Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы ч 11
1.1. Распространение бруцеллеза на территории РФ 11
1.2. Методы диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных
1.2.1. Серологическая диагностика бруцеллеза 15
1.2.2. Аллергическая диагностика бруцеллеза 29
1.3. Полимеразная цепная реакция 31
Собственные исследования
Глава 2. Материалы и методы 43
2.1. Материал для исследования 43
2.2. Выявление ДНК бруцелл методом ПНР 44
2.3. Серологические методы 49
2.4. Статистические методы исследования 51
Глава 3. Применение тест-системы "Ген-Бру" для молекулярно биологической диагностики бруцеллеза животных 52
3.1. Оценка эффективности ПЦР при обследовании иммунизированного крупного рогатого скота и больных бруцеллезом животных 52
3.2. Использование ПЦР в комплексе с серологическими реакциями (РА, РСК) 60
Глава 4. Оценка информативности ПЦР-анализа при исследовании различных образцов диагностического материала 65
4.1. Выбор диагностического материала от животных для детекции бруцелл методом ПЦР 65
4.2. Изучение диагностической чувствительности ПЦР при исследовании сыворотки крови и цельной крови у больных и иммунизированных против бруцеллеза животных 71
Заключение 75
Выводы 85
Список использованной литературы
- Серологическая диагностика бруцеллеза
- Выявление ДНК бруцелл методом ПНР
- Использование ПЦР в комплексе с серологическими реакциями (РА, РСК)
- Изучение диагностической чувствительности ПЦР при исследовании сыворотки крови и цельной крови у больных и иммунизированных против бруцеллеза животных
Серологическая диагностика бруцеллеза
Повышение чувствительности и специфичности, уменьшение риска контаминации, определение количества возбудителя требует применения модифицированных методов ПЦР-анализа. С целью увеличения специфичности и чувствительности амплификации применяется так называемая nested-ПЦР с двумя парами праймеров: внешними и внутренними (nested). Первоначально амплификация осуществляется с внешними праймерами. Далее ПЦР проводится внутренними праймерами, которые фланкируют участок ДНК, находящийся внутри копированных на первом этапе фрагментов, подтверждая тем самым специфичность реакции. Для предупреждения неспецифического низкотемпературного спаривания праймеров используют так называемый «горячий старт» ПЦР. Прием заключается в предварительном (до добавления Taq-полимеразы и ионов Mg ) прогревании амплификационной смеси при 95 С в течение 3-5 минут. Оба способа проведения ПЦР с успехом применяются в тест-системе для выявления Brucella spp., производства РосНИПЧИ «Микроб» [Инструкция по применению, 2000]. Повысить чувствительность реакции также возможно, применяя Booster-ПЦР (или бифазную ПЦР). Принцип бифазной ПЦР заключается в изменении концентрации праймеров в процессе реакции. На начальном этапе количество праймеров составляет около 2-100 пМ. По истечении 20 или более циклов в реакцию вновь вносят праймеры, но уже в 10-100 кратном от исходной концентрации количестве. Это позволяет избежать образования димеров праймеров и вторичных структур на их основе.
Для детекции РНК-содержащих вирусов применяется заякоренная ПЦР. Необходимость данного методического подхода обусловливается тем, что в случае РНК-матрицы наиболее легко определить лишь 3 -концевую последовательность. Принцип заякоренной ПЦР заключается в получении с РНК ДНК-копии, к 3 -концу которой с помощью терминальной трансферазы присоединяется полисЮ-блок. Амплификация ДНК-мишени осуществляется при участии «заякоренного» праймера, содержащего полиёС-последовательность, и поэтому гибридизирующего с полисЮ-блоком, и специфичного праймера, синтезированного на основе известной 3 -концевой последовательности РНК [Вартапетян А.Б., 1991].
Инвертированная ПЦР позволяет амлифицировать не только ДНК с известной последовательностью, но и фланкирующие ее области. Участок ДНК гидролизуется рестриктазой, разрывая нуклеиновую кислоту в точках правее и левее известной последовательности. Образуемый фрагмент ДНК замыкается в кольцо с помощью ДНК-лигазы и подвергается ПЦР. Праймеры, используемые в реакции, направлены 3 -концами наружу по отношению к известной последовательности, благодаря чему амлифицируются и фланкирующие участки ДНК. Инвертированная ПЦР применяется для изучения сайтов интеграции провирусов, мобильных элементов промоторных областей генов известных белков и т.п. [Вартапетян А.Б., 1991].
