Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Неинвазивные скрининговые методы в пренатальной профилактике СД 17
1.2 Скрининг по материнскому возрасту 18
1.3 Биохимический скрининг по материнским сывороточным маркерам 21
1.3.1 Альфа-фетопротеин 21
1.3.2 Хорионический гонадотропин человека 23
1.3.3 Другие сывороточные маркеры 25
1.3.4 Факторы, влияющие на чувствительность и специфичность материнского сывороточного скрининга 28
1.4 Ультразвуковой скрининг 29
1.5 Комбинированный скрининг 35
1.6 Расчет риска СД у плода 36
1.7 Автоматизированные программы расчета риска синдрома Дауна 38
Глава 2. Материалы и методы 42
2.1 Характеристика обследуемой группы 42
2.2 Материал для исследования 42
2.3 Аналитические методы определения концентраций АФПиХГЧ 43
2.4 Ультразвуковое исследование плода 44
2.5 Пренатальная цитогенетическая диагностика 44
2.6 Статистическая обработка данных 45
Глава 3. Результаты и обсуждение 47
3.1. Создание базы данных по результатам обследования беременных женщин во втором триместре беременности..47
3.1.1 Оценка возрастного риска СД 47
3.1.2. Анализ понедельных уровней сывороточных маркеров...49
3.1.3. Анализ влияние веса женщины на концентрации сывороточных маркеров 52
3.2 Анализ информативности использования АФП и ХГЧ в
скрининге на СД 56
3.2.1. Анализ диагностической значимости сывороточных маркеров 59
3.2.2. Анализ распределения значений сывороточных маркеров 61
3.3 Ультразвуковое исследование плода 66
3.4. Алгоритм оценки индивидуального риска СД и правила формирования решения о зачислении женщины в группу «высокого» риска по СД у плода 74
3.5. Результаты использования компьютерной программы расчета риска СД у плода «Прогноз» 78
4.3аключение 88
5. Выводы 90
Приложение 1. Основные математические закономерности 91
Приложение 2. Структура и основные функциональные возможности программного комплекса «ПРОГНОЗ» 94
6. Список работ, опубликованных по теме диссертации 99
7. Список литературы
- Неинвазивные скрининговые методы в пренатальной профилактике СД
- Факторы, влияющие на чувствительность и специфичность материнского сывороточного скрининга
- Аналитические методы определения концентраций АФПиХГЧ
- Результаты использования компьютерной программы расчета риска СД у плода «Прогноз»
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Синдром Дауна (СД) - наиболее частое генетическое заболевание среди новорожденных, которое возникает в подавляющем числе случаев спорадически. Средняя популяционная частота СД среди новорожденных составляет 1:700. Это социально значимое заболевание, неподдающееся лечению или постнатальной коррекции, представляет большую проблему для семьи и общества в целом. До 40% коечного фонда в домах ребенка и в домах инвалидов занимают пациенты с синдромом Дауна.
Главной особенностью СД является преимущественное возникновение большинства случаев заболевания (до 80% среди всех случаев СД) в результате спорадических de novo мутаций в половых клетках родителей (нерасхождение хромосом в одном из делений мейоза, чаще всего - в процессе оогенеза). И лишь незначительная часть случаев СД -результат несбалансированного варианта хромосомной семейной перестройки (так называемая транслокационная форма СД в семьях с носительством робертсоновских транслокаций).
Для таких заболеваний, как СД, возникающих в основном спорадически и с высокой популяционной частотой, в настоящее время реальным путем снижения рождения больных детей является проведение безвыборочного обследования всех беременных женщин региона (города, области и т.д.) с помощью неинвазивных скрининг-тестов. При этом следует учитывать, что любые тесты, используемые при скрининге, не являются диагностическими. При их использовании формируется лишь группа "высокого" риска, требующая следующего диагностического этапа подтверждения патологии. Так, при неинвазивном скрининге среди беременных женщин формируется группа "высокого" риска по СД у плода. Пациентам, вошедшим в группу риска, рекомендуется инвазивная диагностическая процедур для подтверждения или исключения данной патологии при цитогенетическом исследовании клеток плода. Особенно целесообразно обследование неинвазивными методами беременных женщин молодого возраста (до 35 лет), так как, во-первых, они составляют
основную выборку беременных и, соответственно, наибольшее количество детей с СД рождается молодыми женщинами, во-вторых, они, не входя в возрастную группу риска, не попадут в сферу внимания медицинских генетиков по поводу их возрастного риска.
