Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы стр. 12
1.1. Краткая справка о лептоспирозе стр. 12
1.2. Инфицированность собак лептоспирозом в мире стр. 18
1.3. Этиология и эпизоотология лептоспироза собак стр. 19
1.4. Роль собаки как источника возбудителей лептоспироза в эпидемическом и эпизоотическом процессах стр. 24
1.5. Клиническая картина лептоспироза собак стр. 28
1.6. Методы диагностики лептоспироза стр. 32
1.7. Реакция латекс-агглютинации в диагностике инфекционных заболеваний и обзор латексных диагностикумов стр. 36
ГЛАВА II. Объекты и методы исследования стр. 41
2.0. Материалы, методы исследований и место выполнения работы стр. 41
2.1. Характеристика используемых штаммов лептоспир и их культивирование стр. 41
2.2. Получение противолептоспирозных гипериммунных сывороток стр. 42
2.3. Выделение иммуноглобулинов при помощи ПЭГ-4000 и ПЭГ-
6000 стр. 43
2.4. Выделение иммуноглобулинов при помощи ионообменной хроматографии стр. 44
2.5. Идентификация иммуноглобулинов в иммуноэлектрофорезе стр. 45
2.6. Сенсибилизация полимерных латексных носителей стр. 46
2.7. Постановка и учёт результатов реакции латекс-агглютинации стр. 48
2.8. Определение стабильности, специфичности и чувствительности АЛД с культурами лептоспир стр. 48
2.9. Животные, используемые в исследованиях стр. 50
2.10. Экспериментальное инфицирование белых мышей стр. 50
2.11. Экспериментальное инфицирование золотистых хомячков стр. 51
2.12. Экспериментальное инфицирование собак и исследование биоматериала стр. 52
2.13. Клинические испытания и методика расчета значимости тест-системы в диагностике лептоспироза собак стр. 54
ГЛАВА III. Результаты исследования стр.57
3.1. Выделение и очистка противолептоспирозных иммуноглобулинов и определение их иммунохимической чистоты стр. 57
3.2. Определение оптимальных условий сенсибилизации ПЛН полученными иммуноглобулинами стр. 63
3.2.1. Определение стабильности ПЛН в электролитах стр. 63
3.2.2. Определение оптимальной концентрация карбодиимида...стр. 66
3.3. Результаты определения чувствительности, стабильности и специфичности АЛД с культурами лептоспир стр. 69
3.4. Результаты испытаний АЛД с вакцинным препаратом, содержащим лептоспирозный компонент стр. 73
3.5. Результаты испытаний АЛД с экспериментально инфицированной лептоспирами кровью и мочой собак стр. 75
3.6. Результаты испытаний АЛД с образцами биоматериала от инфицированных животных стр. 76
3.6.1. Результаты испытаний АЛД с кровью экспериментально инфицированных мышей стр. 76
3.6.2. Результаты испытаний АЛД на моделях экспериментально инфицированных собак стр. 78
3.6.3. Клинические проявления лептоспироза у экспериментально инфицированных собак стр. 79
3.6.4. Результаты испытаний АЛД с кровью экспериментально инфицированных собак стр. 81
3.6.5. Результаты исследования гематологических показателей крови экспериментально инфицированных собак стр. 84
3.6.6. Концентрация иммуноглобулинов в сыворотке крови экспериментально инфицированных собак стр. 88
3.6.7. Результаты клинических испытаний и расчёта значимости тест-системы в диагностике лептоспироза собак стр. 89
ГЛАВА IV. Обсуждение результатов стр.93
ГЛАВА V. Выводы стр. 103
ГЛАВА VI. Список использованной литературы стр. 105
ГЛАВА VII. Приложения
- Краткая справка о лептоспирозе
- Материалы, методы исследований и место выполнения работы
- Выделение и очистка противолептоспирозных иммуноглобулинов и определение их иммунохимической чистоты
- Концентрация иммуноглобулинов в сыворотке крови экспериментально инфицированных собак
Введение к работе
Собака - друг человека. По данным ООН в настоящее время в мире насчитывается более 500 миллионов собак, большинство из которых живет среди людей. В связи с этим возрастает опасность распространения заболеваний, общих для человека и собак. К таким болезням относят и лептоспироз, который является одной из наиболее распространенных зооантропонозных, природно-очаговых инфекций, поражающих домашних, диких и сельскохозяйственных животных, а так же человека.
