Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Классификация представителей родаВгисеІІа 12
1.2. Антигены бруцелл в связи с их диагностическим значением 15
1.3. Методы лабораторной диагностики бруцеллеза... 30
1.4. Иммунохимические методы с использованием мембранных подложек
1.5. Коллоидные металлы в конструировании диагностических тест систем
ГЛАВА 2. Материалы и методы 71
2.1. Штаммы микроорганизмов 71
2.2. Диагностический материал ... 71
2.3. Микробиологические методы 72
2.4. Препаративные методы 74
2.5. Химические и физико-химические методы 77
2.6. Иммунохимические методы. ... ..~ 78
2.7. Серологические методы — 80
2.8. Статистическая обработка результатов 80
ГЛАВА 3. Получение и характеристика поверхностных антигенных фракций бруцелл и специфических антител 81
3.1. Выделение, очистка и характеристика физико-химических и R. биологических свойств поверхностных антигенных фракций бруцелл
3.2. Получение высокоактивных противобруцеллезных сывороток для конструирования твердофазных иммунохимических тест-систем
ГЛАВА 4. Методические приемы конструирования иммуноферментных тест-систем ... ... 108
4.1. Иммуноферментный метод обнаружения антигенов S-бруцелл . 108
4.2. Сравнительная характеристика испытанных вариантов ИФА при обнаружении антигенов S-бруцелл 117
4.3. Применение иммунопероксидазного метода для обнаружения антигенов R-бруцелл ... — 122
4.4. Разработка ИФА для одновременного обнаружения антигенов S-и R-бруцелл — 123
4.5. Обнаружение противобруцеллезных антител с помощью непрямого варианта ИФА . 124
4.6. Апробация ИФА при исследовании полевого и клинического материала ... 125
ГЛАВА 5. Иммуноэритроадсорбционный метод обнаружения антигенов бруцелл и антител к ним 129
5.1. Конструированче ИЭАМ для обнаружения антигенов S-бруцелл 129
5.2. Использование ИЭАМ для выявления антигенов R-бруцелл 136
5.3. Апробация конъюгата IgG=C3-rA в качестве антительного
эритроцитарного диагностикума для РПГА „... 137
5.4. Апробация ИЭАМ при исследовании клинического и полевого
материала 138
ГЛАВА 6. Теоретические и практические основы разработки диагностических тест-систем с использованием в качестве маркера иммунных реагентов частиц коллоидного золота 139
6.1. Разработка дот-иммуноанализа для выявления антигенов бруцелл с помощью конъюгата IgG=K3 . ... 139
6.2 Разработка дот-иммуноанализа с конъюгатом стафилококковый белок А=КЗ для обнаружения Аг бруцелл 152
6.3. Дот-иммуноанализ с конъюгатом Аг=КЗ для выявления проти-вобруцеллезных антител 154
6.4. Апробация дот-иммуноанализа при исследовании клинического материала на бруцеллез 156
ГЛАВА 7. Дот-иммуноанализ с частицами коллоидного серебра для обнаружения антигенов бруцелл и антител кним . 158
7.1. Теоретические и методические основы использования коллоидного серебра в качестве маркера иммунных реагентов 158
7.2. Разработка дот-иммуноанализа для обнаружения антигенов бруцелл . . ' 163
7.3. Разработка дот-иммуноанализа для обнаружения противобру-целлезных антител 168
7.4. Дот-иммуноанализ для обнаружения антител против бруцелл в L-форме — 173
7.5. Апробация дот-иммуноанализа при исследовании клинического
материала на бруцеллез — 173
ГЛАВА 8. Дот-иммуноанализ с частицами углерода для обнаружения противобруцеллезных антител ... 178
8.1. Конструирование диагностикума для обнаружения антител на основе антигена, меченного активированным углем ... 178
8.2. Дот-иммуноанализ с угольным диагностикумом при исследовании кроличьих сывороток на бруцеллез 182
Заключение 185
Выводы „ 201
Цитированная литература
- Классификация представителей родаВгисеІІа
- Штаммы микроорганизмов
- Выделение, очистка и характеристика физико-химических и R. биологических свойств поверхностных антигенных фракций бруцелл
- Конструированче ИЭАМ для обнаружения антигенов S-бруцелл
Введение к работе
Актуальность проблемы. Бруцеллез - одно из наиболее опасных инфекционных заболеваний человека и животных - выявлен на всех обитаемых континентах земли (Corbel M.J., 1997). Тревожным свидетельством глобального распространения этой болезни стало обнаружение в последние годы естественно инфицированных возбудителем бруцеллеза морских животных - китов, дельфинов, тюленей и других (Foster G. et al., 1996; Jahans K.L. et al., 1997; Cloeckaert A. et al., 2000). В бывшем СССР и России заболевания людей и животных бруцеллезом зарегистрированы практически во всех регионах (Калиновский А.И. и др., 2001; Таран И.Ф., Лямкин Г.И., 1996). В последние годы серьезное внимание уделяется возбудителю бруцеллеза как возможному эффективному средству биологического терроризма (Kortepeter M.G., Parker G.W., 1999; Zoon К.С., 1999).
Полигостальность бруцеллеза, полиморфизм возбудителя, хроническое, часто бессимптомное течение болезни у животных и разнообразие клинических проявлений у людей делают его трудно диагностируемым, что отражается негативно на своевременности начала и, следовательно, - качестве лечения больных..