В некоторых случаях, чтобы предотвратить ложноотрицательный результат вследствие мутации последовательности ДНК, выбранной в качестве мишени амплификации, применяют мультипраймерную или множественную ПЦР, заключающуюся в одновременном применении нескольких праймеров, гомологичных разным участкам генома тестируемого микроорганизма. Праймеры подбираются таким образом, чтобы условия их амплификации были одинаковыми. Используя множественную ПЦР с соответствующими праймерами можно одновременно детектировать несколько различных возбудителей инфекционных заболеваний.
Для эффективного обнаружения внутриклеточных паразитов (вирусов, микроорганизмов рода Chlamidia, Micoplasma, Brucella и др.) применяют ПЦР-Іп situ. Особенность этой модификации заключается в том, что амплификация ДНК проводится непосредственно в клетке (гистологическом срезе или клеточном монослое). Учет реакции проводится гибридизацией с меченным ДНК-зондом.
Чтобы уменьшить риск контаминации в настоящее время все чаще применяют праймеры, иммобилизированные на полимерную основу. В таком варианте амплификация ДНК проходит в твердой фазе [Chevrier D. et al., 1993; Rasmussen S. et al., 1994].
С помощью ПЦР возможна не только быстрая и точная детекция микроорганизма, но и определение его количества. Для этого применяют конкурирующую ПЦР и Taq-man ПЦР.
Конкурирующая ПЦР основана на одновременной амплификации ДНК-мишени и контрольной ДНК с известным количеством копий. После проведения реакции количество продукта ПЦР определяют двумя способами. Самый простой (но менее точный) - визуальное сравнение интенсивности сигналов амплифицированной ДНК-матрицы и копий контрольной ДНК. Более точное определение возможно титрованием продукта амплификации и установлением наименьшего разведения образца ДНК, дающего положительный результат в ПЦР. [Ferre F., 1992; Picard С. et al., 1992; Clementi M. et al., 1993; Mirold D.D., Huss-Vanell K., 1994; Cross N. C, 1995].
Принцип метода Taq-man ПЦР заключается в использовании олигонуклеотидного зонда, содержащего 2 флуоресцентные метки и гомологичного последовательности ДНК-матрицы [Kalinina О. et al., 1997; Zang R. et al., 1997]. При этом одна из меток способна поглощать излучение второй. В процессе реакции Taq-полимераза гидролизует олигонуклеотидный зонд в направлении 5 — 3 и наблюдается смещение максимума флуоресценции. Измерение интенсивности флуоресценции позволяет определить количество ДНК-мишени, соответствующее начальной стадии ПЦР.
Генетические методы диагностики инфекционных болезней, основанные на амплификации нуклеиновых кислот, не ограничиваются , только ПЦР. Перспективными направлениями альтернативных методик I являются ЛЦР, ЦЗТ, NASBA-метод и др.
Выявление ДНК бруцелл методом ПНР
Диагностические исследования проводились в животноводческих хозяйствах Саратовской области с различным эпизоотическим статусом благополучия по бруцеллезу крупного рогатого скота: 1. неблагополучные - с. Любительское (частный сектор) Крыльцовского округа Пугачевского района; АО «Нива» (частный сектор) Питерского района. 2. благополучные - ОПХ «Аграрник» Саратовского района. Биологическую пробу проводили на морских свинках (массой 300 400 г), предварительно проверенных на бруцеллез в РА 1:5 (отрицательный результат).
Материал для исследования от крупного рогатого скота: цитратная кровь и сыворотка крови здоровых (не иммунизированных против бруцеллеза и иммунизированных сухой живой вакциной из слабоагглютиногенного штамма Бруцелла абортус № 82) и больных бруцеллезом животных; молоко и соскобы со слизистой цервикального канала матки больных бруцеллезом коров. Материал для исследования от морских свинок: кровь и сыворотка крови инфицированных В. melitensis шт. 565 (доза 1000 м.к., подкожно) животных; кровь и сыворотка крови иммунизированных В. abortus шт. 82 (доза 1 млрд. м.к., подкожно) животных.