Лептоспирозная инфекция широко распространена среди домашних собак. На территории нашей страны у 27,9% этих животных установлена инфицированность лептоспирами. Среди них ведущее место принадлежит лептоспирам серогруппы Canicola (86.5%) и Icterohaemorrhagiae (12,3%), значительно реже от собак выделяют лептоспиры серогрупп Pomona, Tarassovi, Javanica и Grippotyphosa (Ю.Г.Малахов и др., 1992, 2001).
Клинический полиморфизм и особенности биологии и антигенной структуры лептоспир, представленных более чем 200 серологическими вариантами и объединенными в 23 серологические группы, создают определенные трудности в диагностике лептоспирозной инфекции. Помимо этого, данное заболевание у собак имеет сходную клиническую картину с пироплазмозом, гепатитами, нефритами, различными патологиями ЖКТ, может протекать бессимптомно или латентно и лишь появление выкидышей и мертворожденного потомства может служить указанием на лептоспироз. Поэтому при лептоспирозе нередки диагностические ошибки и только ссылки на историю болезни и соответствующую эпизоотическую обстановку могут в определенной степени ориентировать ветеринарного врача.
Следует подчеркнуть, что ещё не до конца выяснены вопросы диагностики и клинического проявления стертых форм лептоспироза и лептоспироносительства, лечения и санации организма собак от лептоспир. До сих пор основные исследования ориентированы на сельскохозяйственных животных, имеющих промышленное значение, а исследования в области изучения заболеваемости мелких домашних животных недостаточны. Особое значение диагностика лептоспироза собак приобретает в период, когда в городах появляется тенденция к увеличению их количества.
Из лабораторных методов диагностики лептоспирозной инфекции до настоящего времени приоритетными являются бактериологический и серологический. Однако выделение культуры лептоспир требует длительного времени проведения (до 3-х месяцев) в связи с медленным размножением (время генерации лептоспир составляет 13-14 часов) (В.С.Киктенко, 1971) и определенных навыков работы, т.к. контроль за размножением и идентификация возбудителей до серогруппы проводится в реакции перекрёстной микроагглютинации (Ю.Г.Чернуха, Ю.В.Ананьина и др., 1987; S.Faine, 1982), результаты которой учитываются в темном поле зрения микроскопа.
Обнаружение антител в сыворотке крови инфицированных животных в РМА является поздним методом диагностики и представляет интерес лишь в случае ретроспективного анализа, поскольку увеличение титров происходит только через 1-2 недели после заражения (Ю.Г.Чернуха, Ю.В.Ананьина и др., 1987). Помимо этого для серологической диагностики лептоспироза требуется поддержание набора живых эталонных культур лептоспир, что не всегда возможно в условиях стандартной лаборатории.
В связи с этим большую актуальность представляет вопрос совершенствования и создания новых методов диагностики лептоспироза у собак. Эти методы должны обеспечить экспресс-диагностику заболевания, достоверное выявление больных животных и животных носителей, а так же быть доступными для широкой практики.
К числу таких методов относится реакция латекс-агглютинации (РЛА). Диагностические препараты, созданные на основе полимерных латексных носителей (ПЛН), находят широкое применение в диагностике различных заболеваний с целью обнаружения антител (Ат) или антигенов (Аг) в различных субстратах.
В ряде стран осуществляется коммерческий выпуск латексных диагностикумов. Известны диагностические препараты, созданные на основе ПЛН для индикации в РЛА возбудителей эшерихиоза (Sam W.C.,1992), стрептококкоза (Ajello G.W. et al., 1987), стафилококковой инфекции (Shumacher-Perdreau F. Et. al, 1987), синегнойной инфекции (Анциферова Н.Г. с соавт., 1986) и др.