Формировать показания для инвазивной процедуры и цитогенетического исследования плода необходимо с учетом как генетического, так и акушерского риска пациентки, сопровождающего инвазивное вмешательство. Риск инвазивной процедуры в любой срок беременности не должен превышать генетический риск заболевания у плода.
В настоящее время в качестве эффективной профилактики рождения детей с СД в клинической практике используются два неинвазивных скрининга беременных: биохимический анализ сывороточных маркеров, в основном иммуиммуноферментный анализ (ИФА) сыворотки женщин и ультразвуковое исследование (УЗИ) плода. Массовый охват беременных женщин этими обследованиями позволяет обоснованно сформировать среди них группы "высокого" риска и своевременно направить женщин, попавших в группу риска, на пренатальную цитогенетическую диагностику. До недавнего времени в клинической практике оба скрининговых метода обычно использовались во II триместре - в сроке 16-21 неделя беременности. Интерпретация результатов скринингового обследования базируется на показаниях уровней исследуемых сывороточных маркеров и данных УЗИ плода.
Часто в качестве биохимических скрининг-тестов используются уровни сывороточных маркеров (СМ) - альфа-фетопротеина (АФП), хорионического гонадотропина человека ( общего ХГЧ или свободной р-субъединицы ХГЧ) и неконъюгированного эстриола (нЭ). Эти гормоны и белки имеют плодное происхождение, попадают в кровь матери через плаценту и в основном отражают состояние плода. Было показано, что по мере развития беременности концентрации этих маркеров меняются. Каждый из них имеет определенные границы "понедельных" (базовых) уровней при нормально развивающейся беременности здоровым плодом.
В целях более корректного отображения концентрации СМ количественная оценка их концентраций (уровней в конкретный срок беременности) в исследуемых образцах сыворотки должна быть соотнесена к медиане уровня маркера в материнской сыворотке в соответствующий срок беременности здоровым плодом и выражена в МоМ (multiple of median).
На большом клиническом материале показано, что в большинстве случаев (примерно в 60% случаях болезни плода) при СД у плода уровни исследуемых СМ в материнской сыворотке статистически значимо отличаются от таковых при здоровом плоде: уровни АФП и нЭ - снижены, а уровень ХГЧ - повышен. Исследование уровней СМ в качестве самостоятельного неинвазивного метода в пренатальной диагностике СД имеет в развитых странах широкое распространение и часто обозначается как "биохимический скрининг на синдром Дауна".
Из-за недостаточной специфичности данных СМ выявляемость СД у плода при использовании результатов биохимического скрининга в качестве единственного критерия при формировании группы риска во II триместре беременности составляет не более 60-65% (соответственно, "detection rate" метода ИФА соответствует 60%-65%). Это обусловлено тем, что не все случаи СД у плода сопровождаются указанными отклонениями уровней СМ. С другой стороны, отклонения уровней СМ могут наблюдаться при различной акушерской патологии, сопровождающей настоящую беременность. Они могут отклоняться в результате нарушения проницаемости плаценты и при различных формах состояния угрозы прерывания беременности. К тому же отклонения могут быть генетически детерминированными при здоровом плоде.
Тем не менее, даже такая, казалось бы, невысокая выявляемость СД, которая достигается при использовании одного сывороточного скрининга беременных, широко используется в клинической медико-генетической практике. Для его массового использования разработаны стандартизованные наборы реактивов (тест-системы ИФА), и этим
безопасным методом могут быть обследованы большие выборки беременных.
Эффективность биохимического скрининга может быть повышена с увеличением количества СМ, использованных при скрининге. Чаще всего в клинической практике при неинвазивном биохимическом скрининге используют два СМ (АФП и ХГЧ), оптимальным же считается использование трех СМ (АФП, ХГЧ, нЭ).