Серьезную проблему при проведении лабораторной диагностики бруцеллеза представляет факт сходства некоторых антигенов бруцелл, ряда других патогенных и сапрофитных микроорганизмов и даже органов и тканей человека и животных (Ефременко В.И. и др., 2001; Paulsen I.T. et al., 2002). Спектр и структура перекрестно реагирующих Аг, особенно локализованных на поверхности клетки и в силу этого определяющих особенности как специфического, так и неспецифического взаимодействия, нуждаются в дальнейшем изучении. Актуальна проблема изыскания надежных критериев оценки выраженности и значения перекрестных реакций, а также поиск способов их минимизации.
Основным методом лабораторного подтверждения диагноза бруцеллеза человека и животных на протяжении многих лет является серологическое обследование, предусматривающее постановку в разных сочетаниях РХ, РА, РБТ, КТ, РПГА, РСК или РДСК, РК, которые могут быть дополнены РИД, непрямой ИФТ (Объединенный комитет экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу, 1986).
Однако традиционные методы лабораторной диагностики бруцеллеза, используемые в практическом здравоохранении и ветеринарии, не всегда в достаточной мере чувствительны, специфичны, экспрессны, информативны. В связи с этим актуален поиск альтернативных тест-систем, сконструированных на иных принципах, но, тем не менее, обеспечивающих специфичность, достаточно высокую чувствительность и в то же время - технологичность изготовления диагностикумов, доступность ингредиентов, простоту постановки реакции, оперативность получения результатов и их информативность. Предложенная в последние годы для диагностики бруцеллеза ПЦР (Шестопалов М.Ю. и др., 1997;
Балахонов СВ., 2000) во многом соответствует этим критериям, но, к сожалению, может быть реализована лишь в хорошо оснащенных лабораториях.
В 70-80-х годах прошлого столетия внимание привлекла идея использования иммунохимических методов обнаружения Аг возбудителя бруцеллеза и Ат к ним. В числе первых из них стали ИФА (Голубинский Е.П. и др., 1982; Меринов СП. и др., 1984; Carlson Н.Е. et al., 1976; Hurvell В., 1978) и ДИА (Roop R.M. et al., 1987; Chand P. et al., 1989).
Важной тенденцией в диагностической медицине в последнее время является внедрение в практику методов анализа "доктор-офис", позволяющих без значительных затрат на приобретение оборудования и обучение персонала получать информацию в кабинете врача, в домашних или полевых условиях.
В связи с этим остаются актуальными задачи формулирования основных принципов конструирования и применения альтернативных агглютинационным твердофазных тест-систем, подбора наиболее подходящих для них иммуносорбентов, эффективных иммуно-реагентов и маркеров.
Цель исследования - разработка методологических подходов к конструированию твердофазных иммунохимических тест-систем и оценка пригодности их использования для диагностики бруцеллеза.
Задачи исследования:
• оценить возможность и эффективность использования в диагностических твердофазных тест-системах поверхностных антигенных комплексов или индивидуальных антигенных фракций возбудителя бруцеллеза;
• изыскать надежные методические подходы к получению высокоактивных противо-бруцеллезных S- и R-сывороток, пригодных для использования в качестве источника специфических IgG при конструировании чувствительных и специфичных твердофазных иммунохимических тест-систем;
• разработать методические основы конструирования и применения диагностических тест-систем (иммуноферментной, иммуноэритроадсорбционной и вариантов дот-иммуно-анализа) применительно к бруцеллезу;
• оценить эффективность применения разработанных диагностических тест-систем на экспериментальном, клиническом и полевом материале.
Научная новизна. Впервые в сравнительном аспекте проведена комплексная оценка пригодности поверхностных антигенных фракций бруцелл для конструирования твердофазных диагностических тест-систем на бруцеллез (а.с. № 316008 от 01.07.90 г.; патент №2051963 от 10.01.96 г.).
Разработаны методические приемы и предложены рациональные схемы надежного получения высокоактивных кроличьих сьюороток против корпускулярных и растворимых
Аг бруцелл в гладкой и шероховатой формах (патент № 2051963 от 10.01.96 г.). Впервые предложена схема получения высокоактивной агглютинирующей сыворотки против очищенного ЛПС бруцелл (патент № 2010577 от 15.04.94).
Одними из первых в стране разработаны методические приемы конструирования иммуноферментной и иммуноэритроадсорбционной тест-систем, позволяющих с высокой чувствительностью и специфичностью исследовать экспериментальный, клинический и полевой материал на присутствие возбудителя бруцеллеза в S- и R-формах, растворимых Аг бруцелл и Ат к ним. По результатам межведомственных комиссионных испытаний (Москва, 1985 г.) иммуноферментная тест-система признана соответствующей ОМБТ.
Впервые отработаны методические подходы к конструированию диагностикумов для ДИА с использованием специфических IgG, белка А стафилококка и поверхностных антигенных фракций бруцелл, меченных частицами КЗ, для обнаружения возбудителя бруцеллеза и его Аг, а также противобруцеллезных Ат. Показана возможность исследования с золотосодержащими диагностическими препаратами экспериментального и клинического материала.
Впервые разработаны и апробированы на экспериментальном и клиническом материале методические основы конструирования диагностикумов с использованием в качестве маркеров специфических IgG и антигенных фракций бруцелл частиц КС для детекции корпускулярных и растворимых Аг возбудителя бруцеллеза и Ат к ним (патенты №№ 2202798,2202799,2202800 от 20.04.03 г.