Относительно низкая стоимость анализа, простота и быстрота выполнения, точность и визуальный учёт результатов делают РЛА незаменимой в качестве экспресс-метода индикации микроорганизмов.
Цель исследования.
Разработка диагностической тест-системы на основе антительных латексных диагностикумов (АЛД) для быстрого обнаружения антигенов лептоспир и одновременно установления их серогрупповой принадлежности.
Основные задачи исследования.
Изыскать оптимальные условия и режимы приготовления АЛД, обеспечивающие высокую активность, чувствительность, специфичность и стабильность тест-системы;
Разработать тест-систему на основе АЛД для диагностики лептоспирозной инфекции у собак, вызванной лептоспирам серогрупп Canicola и Icterohaemorrhagiae;
Оценить разработанную тест-систему с целью возможности обнаружения лептоспир и их антигенов в культурах микроорганизмов и биологических жидкостях инфицированных животных;
Дать оценку эффективности тест-систем в условиях клинических испытаний для диагностики спонтанного лептоспироза у собак.
Научная новизна.
Отработаны условия ковалентного связывания
противолептоспирозных IgG с карбоксильными функциональными группами полистирольных ПЛН, активированных водорастворимым карбодиимидом (ВРК).
Впервые на основе данной методики получена чувствительная и стабильная диагностическая тест-система для обнаружения антигенов лептоспир непосредственно в биологических жидкостях животных и одновременного установления серогрупповой принадлежности возбудителей, не прибегая к использованию стандартных и трудоемких методов.
В условиях эксперимента показана возможность выявления антигенов лептоспир в первые дни инфекционного процесса, что наряду с простотой постановки РЛА и быстротой получения
результатов (5 мин), позволяет рекомендовать использование этой тест-системы для ранней диагностики лептоспироза.
Практическая значимость.
На разработанную диагностическую тест-систему для выявления антигенов лептоспир Российским агентством по патентам и товарным знакам выдан Патент на изобретение №2177617 от 27.12.2001 по заявке № 2000113121/14(01413) от 29.05.2000.
Комиссионные испытания в ГУ Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории подтвердили целесообразность использования данной тест-системы для экспресс-диагностики лептоспироза собак в практике ветеринарных лабораторий.
На базе фирмы ЗАО «Научно-производственный ветеринарный
звероводческий центр» выпущена опытная партия тест-системы,
которая успешно применена в технологических целях при
изготовлении поливалентной вакцины, содержащей
лептоспирозный компонент.
Результаты проведённых исследований используются в ходе лабораторных занятиях со студентами медицинского факультета РУДН по теме «Патогенные спирохеты».
Положения, выносимые на защиту. 1. Использование в работе метода сенсибилизации ПЛН противолептоспирозными иммуноглобулинами путём ковалентного связывания аминогрупп иммуноглобулинов с карбоксильными функциональными группами на поверхности частиц ПЛН, активированными водорастворимым карбодиимидом, позволяет получить антительный латексный диагностикум максимальной активности.
2. На основе полимерных латексных носителей разработана тест-
система для диагностики лептоспирозной инфекции у собак,
вызванной спирохетами вида L.interrogans серогрупп Canicola и
Icterohaemorrhagiae.
3. Приготовленная латексная тест-система обладает высокой
чувствительностью, стабильностью, серогрупповой
специфичностью и позволяет выявлять лептоспиры гомологичных
серогрупп в исследуемом материале в количестве 106 микробных
кл/мл и более. Показана возможность использования латексной
тест-системы в технологических целях при изготовлении вакцин.