Кроме материала от животных в ПЦР исследовались препараты сухой живой вакцины против бруцеллеза из слабоагглютиногенного штамма Бруцелла абортус № 82 (производство Государственного Щелковского биокомбината, серия № 029, контроль № 98, изготовлена 28.05.99, годна до 28.05.2000).
Кровь от крупного рогатого скота получали пункцией яремной вены стерильными иглами Боброва в две пробирки по 10 мл. Первая пробирка содержала 1 мл 4 % раствора цитрата натрия. Кровь из второй пробирки использовалась для получения сыворотки крови.
Соскобы со слизистой внутренних половых органов коров отбирали стерильными ватно-марлевыми тампонами при помощи влагалищного зеркала Полянского. Далее тампоны тщательно прополаскивали в стерильном физиологическом растворе, который затем центрифугировали при 1500 об./мин. в течение 15 минут. Осадок исследовали в ПНР.
Сборные пробы молока в количестве 10 мл от каждой коровы получали путем сдаивания последних порций. Предварительно кожа сосков вымени протиралась чистой увлажненной марлей и обрабатывалась 70 спиртом.
Образцы противобруцеллезной вакцины из В. abortus шт. 82 исследовались в ГЩР в нативном состоянии (2x1010 м.к./мл) и в разведениях приготовленных на физиологическом растворе (0,14 М NaCl), с конечной концентрацией 1x106, 1х104, 1х102, їх 10і м.к./мл
В целях обнаружения ДНК бруцелл использовали ПЦР-тест-систему для выявления Brucella spp. («Ген-Бру») производства РосНИПЧИ «Микроб» и набор «АмплиСенс-100 Brucella species» для амплификации участка ДНК 190 п.н. бактерий рода Бруцелла производства ЦНИИЭ (г. Москва). Тест-система «Ген-Бру» предназначена для выявления возбудителя бруцеллеза в клиническом материале, пищевых продуктах и объектах внешней среды. Родоспецифичные праймеры (Bra 31-Вт 32; Вт 3-Bru 4), комплементарные нуклеотидной последовательности гена, кодирующего белок наружной мембраны бруцелл 31 кДа, обеспечивают амплификацию фрагмента ДНК размером 175 п.н. Реакцию выполняют в два этапа (nested-ПЦР).
Набор «АмплиСенс-100» предназначен для «двухшаговой» ПЦР, две пары праймеров обеспечивают амплификацию фрагмента ДНК размером 190 п.н.
В ПЦР исследовали образцы цитратной крови и сыворотки крови от инфицированного бруцеллами и иммунизированного сухой живой противобруцеллезной вакциной из шт. № 82 В. abortus крупного рогатого скота, а также клинически здорового неиммунизированного против бруцеллеза крупного рогатого скота. Кроме того, ПЦР-анализу подвергались образцы молока и соскобы со слизистой внутренних половых органов больных бруцеллезом коров; препараты сухой живой противобруцеллезной вакцины из слабоагглютиногенного шт. № 82 В. abortus. Также исследовали сыворотку крови и кровь от иммунизированных В. abortus шт. № 82 и инфицированных В. melitensis шт. 565 морских свинок.