Впервые предложена методика приготовления угольного диагностикума для проведения ДИА на стрипах с целью скрининга сывороток на наличие противобруцеллезных Ат.
Теоретическая и практическая значимость диссертации
Результаты проведенных исследований дополняют новыми научными данными сведения об антигенных комплексах бруцелл, пополняя теоретическую основу и намечая направления изысканий в области усовершенствования иммунодиагностики бруцеллеза. Полученные материалы послужили методической основой для конструирования твердофазных иммунохимических тест-систем на бруцеллез. Теоретический аспект исследований состоит и в анализе возможных способов минимизации неспецифических реакций при проведении серологической диагностики бруцеллеза, обосновании рациональности выбора конкретных твердофазных методов лабораторной диагностики бруцеллеза из числа альтернативных; разработке методических приемов конструирования диагностических тест-систем с использованием в качестве маркеров специфических иммунных реагентов различных молекулярных и корпускулярных меток.
Как теоретическое, так и практическое значение имеют материалы изучения имму
нохимических свойств Аг бруцелл с точки зрения возможности использования их в качестве специфических зондов при конструировании антигенных диагностикумов для различных серологических реакций, для получения высокоактивных антисывороток, имму-ноаффинной изоляции специфических Ат, количественной оценки содержания Аг в исследуемом материале и т.д.
В связи с тем, что существующие коммерческие агглютинирующие бруцеллезные антисыворотки в виду их невысокой специфической активности не пригодны для использования в твердофазных иммунохимических тест-системах, разработанные методические приемы и рекомендованные рациональные схемы надежного получения высокоактивных кроличьих сывороток против корпускулярных и растворимых Аг S- и R-бруцелл позволяют получать в достаточном количестве специфические Ат, пригодные для использования в нативном состоянии или в виде отдельных фракций для конструирования диагностических препаратов.
Разработанные методические подходы и принципы конструирования твердофазных иммунохимических диагностических тест-систем с применением в качестве маркеров специфических иммунных реагентов молекулярных и корпускулярных неорганических меток позволяют использовать их не только для приготовления высокочувствительных, специфичньк диагностических препаратов на бруцеллез, но и применительно к другим особо опасным инфекциям, в частности, - чуме и туляремии (патент № 2203496 от 27.04.03 г.).
По результатам выполненных исследований составлены две инструкции и 12 методических рекомендаций, 2 из которых утверждены на федеральном уровне, получено 7 патентов и авторских свидетельств на изобретения, оформлено 9 рационализаторских предложений. Наши разработки внедрены в практику научно-исследовательского противочумного института Кавказа Закавказья (г, Ставрополь), Всероссийского научно-исследовательского института бруцеллеза и туберкулеза животных (г. Омск), Зонального научно-исследовательского института сельского хозяйства Северо-Востока (г. Магадан), Института ветеринарной медицины и биотехнологии СГАУ им. Н.И. Вавилова (г. Саратов), Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (г. Саратов), Хабаровской противочумной станции Минздрава РФ (г. Хабаровск). Копии актов о внедрении -в приложении.
Основные положения, выносимые на защиту:
• Возможность и эффективность использования в диагностических твердофазных тест-системах поверхностных антигенных комплексов или индивидуальных фракций возбудителя бруцеллеза;
• Методические подходы и рациональные схемы получения высокоактивных специфических S- и R-сывороток против корпускулярных и растворимых Аг бруцелл, критерии оценки их пригодности для конструирования диагностических препаратов;
• Конъюгирование отдельных антигенных фракций бруцелл со шлепперами, а также сочетанное введение животным комплекса Аг=Ат с феракрилом способствует резкому повышению эффективности иммунизации.
• Методические приемы конструирования иммуноферментной и иммуноэритроад-сорбционной тест-систем, обеспечивают высокую эффективность обнаружения корпускулярных и растворимых Аг возбудителя бруцеллеза в гладкой и в шероховатой формах, а также Ат к ним в экспериментальных и в полевых условиях.
• Методические подходы позволили использовать в процессе конструирования препаратов для диагностики бруцеллеза неорганические маркеры (частицы коллоидных металлов - золота, серебра - и углерода). Полученные тест-системы высокочувствительны, специфичны, универсальны (обнаружение Аг и Ат в экспериментальном и клиническом материале), экспрессны, демонстративны и высоко информативны.
Апробация работы
Материалы диссертации обсуждены на V монголо-советской конференции по профилактике чумы и других особо опасных инфекций. Улан-Батор, 1982; Втором международном конгрессе по эндотоксину (2nd Congress of the International Endotoxin Society). Вена, 1992; Международном симпозиуме "Мониторинг здоровья населения и окружающей среды. Технология и информационные базы данных - 2001". - Греция, о. Крит, 2001; Международной научно-практической конференции "Современный эпидпотенциал природных очагов чумы". Алматы, 2001; Международных научных конференциях (Natural Infectious diseases). Ulaanbaatar, 2001,2002; Всесоюзной конференции по теоретической и прикладной инфекционной иммунологии. Москва, 1982; Всесоюзной научной конференции специалистов противочумных учреждений "Современные аспекты профилактики зооноз-ных инфекций". Иркутск, 1984; Всесоюзной научно-практической конференции "Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций", Ставрополь, 1986; I Всесоюзной научно-практической конференции по иерсиниозам. Владивосток, 1986; Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным". Новосибирск, 1989; Всесоюзной научной конференции "Актуальные проблемы профилактики особо опасных и природно-очаговых инфекционных болезней. Иркутск, 1994; Российской научной конференции "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций. Саратов, 1993; VII съезде ВОЭМП. М., 1997; 2-й Всероссийской конференции "Гомеостаз и инфекционный процесс". Саратов, 1998; Объединенной научной сессии Общего собрания Сибирского отделения РАМН
"Новые медицинские технологии". Новосибирск, 2000; Юбилейной научной конференции "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии". Оболенск, 1999; научной конференции "Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций". Ставрополь, 1991; научно-практической конференции "60 лет противочумной службы Кавказа. Актуальные вопросы профилактики особо опасных и других инфекционных заболеваний". Ставрополь, 1995; научной конференции "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера". Новосибирск, 1998; региональной научной конференции "Медико-биологические проблемы Восточной Сибири". Иркутск, 1988; региональной научно-практической конференции "Проблемы природно-очаговых и зооноз-ных инфекций в Сибири и на Дальнем Востоке". Чита, 1993; научных конференциях Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока. Иркутск, 1982-2003 гг.