В настоящее время аргументированных объяснений причины отклонения СМ в крови матери при беременности плодом с СД нет. Высказываются лишь предположения о том, что при СД у плода нарушается функция плаценты в целом, приводящая к нарушению проницаемости плаценты, и как следствие - к изменению концентрации СМ, транспортируемых через плаценту или синтезируемых в самой плаценте. Высказывается предположение о компенсаторной гиперфункции плаценты при СД или об угнетении первичного синтеза АФП печенью больного плода.
Большая роль в пренатальном обследовании плода отводится современному методу ультразвукового исследования (УЗИ). По сути дела генетическое УЗИ плода позволяет судить о фенотипе плода, что очень важно при диагностике врожденных и наследственных заболеваний, сопровождающихся анатомическими отклонениями или пороками развития, к каким относится СД. Клинический полиморфизм СД обуславливает наличие у пациентов с СД в постнатальном периоде целого ряда характерных черт у пробандов, при отсутствии, как правило, грубых пороков развития (за исключением пороков сердца, отмеченных примерно у 40% пациентов с СД). При современном развитии УЗ-аппаратуры и квалификации врачей ультразвуковой диагностики появляется возможность проведения детального УЗИ плодов в различные сроки беременности и выявления даже незначительных отклонений в их развитии.
При интерпретации результатов материнского сывороточного скрининга необходимы данные УЗИ плода, которые отражают не только
объективный срок беременности на момент взятия крови (что само по себе очень важно для корректного расчета уровней СМ), но также наличие или отсутствие акушерских осложнений, пороков развития или отклонений в развитии у плода.
Информация УЗИ плода очень важна при интерпретации результатов скринингового обследования, т.к. многие наследственные синдромы, в том числе СД, сопровождаются, как правило, фенотипическими отклонениями у плода, различимыми при УЗИ. При этом во II триместре беременности у плодов с СД (так же как у пациентов в постнатальном периоде) редко отмечаются грубые пороки развития, но гораздо чаще выявляются в различном сочетании так называемые "УЗ-маркеры СД". Большой научно-практический интерес представляет как само изучение фенотипических отклонений, выявляемых у плодов с СД во II триместре, так и возможность использования этих данных при осуществлении скрининговых обследований беременных.
При других хромосомных аберрациях у плода при УЗИ во II триместре, как правило, выявляются различные пороки или отклонения в развитии, которые обычно более выраженные и более грубые, чем при СД, и присутствуют у плода часто в сочетанном виде, в комплексе множественных врожденных пороков развития (МВПР). Выявление у плода МВПР, диагностированных при УЗИ, также являются показанием для проведения инвазивных диагностических процедур и цитогенетического исследования плода. В этих случаях цитогенетический анализ плода является методом дифференциальной диагностики патологического состояния плода, т.к. для точного синдромального диагноза плода с МВПР прежде всего важно установить этиологическую причину пороков развития - хромосомную или нехромосомную.
Таким образом, становится очевидным, что путь повышения выявляемости СД у плода, это путь совместного использования результатов неинвазивных скрининговых обследований беременных - как биохимического, так и ультразвукового в оптимальные сроки. Как и другие методы скринингового исследования, и ИФА сыворотки беременных, и
УЗИ плода являются не диагностическими методами, а вероятностными. Однако, совместное использование результатов этих двух методов, проведение так называемого "КОМБИНИРОВАННОГО" скрининга позволяет надеяться, что диагностические возможности его окажутся выше, чем каждого из них в отдельности.
Для объективизации результатов обследования беременных женщин и повышения выявляемости СД у плода в настоящее время разработаны автоматизированные компьютерные программы расчета индивидуального риска СД у плода на основании анализа различных данных пациенток. При использовании определенных границ риска, заложенных в программу, среди обследованных женщин автоматически формируется "скрининг-положительная" группа (группа риска), направляемая на инвазивные процедуры. Как правило, эти компьютерные программы зарубежных фирм позволяют рассчитывать комбинированный риск СД у плода во II триместре на основании возраста женщин, срока беременности и уровней СМ, и не учитываются при расчете риска данные УЗИ плода. Кроме того, эти программы англоязычные, "закрыты", т.е. в них заложены недоступные для пользователей базы данных, собранные при обследовании беременных женщин зарубежных государств, и, как правило, очень дороги.
Разработка и внедрение современных автоматизированных подходов при осуществлении неинвазивной пренатальной профилактики СД в клиническую практику с программным обеспечением исследования позволяет оптимизировать и значительно повысить эффективность профилактики рождения детей с СД.