Выделение ДНК из анализируемых проб осуществляли по методу Boom R.etal. [1980]. Схема выделения ДНК: 1. К 100 мкл образца добавляли 300 мкл буфера № 1 (6 М GuSCN; ОД М Трис; 0,5 М ЭДТА). Суспендировали на Vortex. Смесь прогревали при 65 С в течение 10 минут; 2. Вносили 30 мкл нуклеосорбента. Суспензию инкубировали при комнатной температуре 10 минут, периодически встряхивая; 3. Центрифугировали при 12000 об/мин 10 секунд. Супернатант удаляли; 4. К осадку добавляли 300 мкл буфера № 2 (4 М GuSCN; 0,1 М Трис) - Ресуспедировали на УоЛех.Центрифугировали при 12000 об/мин 10 секунд. Супернатант удаляли; 5. К осадку добавляли 1 мл буфера № 3 (10 мМ Трис, 50 мМ NaCl, 50 % этанол). Ресуспендировали на Vortex. Центрифугировали при 12000 об/мин 40 секунд. Супернатант удаляли; 6. Осадок высушивали при 65 С 20 минут. К осадку добавляли 30 мкл дистилированной воды. Ресуспендировали на Vortex. Суспензию инкубировали при 65 С 10 минут; 7. Центрифугировали при 12000 об/мин в течение 1 минуты. Супернатант отбирали в реакцию амплификации. ПЦР проводилась в 2 этапа в соответствии с инструкциями по применению тест-системы «Ген-Бру» [2000] и набора «АмплиСенс-100» [2001]. Реакционная смесь из расчета на 1 пробирку содержала: в «Ген-Бру»: дистилированной воды - 70 мкл; десятикратный буферный раствор - 2,5 мкл; дНТФ - 2,5 мкл; MgCl2 - 1 мкл; Taq-полимераза - 0,2 мкл; праймеры Вш 31, Вш 32 - по 1 мкл. Примечание: Юхбуфер имеет следующий состав 7 мл 1 М Трис, рН 8,5; 0,264 г сульфата аммония; 10 мкл 0,1 % Твин-20; 0,02 г БСА; бидистилированной воды до 10 мл, рН 8,5. в «АмплиСенс-100»:
ГЩР-смесь-1 (праймеры и нуклеотиды) - 50 мкл; ПЦР-смесь-2 (буфер и Taq-полимераза) - 11 мкл; воск для ПЦР - 15 мкл; ПКО (положительный контрольный образец) - 10 мкл. В каждую пробирку, включая положительный и отрицательный контроли, вносили по 15 мкл реакционной смеси и наслаивали на поверхность 30 мкл минерального масла. В соответствующие пробирки под масло вносили по 10 мкл ДІЖ В. abortus шт. № 19 и 9 мкл дистилированной воды. В пробирку для отрицательного контроля вносили 10 мкл дистилированной воды.
Использование ПЦР в комплексе с серологическими реакциями (РА, РСК)
С момента открытия бруцелл Брюсом (1887) и Бангом (1897) произведено колоссальное количество исследований в разных странах и изучен широкий перечень вопросов, относящихся к бруцеллезу животных. Однако и в наши дни эта хроническая инфекционная болезнь представляет большую проблему глобального масштаба и для органов здравоохранения и для ветеринарных специалистов.
Первые сведения о бруцеллезе сельскохозяйственных животных в России относятся к 1860 году, когда в Московской губернии отмечались массовые случаи «повального выкидыша» у коров. Проведенный ретроспективный анализ имеющихся эпизоотологических данных показал, что в появлении и распространении бруцеллеза в нашей стране основную роль сыграл импорт племенного скота из стран Западной Европы -Голландии, Дании и Германии [Урбан В.П. с соавт., 1980]. Каких-либо специальных мер борьбы с бруцеллезом в то время не существовало, единственный способ диагностики - регистрация факта аборта. Примечательно, что самих животных после выкидыша считали выздоровевшими.
В настоящее время бруцеллез сельскохозяйственных животных на территории РФ распространен почти повсеместно. Очаги бруцеллеза регистрируются на Крайнем Севере, в зоне промышленного оленеводства [Калиновский А.И. с соавт., 1997], в Нечерноземье, Сибире, Дальнем Востоке, Поволжье и юге России [Димов С.К., 1980; Желудков М.М. с соавт., 1997]. Спектр возбудителей энзоотии бруцеллеза, протекающих в данных регионах, представлен В. melitensis, В. abortus, В. suis, В. ovis и в отдельных случаях В. canis.