Публикации. Основное содержание работы отражено в 63 научных публикациях в зарубежных, центральных и региональных изданиях, сборниках трудов конференций, в четырех заключительных отчетах. В Государственном реестре изобретений РФ зарегистрировано 7 патентов и авторское свидетельство.
Основные результаты, приведенные в диссертации, получены лично автором. Исследования по отдельным разделами проводились совместно с сотрудниками биохимического отдела, отдела зоонозных инфекций, лаборатории диагностических сывороток, музея живых культур, научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" (пос. Кольцово, Новосибирская область).
Классификация представителей родаВгисеІІа
Бруцеллез - инфекционное заболевание людей и животных, вызываемое бактериями под родовым названием Brucella. Возбудитель бруцеллеза характеризуется полигосталь-ностью: в естественных или экспериментальных условиях к нему восприимчивы не только теплокровные (млекопитающие, птицы), но и многие пойкилотермные животные (амфибии, рептилии, рыбы, лягушки, ящерицы, черепахи). Установлена спонтанная зараженность бруцеллами клещей. Для человека основным источником инфекции являются сельскохозяйственные животные, прежде всего овцы, козы, крупный рогатый скот, свиньи и северные олени (Здродовский П.Ф., 1953; Ременцова М.М. и др., 1969; Пинигин А.Ф., 1971; Таран И. Ф., Лямкин Г. И., 1996; Davis D.S., 1990).
Первую классификацию бруцелл, основанную на учете типа хозяина-носителя бруцеллезной инфекции, предложил I. Huddleson (1929), подразделивший род Brucella на три вида - Brucella melitensis, В. abortus и В. suis. Это предложение нашло отражение в определителе бактерий D. Bergey (1957), где такое подразделение официально закреплено, а возбудитель бруцеллеза отнесен к классу Schizomycetes порядку Eubacteriales семейству Brucellaceae роду Brucella.
В связи с изоляцией в последующие годы от ряда животных микроорганизмов, близких по свойствам, но, тем не менее, отличающихся от "классических" представителей, Подкомитет по таксономии бруцелл Международного Комитета по номенклатуре бактерий в 1970 г. внес существенные изменения в действовавшую классификацию. В дополнение к ранее признанным В. melitensis, В. abortus и В. suis новая схема предусматривала выделение бруцелл трех новых видов - В. neotomae, В. ovis, В. canis, являющихся возбудителями бруцеллеза пустынных кустарниковых крыс (хомяков), эпидемического эпидиди-мита баранов и бруцеллеза собак, соответственно. Кроме того, внутри вида В. melitensis выделены три, В. abortus девять и В. suis - пять биотипов.
На основании результатов изучения бруцелл, изолированных от северных оленей, А.Ф. Пинигин, А.Ф. Петухова (I960) предложили рассматривать возбудителя бруцеллеза этих стадных животных как представителя нового типа (вида) рода Brucella - В. rangiferi. Комитет по номенклатуре патогенных микробов при Министерстве здравоохранения СССР в 1962 г. поддержал это предложение, поэтому мы в своей работе для обозначения бруцелл оленьего происхождения используем термин В. rangiferi (в рассматриваемой классификации - В. suis, биотип 4).
Недавняя изоляция своеобразных штаммов бруцелл от морских млекопитающих -китообразных, тюленей, дельфинов и европейской выдры (Foster et al., 1996; Cloeckaert A. et al., 2000) - расширяет ареал возбудителя бруцеллеза как зооноза. Предполагается, что эти штаммы образуют самостоятельную нозологическую группу бруцелл - В. maris (Ewalt D.R- et al., 1994; Ross H. M. et al., 1994).
В 1986 г. Подкомитет по таксономии бруцелл (ICSB, Subcommittee on the Taxonomy of Brucella, 1988; http:\\www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=234) принял решение считать род Brucella моновидовым, то есть выделил в нем единственный вид - В. melitensis, рассматривая остальных представителей этого рода в качестве биоваров основного вида (табл. 1).
Основанием для такого решения послужили данные по гибридизации ДНК бруцелл, свидетельствующие о высокой степени ее гомологии (Verger J.M. et al., 1985; Vizcaino N. et al., 2000). Вместе с тем, в нетаксономических целях допускается использование "старых" наименований - В. abortus, В. canis, В. neotomae, В. ovis и В. suis.