Апробация диссертационного материала.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на
Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-
летию Всероссийского научно-исследовательского и
технологического института биологической промышленности,
Щелково, 2000; на Всероссийской научной конференции
«Биомедицинские технологии», Москва, в 2000, 2001, 2003 годах; на
семинарах кафедры микробиологии медицинского факультета
РУДН, Москва, 2000, 2001; на VI Международном Ветеринарном
Иммунологическом Симпозиуме (International Veterinary Immunology
Symposium), Uppsala, Sweeden, 2001; а так же на ежегодной
конференции Общества Клинических Микробиологов (The Society of
Clinical Microbiologists) Национального Университета Ирландии
(National University of Ireland), Galway, 2002.
По результатам исследований опубликовано 9 научных работ и получен патент на изобретение.
Структура и объем работы.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трёх глав собственных исследований: объектов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, а так же выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 122 странице печатного текста, включает 11 таблиц и 9 рисунков. Список использованной литературы включает 176 наименований, из них 77 - иностранных авторов.
Краткая справка о лептоспирозе
Первые сведения о лептоспирозе как о самостоятельной нозологической форме появились в конце XIX века, когда клиницисты стали выделять лептоспирозную желтуху, как наиболее тяжело протекающую, из общей группы желтух. В 1886 году немецкий врач Вейль, а в 1889 году и наш соотечественник, ученик С.П.Боткина - Н.П.Васильев описали это заболевание как самостоятельное. С их именами связано одно из названий болезни - «болезнь Вейля-Васильева».
В 191 5 году японские микробиологи Инада, Идо, Хоки, Канеко и Ито из крови больных людей изолировали возбудителя, названного ими Spirohaeta icterohaemorrhagiae (рис. 1).
В 1918 г. известный специалист в области спирохетозов профессор Ногуши установил своеобразие этого микроорганизма и выделил его в самостоятельный род семейства спирохет под названием Leptospira (греч. -тонкая спираль).
В 1983 г. Международный комитет по таксономии лептоспир и спирохет выделил лептоспиры в самостоятельное семейство Leptospiraceae в порядке Spirochaetalis. По признаку патогенности и другим биологическим свойствам род Leptospira делят на 2 вида:
1) сапрофитные лептоспиры - L.biflexa, свободноживущие, впервые обнаруженные в воде Волбах и Бингер в 1914 и являющиеся типичными обитателями влажных почв, различных водоёмов и болотистой местности;
2) патогенные лептоспиры - L.interrogans, паразитирующие в организмах человека и других позвоночных, обнаруженные Инада, Идо.
Эти виды не являются моноспецифичными и на основании различий в антигенной структуре внутри каждого из них выделяют серологические варианты, которые далее объединяют в серогруппы. Патогенные лептоспиры представлены более чем 220 серологическими вариантами, включёнными в 23 серологические группы, а сапрофитные - более чем 60 сероварами и 38 серогруппами.
Многолетние труды лептоспирологов многих стран мира показали, что патогенные и сапрофитные лептоспиры не различаются по морфологии, ультраструктуре, тинкториальным свойствам, способам движения и размножения. Они относятся к хемоорганотрофам, а по отношению к кислороду являются микроаэрофилами.
В последние годы получило развитие новое молекулярно-генетическое направление в изучении лептоспир.
Данные о степени подобия (процент гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК) оказались достаточно информативными и позволили ввести в видовую дифференциацию лептоспир новый термин - геномовид. Так, на основании исследований по гибридизации ДНК предложена новая внутривидовая геносистематика лептоспир, базирующаяся на современной концепции, согласно которой в один вид объединяют штаммы с ДНК-ДНК гомологией 70% и выше. Выделено 7 геномовидов у паразитических лептоспир и 3 у сапрофитных.
Следует подчеркнуть, что предложенная геносистематика не коррелирует с традиционной серологической классификацией лептоспир, основанной на антигенных различиях.
Особенно важным для дифференциации и изучения патогенных лептоспир является выявление у них факторов патогенности. Патогенные виды лептоспир обладают мощными инвазивными свойствами (спиралевидной конфигурацией, активной штопорообразной подвижностью, продукцией ферментов проникновения - гиалуронидазы, фибринолизина, плазмогоагулазы и др.) и цитоадгезивностью, что позволяет им пенетрировать слизистые оболочки, ткани, экстрацеллюлярный матрикс, прикрепляться к клеткам и персистировать в макроорганизме (Е.Г.Волина и др., 2002).