Основу борьбы с бруцеллезом составляют плановые предупредительно-профилактические мероприятия. Их важными составляющими являются лабораторные методы диагностики инфекции и контроля эпизоотического статуса поголовья. Поэтому успех в ликвидации очага бруцеллеза во многом определяется качеством применяемых диагностических тестов, главными критериями которых являются специфичность, высокая чувствительность и эффективность. Строгое соблюдение этих условий может гарантировать выявление всех инфицированных животных. К сожалению, в арсенале ветеринарных лабораторий на данный момент нет таких методов, которые бы в полной мере сочетали в себе приведенные выше требования. Это объясняется многими факторами и, прежде всего, принципиальными особенностями применяемых диагностических подходов, ограничивающими их возможности, а также чрезвычайной «пластичностью» возбудителя (наличие S-, R-, SR-, L-, М-форм), медленным ростом на питательных средах, перекрестными серологическими реакциями с большим количеством микроорганизмов [Вершилова П.А., 1972; Триленко П.А., 1980; Соколова Е.Е., 1986].
В последнее время наблюдается интенсивное развитие ДНК-технологий, объективными причинами которого стали революционные открытия в области молекулярной биологии и генной инженерии (Стент Г., 1974). Это обусловило возникновение нового направления в лабораторной методологии - генодиагностики инфекционных болезней. Принцип генетической диагностики заключается в определении различными способами специфичного для искомого микроорганизма участка нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК). Основными направлениями генодиагностики являются ДНК-зондирование и методы амплификации нуклеиновых кислот.
Наибольшее распространение из них получила полимеразная цепная реакция. Техника постановки ПЦР относительно доступна и вместе с тем обеспечивает достаточно высокие эффективность, специфичность и чувствительность анализа. Продолжительное время ПЦР оставалась прерогативой научно-исследовательских лабораторий и институтов. Применение этого метода в ветеринарной практике носило единичный характер [Шумилов К.В. с соавт., 1996]. В 1995 году ситуация коренным образом изменилась с выходом приказа МСХ и П № 350, направленного на интенсивное внедрение ПЦР в ветеринарию.
На данный момент полимеразная цепная реакция разработана для детекции у животных Mycobacterium spp., Chlamidia spp., Salmonella, Listeria monocytogenes, Y. enterocolitica, Micoplasma spp., Campilobacter jejuni, Lyssavirus и в том числе для обнаружения Brucella spp. Применение ПЦР позволило обеспечить эффективную детекцию бруцелл с чувствительностью ІхІОМхЮ3 м.к./мл в различном материале, независимо от степени диссоциации возбудителя, а также исключить ложноположительные результаты реакции в присутствии Y. enterocolitica 0:9, Е. coli 0:157 и других микроорганизмов, имеющих общие с бруцеллами антигенные детерминанты.
Наиболее перспективной нуклеотидной последовательностью для конструирования ПЦР-тест-систем в целях детекции бруцелл является ген, кодирующий белок наружной мембраны молекулярной массой 31 кДа. Примером использования выше названной последовательности в качестве ДНК-мишени является ПЦР-тест-система для выявления Brucella spp. («Ген-Бру»), которая была разработана в РосНИПЧИ «Микроб». Тест система включает амплификацию специфичного фрагмента ДНК размером 175 п.н. двумя парами праймеров (Вш 31- Вш 32, Bru 3 - Вш 4) по типу nested-ПЦР. Универсальный способ выделения ДНК гуанидинтиоционатом, сочетающий нуклеосорбцию на силикагеле, позволяет исследовать разнообразный клинический материал, пищевые продукты и объекты внешней среды.
Изучение диагностической чувствительности ПЦР при исследовании сыворотки крови и цельной крови у больных и иммунизированных против бруцеллеза животных
Огромный интерес для ветеринарных специалистов представляют исследования направленные на решение проблемы дифференциации иммунизированных живыми противобруцеллезными вакцинами (из штамма № 82 и др.) животных от естественно инфицированных, так как применяемые в данный момент иммунобиологические методы в большинстве своем не дают такой информации. Ситуация несколько изменилась с внедрением в практику реакции иммунной диффузии (РИД) с О-ПС антигеном. Но эффективность этого метода к сожалению оказалась ниже таковой, чем у комплекса РА и РСК.