По мере накопления данных вносились коррективы в представления об эволюции, филогенетических связях и систематическом положении возбудителя бруцеллеза. В частности, путем сопоставления нуклеотидной последовательности 16S рРНК сделан вывод, что В. abortus является членом подгруппы а-2 класса Proteobacteria, куда входят специфически связанные с бруцеллами Rickettsia, Agrobacteria и Rizobiae - микроорганизмы, которые также являются факультативными или облигатными паразитами эукариотических клеток (Moreno Е. et al., 1990). В последующие годы получены доказательства близкого сходства бруцелл с другими членами подгруппы Proteobacteria, в частности Ochrobactrum anthropi и О. intermedium, отнесеными к роду Ochrobactrum семейства Brucellaceae (Holmes J.C. et al., 1988; Velasco J. et al., 1997, 1998, 2000), а также Rhizobium leguminosarum (биовар viciae) и Phyllobacterium rubiacearum, представляющими группу Rhizobiaceae (Vizcaino N. et al., 1996,1997).
Очевидно, приведенные материалы приняты во внимание при уточнении происхождения и таксономии возбудителя бруцеллеза. В соответствии с ними в настоящее время "родословная" бруцелл включает следующие таксоны: Bacteria; Proteobacteria; alpha subdivision; Rhizobiaceae group; Brucellaceae; Brucella.
Безусловно, сходство свойств представителей а-подгруппы класса протеобактерий, так же как наличие у бруцелл и многих других микроорганизмов общих антигенов, необходимо учитывать при разработке диагностических препаратов. С точки зрения перспектив развития диагностических тест-систем важно подчеркнуть, что бруцеллы двух видов -В. ovis и В. canis - в природных условиях циркулируют в R-форме, в связи с чем для выявления их Аг и особенно Ат против них необходимы индивидуальные подходы.
Штаммы микроорганизмов
Культуры бруцелл выращивали на глюкозо-глицериновом агаре Мартена или эритрит-агаре рН 6.8 (В. ovis - с добавлением 10% ШІС и при повышенном до 10% содержании СОг) в течение 48 ч при 37С. Бактерии смывали и дважды отмывали ФР. Концентрацию клеток устанавливали по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича (10 ед.). Для проверки бруцелл на диссоциацию использовали пробу с трипафлавином, реакцию термопрещшитации, окраску колоний кристаллическим фиолетовым (Альтон Дж., Джонс Л.М., 1968).
Для приготовления ацетонвысушенных клеток (и одновременной инактивации) микробную массу заливали трехкратным объемом охлажденного до 4С ацетона и инкубировали 6 сут со сменой последнего через 48 ч. Ацетон осторожно сливали, осадок отделяли центрифугированием, высушивали на воздухе и измельчали в фарфоровой ступке. Микробную взвесь обеззараживали также в течение 24 ч цетилтриметиламмонийбромидом (цетавлоном) (Serva, ФРГ) в конечной концентрации 2% и 4.5% раствором мочевины.
Для контроля специфичности диагностических тест-систем использовали штаммы гетерологичных микроорганизмов: Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica 0:3 и 0:9, F. tularensis, V. cholerae, Sh. flexneri, S. typhimurium, E. coli, Proteus vulgaris. После 1-2-суточной инкубации при 37С культуры бактерий смывали ФР, концентрацию микробных взвесей доводили до 109 м.к./мл по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасовича (10 ед.) и инактивировали кипячением на водяной бане в течение 20 мин.
Все манипуляции с живыми культурами или материалом, подозрительным на зараженность патогенными микроорганизмами, проводили в соответствии с требованием Санитарных правил СП 1.2.011-94 "Безопасность работы с микроорганизмами 1-2 групп патогенно-сти". Контроль специфической стерильноста препаратов осуществляли в соответствии с "Методическими рекомендациями по контролю специфической стерильности биологических препаратов, приготовленных из бруцелл" (1987).
В процессе экспериментов нами использованы: сыворотки диагностические бруцел-лезные поливалентные для РА, поставляемые Одесским предприятием по производству бактерийных препаратов; позитивные овисные сыворотки для РДСК производства Алма-Атинского биокомбината; сыворотки диагностические туляремийные лошадиные жидкие и чумные агглютинирующие сыворотки производства НИПЧИ; сыворотки кишечно-иер-синиозные для РИГА 0:3, 0:9 и сыворотки псевдотуберкулезные (І-Ш сероваров), выпускаемые предприятием по производству бактерийных препаратов "Иммунотест", Санкт-Петербург; сыворотки диагностические холерные (О, Огава, Инаба) агглютинирующие сухие производства НИПЧИ; агглютинирующая неадсорбированная сыворотка к сальмонеллам брюшного типа производства Ташкентского НИИБС; агглютинирующая адсорбированная поливалентная сыворотка к шигеллам Флекснер, Ньюкестл, Зонне ослиная; сыворотки лептоспирозные диагностические агглютинирующие типоспецифическая, серогруппа Grippotyphosa, серовар grippotyphosa, штамм Moskva Y, серогруппа Autumnalis, штамм Akiyami А и серогруппа Pomona, серовар Pomona, штамм Pomona производства Ставропольского НИИ вакцин и сывороток; нормальные кроличья, лошадиная и крупного рогатого скота сыворотки производства НИПЧИ; сыворотка крови плодов коровы производства БелНИИЭМ, Минск; человеческие донорские сыворотки с Иркутской станции переливания крови; сыворотки крови больных из городской инфекционной больницы и работников Иркутского мясокомбината. Используемые в работе образцы сывороток крови предварительно инактивировали прогреванием при 56С в соответствии с "Санитарными правилами СП 1.2.011"..