Безусловным критерием патогенности является вирулентность. Установлено, что вирулентные штаммы лептоспир способны в течение 20 минут проникать в Vero-клетки и моноцито-макрофагально подобные клетки, вызывая в последних индукцию запрограммированной гибели (апоптоз), что обеспечивает им способность выживать в организме хозяина и избегать иммунного ответа (R.Johnson, 1976).
Материалы, методы исследований и место выполнения работы
Для получения антисывороток к лептоспирам серогрупп Canicola и Icterohaemorrhagiae иммунизировали 10 кроликов породы Шиншилла одного пола и возраста с живой массой 2,5-3,0 кг. В процессе работы нами использовалась схема иммунизации кроликов предложенная Yanagawa R. (Yanagawa R. et al., 1974). Культуры лептоспир серогруппы Canicola штамм Каширский и серогруппы Icterohaemorrhagiae штамм М-20 с количеством бактериальных клеток 1,2x107 кл/мл вводили внутривенно в количестве 1 мл 5 раз с недельным интервалом. Через 10 суток после последней инъекции проводили тотальное обескровливание животных.
Такая схема иммунизации была выбрана нами для получения гипериммунных сывороток с максимальным содержанием IgG.
Контроль активности антисывороток определяли в реакции микроагглютинации. Контроль специфичности осуществляли в иммуноэлектрофорезе.
Осаждение иммуноглобулинов проводили путем добавления в полученные противолептоспирозные сыворотки 12% водорастворимого полимера - полиэтиленгликоля (ПЭГ) (polyethylenglycol, "Sigma" США) различной молекулярной массы: ПЭГ-4000 (м.м.4000) или ПЭГ-6000 (м.м.6000). После полного растворения полиэтиленгликоля смесь инкубировали при 4С в течение 10 часов. Препараты центрифугировали при 3000 об/мин 10-15 минут, надосадок удаляли. Затем осадок ресуспендировали в физиологическом растворе, доводя общий объем до первоначального, и проводили диализ полученных препаратов против физиологического раствора (Г. Фримель, 1987). После чего в препаратах определяли концентрацию белка, осуществляли контроль активности в реакции микроагглютинации и использовали в дальнейшем для сенсибилизации ими полимерных латексных носителей.
На первом этапе для осаждения глобулинов к сывороткам добавляли раствор сульфата аммония ((NH4)2S04) до конечной концентрации, равной 40%. Смесь выдерживали в течение 1 часа при температуре 2-4С, затем центрифугировали при 8000 об/мин в течение 30 минут. Осажденные белки растворяли в 0,02 М калий-фосфатном буфере (рН 7,4) в объеме, равном объему удаленного надосадка, диализовали против этого же буфера в течение 24 часов и центрифугировали в режиме аналогичном предыдущему.
Дальнейшую очистку полученного препарата и разделение иммуноглобулинов на изотипы проводили методом ионообменной хроматографии на колонке с анионообменником DEAE-Sepharosae CL-6B ("Pharmacia" Швеция) со ступенчатым градиентом NaCI. Во всех случаях использовали приборы для стандартной жидкостной хроматографии ("LKB" Швеция).
Для разделения иммуноглобулинов использовали колонку размером 1x12 см, заполненную DEAE-Sepharosae CL-6B и уравновешенную 0,02 М калий-фосфатным буфером (рН 7,4). Элюцию проводили, используя ступенчатый (0-50-100-150-250-400 тМ) градиент NaCI со скоростью 36 мл/час. Полученный в процессе очистки элюат собирали по фракциям с помощью автоматического коллектора, концентрировали полиэтиленгликолем (м.м.20000), определяли концентрацию белка и исследовали в иммуноэлектрофорезе (Г. Фримель, 1987).
