материале РНК вируса гепатита Л, ДНК вирусов герпеса и возбудителя холеры.
![Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс]](/i/i/4289/212277.png "Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс] Тучков Игорь Витальевич")