В качестве главного критерия оценки пригодности сывороток для конструирования диагностических препаратов рассматривали содержание в них специфических Ат, титр которых определяли, в основном, в РИД, РПГА и ИФА.
Препаративные методы
КО инактивированных ацетоном бруцелл получали в соответствии с разработанной нами методикой (Голубинский Е.П. и др., 1989). Высушенные ацетоном клетки разрушат ультразвуком в стаканчиках дезинтегратора MSE-150 Watt (Англия) при 20 кГц в течение 20 мин. Полученный гомогенат подвергали дифференциальному центрифугированию (6000 g, 20 мин, 4С и 30000 g, 40 мин, 4С), осадок (КО) обрабатывали 4 М раствором мочевины и дНгО для более полного извлечения компонентов цитоплазмы. Отмытые КО ре-суспендировали в трис-НС1 буфере рН 8.3, подвергали действию РНКазы и ДНКазы (в конечной концентрации 10 мкг/мл) в течение 5 ч при 37С, добавляли сухую мочевину до конечной концентрации 4 М и КО осаждали при 105000 g в течение 1 ч. Полученный оса док КО отмывали дважды 4 М раствором мочевины и дШО и готовый образец КО хранили при -20С или при 4С в лиофилизированном состоянии.
ЛПС S-бруцелл изолировали с использованием водно-фенольной экстракции (Moreno Е. et al., 1979; Захарова И.Я., Косенко Л.В., 1982; Львов В.А. и др., 1985); экстракцией смесью фенол-уксусная кислота-вода, тритоном Х-100, солянокислым гуанидином, 8 М мочевиной (Stone S. et al., 1982); ТХУ по методу Буавена в модификации Е.А. Драновской (1978); толуолом с последующим фракционированием сульфатом аммония (Baker Е.Е. et al., 1947); хлоридом и цитратом натрия (Raynaud М., Digeon М., 1949); автоклавированием с последующей гельфильтрацией (Berraan D.T. et al., 1980). R-ЛПС получали водно-фенольной экстракцией клеток штамма В. ovis H-58R с последующим осаждением препарата этанолом и гель-хроматографией (Moreno Е. et al., 1979).
БПА получали из бруцелл уксуснокислым гидролизом с последующим осаждением этанолом по методу В. White (1931) в модификации П.А. Вершиловой, Е.А. Драновской (1976).
Фракции БНМ выделяли из КО бруцелл согласно I. Moriyon, D.T. Berman (1982), D.R. Verstreate et al. (1982) в нашей модификации (Голубинский Е.П. и др., 1989; Марков Е.Ю., 2000).
Первый этап. 5 г КО вирулентного штамма В. abortus И-І46 вносили в 15 мл 50 мМ трис-HCl буфера рН 8.3, содержащего 1 мМ ЭДГА, 50 мМ NaCl и 2% ДОХ (буфер I). После инкубирования на шуттеле при 37С в течение 1 ч не растворившийся материал осаждали центрифугированием при 105000 g. Процедуры экстрагирования и центрифугирования в указанных условиях повторяли дважды. Экстракты (супернатанты) объединяли и диализовали против 20% водного ацетона, затем - против дНгО.
Второй этап. Осадок отмывали дНгО для удаления ДОХ, суспендировали в 15 мл экстрагирующего буфера (буфер 2), содержащего 10% глицерина, 0.7% 2-МЭ, 2% ДСН, инкубировали на шуттеле 1 ч при 37С и центрифугировали при 105000 g (20С, 1 ч). Экстракцию проводили трижды, супернатанты объединяли, диализовали до полного удаления детергента и лиофилизировали.
Третий этап. Иерастворившийся материал ресуспендировали в экстрагирующем буфере 2 с добавлением 50 мМ MgCb. выдерживали 3 ч при 56С, осаждали центрифугированием (105000 g), надосадочную жидкость диализовали в присутствии ацетона и лиофилизировали.
Выделение, очистка и характеристика физико-химических и R. биологических свойств поверхностных антигенных фракций бруцелл
С учетом многообразия компонентов, составляющих структуру поверхностных слоев клетки, и, как следствие, - невозможности одномоментного охвата всех относящихся сюда проблем даже при самом обстоятельном исследовании, мы попытались изолировать, очистить и охарактеризовать наиболее диагностически значимые поверхностные антигенные комплексы S- и R-бруцелл. Как следует из материалов главы 1, до настоящего времени среди исследователей нет единодушия в выборе какой-либо определенной антигенной фракции или конкретного Аг в качестве специфического зонда при конструировании им-мунохимических тест-систем для серодиагностики бруцеллеза: одни рекомендуют использовать ЛПС или продукты его деградации (О-ПС, ДПС), считая этот комплекс наиболее иммунологически активным, обеспечивающим высокую чувствительность анализа. Другие изыскивают альтернативные подходы, поскольку большинство перекрестно реагирующих антигенных детерминант расположено на ЛПС. Наиболее перспективными в этом плане представляются протеиновые фракции бруцелл или отдельные полипептиды с определенной молекулярной массой. Однако и здесь единого мнения не существует.