Выделение и очистка противолептоспирозных иммуноглобулинов и определение их иммунохимической чистоты
В работе мы использовали три способа выделения и очистки иммуноглобулинов, применяя комбинации различных методов: осаждение при помощи водорастворимых полиэтиленгликолей различной молекулярной массы (ПЭГ-4000 и ПЭГ-6000) и ионообменную хроматографию, для которой мы использовали слабый анионообменник DEAE-Sepharosae CL-6B. Этот гель обладает химической стойкостью, термостабильностью и высокой разрешающей способностью, обеспечивая эффективное разделение смеси белков без их денатурации.
Схема выделения представлена на рисунке 2. Использование метода ионообменной хроматографии позволило разделить белки гипериммунных сывороток кроликов на фракции.
На рисунке 3 изображен профиль нанесения и элюции белков сыворотки крови кролика, гипериммунизированного штаммом Каширский (серогруппа Canicola) на колонке с анионообменником DEAE-Sepharosae CL-6B и ступенчатым (0-50-100-150-250-400 тМ) градиентом NaCI. В качестве стартового буфера использован 0,02 М калий-фосфатный буфер рН 7.4, объем колонки 12 см3, скорость элюции 36 мл/час. Стрелками обозначено внесение различных концентраций соли, растворенных в стартовом буфере. Всего получено 7 пиков.
На рисунке 4 изображен профиль элюции белков сыворотки крови кролика, гипериммунизированного штаммом М-20 (серогруппа Icterohaemorrhagiae). Стрелками обозначено внесение различных концентраций соли, растворенных в стартовом буфере. Получено 6 пиков.
Фракции, полученные в процессе хроматографической очистки, анализировали методом иммуноэлектрофореза (ИЭФ) с использованием антисыворотки к белкам крови кроликов.
Учет реакции проводили по наличию и месторасположению дуг преципитации. При этом учитывали тот факт, что все изотипы иммуноглобулинов различаются по своей электрофоретической подвижности и в ИЭФ после взаимодействия с антиглобулиновыми антителами к белкам сыворотки крови кроликов образуют линии преципитации различной формы и месторасположения, позволяющие определить классовую принадлежность выделенных иммуноглобулиновых фракций.
При анализе фракций отбирали те, которые давали дугу преципитации с указанными антисыворотками в области миграции, характерной для IgG и IgM (рис. 5).
Анализ проведенных исследований позволил идентифицировать выделенные белки как иммунохимически чистые IgG и IgM и заключить, что при хроматографии белков сыворотки крови кролика, гипериммунизированного штаммом Каширский (серогруппа Canicola) на анионообменнике DEAE-Sepharosae со ступенчатым градиентом концентрации NaCI, иммунохимически чистый IgG находится в восходящей части 1 пика (фракция 0). Препараты, обогащенные IgG и субизотипами IgG элюируются в градиенте концентрации соли 0-150 тМ - 2 и 3 пики (фракции 00, I и II), IgM находится в градиенте концентрации элюирующего раствора 250 тМ NaCI - 4 пик (фракция 2).
При ИЭФ анализе результатов ионообменной хроматографии белков сыворотки крови кролика, гипериммунизированного штаммом М-20 (серогруппа Icterohaemorrhagiae), было установлено,
Сравнительный иммуноэлектрофоретический анализ IgM и IgG фракций, полученных в процессе хроматографическои очистки противолептоспирозных иммуноглобулинов из гипериммунной сыворотки кролика что иммунохимически чистый IgG находится в восходящей части 1 пика (фракция 0), препараты, обогащенные IgG и субизотипами IgG элюируются в градиенте концентрации соли 0-150 глМ - 2 пик (фракции 00 и I), IgM находится в градиенте концентрации элюирующего раствора 250 mM NaCI - 3 пик (фракция 2).
Таким образом, в результате проведенной работы нами были получены хроматографически выделенные иммунохимически чистые препараты противолептоспирозных IgG и IgM, а так же препараты, содержащие смесь противолептоспирозных иммуноглобулинов этих изотипов, осаждённые при помощи ПЭГ (Г. Фримель, 1987).