Учитывая выше изложенное, нами были проведены исследования, определяющие возможность применения тест-системы «Ген-Бру» при обследовании вакцинированного против бруцеллеза поголовья. Установлено, что ДНК бруцелл при анализе в ПНР крови иммунизированных животных выявляется на всем протяжении времени от первичной вакцинации (в 18,7 %) и спустя 2 года после ревакцинации (в 10 % случаев). Наибольшая частота положительных результатов ПЦР отмечалась через 25 суток после введения вакцины (1 вакцинация - 42,8 %, 2 вакцинация - 55,5 %). Полученные в ходе этого исследования данные полностью совпадают с наблюдениями некоторых авторов [Падалица А.Г., 1983; Муллакаев О.Т. с соавт., 2001], которые отмечали возможность длительной персистенции диссоциированных вакцинных штаммов, в том числе и шт. № 82.
Для установления с помощью ПЦР возможных различий между инфекционным и иммунным процессами провели анализ крови и сыворотки крови на наличие ДНК бруцелл от зараженных B.melitensis шт. № 565 и привитых В.abortus шт. № 82 морских свинок. Материал исследовали на 25 сутки, с расчетом на то, что в эти сроки вероятнее всего наступит генерализованная инфекция (в первом случае) и явление бактериемии (в обоих случаях) [Здродовский П.Ф., 1948; Вершилова П.А. с соавт., 1974]. Сопоставление результатов ПЦР-анализа крови и сыворотки крови от двух групп животных показало, что, во-первых, исследование крови было предпочтительным при инфекционном процессе (87,5 % положительных проб), а при иммунной перестройке статистически достоверной разницы в вероятности обнаружения ДІЖ бруцелл в крови и сыворотки крови не установлено (21,4 % и 35,7 % соответственно). Во-вторых, частота обнаружения специфической ДНК в крови инфицированных животных оказалась в 4 раза выше, чем у иммунизированных морских свинок. Это может отражать интенсивность процесса взаимоотношений макро- и микроорганизма. Наиболее динамично, как правило, развивается процесс инфицирования организма.
Таким образом, уровень распределения ДНК бруцелл вирулентного и вакцинного штаммов в компонентах крови отражает степень завершения фагоцитоза. Как известно, при инфекционном процессе, вызванном бруцеллами, имеет место незавершенный фагоцитоз [Вершилова П.А. с соавт., 1974]. Это означает, что основная масса бруцелл будет находиться в полиморфноядерных лейкоцитах и нейтрофилах, следовательно и наивысшая результативность ПЦР будет наблюдаться при исследовании материала, богатого этими клеточными элементами (в данном случае -крови). При попадании в организм слабовирулентных и вакцинных штаммов бруцелл фагоцитоз обычно завершается лизисом микробных клеток. Поэтому основная масса бруцелл в этом случае будет находиться в свободном состоянии, а в фагоцитах - лишь остаточное количество еще не разрушенных клеток. На первый взгляд это обстоятельство должно обусловливать высокую диагностическую ценность сыворотки крови по сравнению с цельной кровью. На самом деле результаты наших исследований показали, сыворотка крови и кровь иммунизированных морских свинок при ПЦР-анализе были равнозначны, поскольку сыворотка является одним из компонентов крови. Именно ее наличие и определило выявление в большинстве случаев ДНК бруцелл в крови. Это еще раз доказывает факт «универсальности» образцов крови как диагностического материала. Уровень распределения ДНК бруцелл, выявляемый в ПЦР, косвенно свидетельствует о завершении фагоцитоза, а определение частоты выявления специфического фрагмента в реакции при исследовании крови показывает интенсивность инфекционного процесса.
Полученные таким образом данные могут быть использованы при интерпретации результатов ПЦР-анализа и разработке схемы дифференциации поствакцинального процесса от инфекции.
Для определения диагностической точности ПЦР в общей схеме лабораторной диагностики бруцеллеза животных было актуальным сравнить эффективность тест-системы «Ген-Бру» и традиционных методов иммуноанализа (РА, РСК). С этой целью мы провели исследования ПО сывороток крови, полученных от не иммунизированного противобру-целлезными вакцинами крупного рогатого скота неблагополучных по бруцеллезу хозяйств. Наибольшее количество животных больных бруцеллезом выявлено в ПЦР - 12 (10,9 %). Данные РА и РСК полностью совпадали с результатами в ПЦР, в то время, как применение ПЦР позволило обнаружить дополнительно 6 (50 %) инфицированных животных.