В связи с этим проблемам выбора наиболее подходящей антигенной фракции мы уделили серьезное внимание. Цель нашего исследования состояла, прежде всего, в выборе наиболее специфичного антигенного препарата (или нескольких) возбудителя бруцеллеза, пригодного для конструирования на его (их) основе диагностических тест-систем для обнаружения противобруцеллезных Ат в сыворотках крови людей и животных. В число исследованных Аг вошли КО бруцелл и их составляющие (ЛПС, ДПС, БПА), белково-полисахаридные и белковые фракции НМ. Подобный выбор обусловлен поверхностным расположением и, вследствие этого, - чрезвычайно важным биологическим значением перечисленных компонентов для воспроизводства факторов, обеспечивающих специфическое взаимодействие возбудителя с клетками и тканями макроорганизма. Разнообразие методических приемов позволяет изолировать антигенные фракции с разными физико-химическими и иммунохимическими свойствами, определяющими особенности их взаимодействия с корпускулярными или молекулярными метками.
Поскольку ЛПС является иммунодоминантным компонентом бруцелл и широко используется исследователями в тест-системах при проведении серологической диагностики бруцеллеза, мы уделили повышенное внимание изучению этого антигенного комплекса.
При выборе способа изоляции Аг бактериальной клетки важное значение имеет максимальное сохранение их нативности и иммунобиологической активности, вследствие че го придается важное значение тщательному подбору экстрагентов и условиям экстрагирования. Это побудило при выделении ЛПС-содержащих Аг бруцелл апробировать не только традиционные методы, хорошо зарекомендовавшие себя, например, при изоляции ЛПС, БПА и других фракций, но и способы, абсолютное большинство которых применительно к бруцеллам использовано нами впервые. К числу первых относятся воздействие на клетку водно-фенольной смеси в условиях холодной и горячей экстракции (Захарова И.Я., Косенко Л.В., 1989; Львов В.Д. и др., 1985; Moreno Е. et al., 1979, 1984), экстракция уксусной (Вершилова П.А., Драновская Е.А., 1976) и трихлоруксусной (метод Буавена в модификации Е.А. Драновской, 1968) кислотами. Вторая группа методов включает экстракцию бруцелл смесями фенол-уксусная кислота-вода (Stone S.S. et al., 1982) или водных растворов хлорида и цитрата натрия (Raynaud М., Digeon М., 1949), гипертоническим раствором NaCl, насыщенным толуолом (Baker Е. et al., 1947), дНгО в сочетании с термообработкой (Berman D.T. et al, 1980), водными растворами тритона Х-100, солянокислого гуанидина и мочевины (Stone S.S. et al., 1982).
ЛПС-содержащие Аг бруцелл после лиофильного высушивания представляют собой рыхлые порошки белого или слегка желтоватого цвета, большей частью хорошо растворимые в дї О и солевых растворах. R-ЛПС в обычных условиях в воде не растворяется. ракция бруцелл фенольно-водной смесью (3.8-5.2%). Довольно продуктивной оказалась обработка клеток и другими использованными экстрагентами: ТХУ, дНгО, раствором NaCl, тритоном Х-100, солянокислым гуанидином, мочевиной. Однако по количественному составу отдельных компонентов экстракты, полученные разными методами, существенно отличаются друг от друга.
Наиболее эффективным методом изоляции ЛПС оказалась экстракция водно-фено-льными смесями, которая наряду с большим выходом обеспечивает высокую антигенную активность препарата (табл.3.1 и 3.7). Особенно результативной в этом плане является водно-фенольная экстракция, производимая по методу Е. Moreno et al. (1979), с помощью которой удается извлекать из микробных клеток максимальное количество ЛПС. Это обусловлено, скорее всего, полнотой экстракции. Основная часть ЛПС бруцелл при всех модификациях водно-фенольной экстракции концентрируется, в отличие от одноименного препарата энтеробактерий, не в водной, а в фенольной фазе экстрагента, что согласуется с литературными данными (Moreno Е. et al., 1979, 1981). При экстракции другими экстрагентами ЛПС извлекается из бруцелл в минимальных количествах, в силу чего основная масса препаратов приходится на белково-углеводные компоненты клетки.
При химическом анализе в составе выделенных препаратов ЛПС бруцелл выявлены белки (14.3-27.2%), углеводы (16.7-25.3%), НК (0.15-0.91%), КДО (0.16-0.62%).
При колориметрическом методе количественного определения содержания S-ЛПС, основанном на спектральном сдвиге максимума адсорбции карбоцианинового красителя с 510 до 472 нм при реакции его с растворами, содержащими ЛПС (Janda J., Work Е.А., І97Г), нами установлено, что наибольшим содержанием ЛПС (79.3-91.1%) характеризуются препараты, полученные по методу Е. Moreno et al. (1979). Это обстоятельство, видимо, связано с тем, что при данном способе осуществляется не только изоляция, но и частичная очистка Аг путем обработки ЛПС-содержащего экстракта диметилсульфоксидом и мета-ноловым реагентом. Более низкое содержание ЛПС (64.4%) в препаратах, полученных экстракцией смесью фенол-уксусная кислота--вода (Stone S. et al., 1982), по сравнению с препаратами, для изоляции которых использовали водно-фенольную смесь, связано, по-видимому, с частичной его деградацией до ДПС в ходе получения под воздействием уксуснокислого гидролиза. Выход ЛПС при экстракции клеток тритоном Х-100 (25.9%), мочевиной (15.5%), солянокислым гуанидином (14.3%), раствором хлорида и цитрата натрия (17.0%) и дНоО (9.4%) был минимальным. Средними показателями содержания ЛПС (38.0 и 44.9%) характеризовались препараты, полученные по Е. Baker et al. (1947) при насыщении сульфатом аммония до 20 и 60%.