Во всех полученных препаратах было определено содержание в них белка по Лоури и установлена их специфичность к гомологичным лептоспирам в стандартной РМА (табл. 2). Полученные препараты иммуноглобулинов до использования хранили при температуре -20С.
Концентрация иммуноглобулинов в сыворотке крови экспериментально инфицированных собак
С целью определения возможности использования разработанных АЛД для обнаружения антигенов лептоспир в образцах биоматериала от собак, производили искусственное инфицирование крови и мочи живыми лептоспирами с последующим исследованием образцов в РЛА.
Для этого к образцу мочи или гепаринизированной крови добавляли равный объём культуры лептоспир с содержанием 5x107 кл/мл. Инфицированный таким образом образец крови исследовали в РЛА по общепринятой методике. Контролем служил образец неинфицированной гепаринизированной крови.
Для исследования искусственно инфицированной мочи образец центрифугировали (1500 об/мин, 5 мин), надосадок удаляли, а к осадку добавляли 5-10% водно-сывороточную среду для лептоспир в объёме равном удалённому надосадку, после чего поводили тестирование образца в РЛА.
Полученные в результате испытаний результаты свидетельствуют о том, что компоненты крови собак не оказывают влияния на течение РЛА, однако для исследования мочи собак в РЛА необходимо изменение кислотного показателя среды реакции до рН 7,2-7,4.
Параметры чувствительности и специфичности АЛД, полученные в экспериментах с культурами лептоспир и с экспериментально инфицированной лептоспирами кровью и мочой, позволили перейти к испытаниям диагностикумов с образцами биоматериала от инфицированных животных.
На данном этапе качество работы АЛД оценивали постановкой РЛА с кровью мышей, экспериментально инфицированных лептоспирами серогрупп Canicola и Icterohaemorrhagiae через определённый интервал времени. Контролем служил метод выделения гемокультуры. Все опыты ставили не менее чем в двух повторностях. Полученные результаты представлены в таблице 7.
Как следует из таблицы при исследовании мышей, инфицированных лептоспирами серогруппы Canicola, через 30 минут после введения культуры результаты РЛА с АЛД анти-Canicola и результаты посева на питательную среду были отрицательными. Вероятно, этого вызвано недостаточностью времени для проникновения лептоспир этой серогруппы в кровь животного.
В более поздние сроки после инфицирования: через 90, 120 и 150 минут результаты РЛА и результаты метода выделения гемокультуры были уже положительными.
В случае инфицирования белых мышей лептоспирами серогруппы Icterohaemorrhagiae РЛА с АЛД анти-lcterohaemorrhagiae была положительной уже через 30 минут после введения лептоспир. Результаты посева крови от этих мышей на питательную среду подтвердили данные РЛА, но рост культуры был отмечен только через 10 дней. Вероятно, это связано с тем, что через 30 минут в кровь проникло очень небольшое количество лептоспир.
Исследования крови мышей, инфицированных лептоспирами Icterohaemorrhagiae в более поздние сроки в РЛА (90, 120, 150 минут), показали результаты аналогичные тем, которые были получены при инфицировании мышей лептоспирами серогруппы Canicola.
Перекрёстных реакций выявлено не было. Результаты РЛА с кровью неинфицированной мыши были всегда отрицательными.
Следует подчеркнуть, что у инфицированных лептоспирами мышей при помощи тест-системы за несколько минут было не только установлено присутствие антигена лептоспир, но и определена его серогрупповая принадлежность, в то время как на питательной среде рост лептоспир из крови заражённых мышей был обнаружен лишь через 4-Ю дней, а для установления серогруппы выросшей культуры было необходимо проведение перекрёстной РМА.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о высокой чувствительности и специфичности разработанного АЛД для обнаружения антигенов лептоспир серогрупп Canicola и Icterohaemorrhagiae в крови инфицированных белых мышей.