Конструированче ИЭАМ для обнаружения антигенов S-бруцелл
Наряду с конструированием инструментальных систем точного количественного иммуноанализа не утрачивают значения разработки простых, не зависимых от приборного обеспечения альтернативных методов, предназначенных для скоростного иммунологического скрининга.
Иммуноэритроадсорбционный метод предложили в конце 70-х-начале 80-х гг. XX в. сотрудники группы R.R. Coombs (Coombs R.R. et al., 1978,1981). ИЭАМ выгодно сочетает преимущества использования микротитровальных носителей и прямую визуальную оценку результатов с помощью дешевой и доступной оптически плотной корпускулярной метки - эритроцитов.
Принцип ИЭАМ при обнаружении Аг состоит в том, что специфические Ат, адсорбированные на стенках U- или V-образной лунки твердой фазы, специфически взаимодействуют с искомым Аг, а последний затем иммунологически связывается со специфическим Ат, меченым Э. Меченые Э Ат, вступившие во взаимодействие с Аг, остаются на стенках иммуносорбента (с образованием регистрируемого визуально "зонтика"), при отсутствии Аг в исследуемом материале Э скатываются на дно лунки, формируя "пуговку".
Антитело. В качестве источника специфических Ат, как и в ИФА, используют кроличьи гипериммунные противобруцеллезные анти-S - и анти-Рч.-сыворотки. Перед изоляцией IgG сыворотки адсорбируют 50% взвесью эритроцитов соответствующего животного или птицы (1:10, 37С, I ч). Адсорбированные сыворотки освобождают от эритроцитов центрифугированием (103 g, 4С, 10 мин).
Эритроциты. Поскольку Э животных и птиц разных видов различаются по форме и размерам, наличию или отсутствию ядра, и, вероятно, по разной способности связывания со специфическим лигандом (Ат), нами в качестве метки испытаны Э человека, барана, лошади, морской свинки (безъядерные), петуха, курицы, индюка, гуся (ядерные). В начальных разработках в качестве маркера Ат использовали также коммерческие формали-низированные эритроциты (ФЭ) барана из наборов для РПГА. Для работы применяли отмытые Э, концентрацию которых устанавливали по объему. Вследствие морфологической разнородности Э до и после конъюгирования с IgG стандартизовали по размеру.
Конструирование ИЭАМ для обнаружения антигенов S-бруцелл
С учетом опыта, накопленного в процессе разработки ИФА, мы и в случае ИЭАМ на первом этапе попытались оценить диагностическую возможность метода на примере индикации S-бруцелл как эпидемиологически наиболее опасных.
Оптимизация условий постановки ИЭАМ для обнаружения антигенов S-бруцелл
По принципу постановки ИЭАМ сходен с прямым сэндвич-вариантом ИФА: в том и другом случаях имеет место трехкомпонентиая система, включающая Ат, искомый Аг и меченые эритроцитами Ат. Сходство методов проявляется и в том, что первые два этапа -сенсибилизация твердой фазы специфическими Ат и реакция иммуносорбіши искомого Аг по качественному составу взаимодействующих компонентов в том и другом случаях идентичны. Что касается третьего этапа - взаимодействия Аг с конъюгатом, то в ИФА и в ИЭАМ он различается как по физико-химическим характеристикам конъюгатов, так и по механизмам их действия. Естественно, что подобная специфика определила необходимость строгого индивидуального подхода в изыскании оптимальных параметров реализации заключительной процедуры.
В качестве твердой фазы нами избраны микрокамеры для иммунологических реакций (камеры Терасаки) производства Ленинградского завода медицинских полимеров, выполненные из дакрила 4В и имеющие по 60 лунок вместимостью 15 мкл каждая.
Режим сенсибилизации отрабатывали с использованием фракции S-IgG из адсорбированных Э барана кроличьих гипериммунных противобруцеллезных сывороток. Сенсибилизирующую дозу IgG варьировали в пределах 0.005-0.1 мг/мл. В качестве комплекси-рующего буфера испытан ряд растворов разной ионной силы и рН. Оптимизирован режим адсорбции IgG в лунках камеры. Проведенные эксперименты показали, что для эффективной сенсибилизации лунок достаточны минимальные концентрации покрывающего IgG -0.005-0.02 мг/мл. Оптимальным комплексируюшим раствором оказался 0.05М КББ рН 9.6, однако вполне удовлетворительные результаты получены при использовании дН О. Дія полноценной адсорбции микрокамеры инкубировали в течение 2 ч при 37С с последующей экспозицией до утра при 4С.
В качестве отмывающей жидкости, как. и в случае ИФА, в наибольшей мере подходит ЗФР-твин. Однако, в отличие от индивидуального и, следовательно, более трудоемкого процесса заполнения лунок микропланшета в ИФА, отмывание лунок камер Терасаки проводят путем сплошной заливки 15-20 мл отмывающей жидкости. При этом заполняются сразу все 60 лунок микрокамеры. После 1-2-минутной экспозиции жидкость удаляют сливанием содержимого камеры с последующим тщательным встряхиванием ее. Трехкратное повторение подобной процедуры приводит к гарантированному удаїению непро-реагировавших компонентов.
Продолжительность хранения сенсибилизированных камер Терасаки лимитируется возможностью бактериального загрязнения и подсыхания содержимого лунок, поэтому, как правило, не превышает 5-7 сут.
![Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс]](/i/i/4289/212277.png "Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс] Тучков Игорь Витальевич")