Цель работы
Целью настоящего исследования является создание компьютерной автоматизированной программы расчета индивидуального
комбинированного риска синдрома Дауна у плода на основании результатов биохимического и ультразвукового скрининга во втором триместре беременности, данных о возрасте, весе и срока беременности
пациентки, а также оценка эффективности выявления СД у плода при использовании данной программы.
Задачи исследования.
1. Сформировать 2 репрезентативные выборки беременных женщин - со здоровым плодом и с плодом с СД.
2. Определить понедельные базовые уровни (медианы) значений сывороточных маркеров (СМ): АФП и ХГЧ среди женщин с нормальным исходом беременности для последующего перехода к безразмерным единицам измерения концентрации АФП и ХГЧ в МоМ.
3. Оценить влияние веса беременной женщины на уровни СМ при пересчете концентраций сывороточных маркеров в условных единицах -МоМ - для повышения точности исследования.
4. Оценить диагностическую значимость СМ в скрининге на СД у плода, проанализировать статистические закономерности распределения их концентраций в исследуемых группах беременных женщин.
5. Сформировать "ядро" УЗ-маркеров, наиболее часто встречающихся при СД у плода, оценить их значимость и частоты распределения в исследуемых группах беременных женщин.
6. Разработать алгоритм оценки риска СД, на основе сформированных функций плотности распределения значений концентраций АФП и ХГЧ и частот УЗ-маркеров.
7. Оценить пороговое значение риска, превышение которого с достаточной степенью достоверности указывает на высокий риск СД у плода.
8. Провести имитационное моделирование разработанного алгоритма на выборке обследованных женщин для оценки достоверности диагностического прогноза СД у плода.
Научная новизна и практическая значимость работы
В процессе данной работы впервые создана русскоязычная компьютерная программа расчета индивидуального риска СД у плода, в
которой впервые объединены результаты двух неинвазивных пренатальных скринингов беременных: биохимического скрининга на сывороточные маркеры (АФП и ХГЧ) с коррекцией их уровней на возраст, вес и срок беременности пациентки и ультразвукового скрининга плода. Подобный подход позволил достичь эффективности выявления плодов с СД (detection rate) во II триместре беременности до 87.2% при 5.5% уровне ложноположительных результатов.
Впервые была оценена и выражена в цифрах риска значимость отдельных УЗ-маркеров, выявленных у плодов с СД.
Это первая русскоязычная программа, разработанная с учетом специфики наблюдения беременных женщин в медико-генетических учреждениях России. Программа позволяет на основании
индивидуального риска беременных женщин, прошедших обследование, обоснованно сформировать группу "высокого" риска и рекомендовать проведение инвазивных процедур и цитогенетического исследования плода.
В процессе работы на большой выборке образцов сывороток беременных женщин во II триместре (с известными исходами родов здоровым ребенком) были рассчитаны "понедельные" значения медиан для АФП и ХГЧ. Полученные базовые уровни могут быть использованы региональными МГК при инициации скрининговых обследований беременных. Математическая модель, основанная на формуле Байеса, позволила при расчете риска использовать как количественные (концентрации АФП и ХГЧ, возраст женщины, срок беременности), так и качественные (данные УЗИ) признаки. Это обеспечило высокую точность оценки индивидуального риска синдрома Дауна у плода даже на ограниченной выборке пациентов.
При создании автоматизированной программы определена граница риска (cut off), отражающая такое значение риска, при котором совокупная вероятность как ложноотрицательного, так и ложноположительного диагнозов была минимальной. Рассчитанное значение для исследуемой
выборки пациентов составляет 1:220; при этом уровень ложно-положительных результатов не превышает 5.5%.
Для подтверждения достоверности оценок риска было проведено имитационное моделирование разработанного алгоритма на обширной выборке женщин, прошедших обследование на наличие СД у плода во II триместре. Программа позволяет с одной стороны повысить эффективность выявления синдрома Дауна у плода до 87.2%, и с другой стороны - избежать необоснованных инвазивных процедур женщинам, не попавшим в группу риска.
Положения выносимые на защиту.
1.Сформированы 2 базы данных по лабораторному (по понедельным нормам уровней сывороточных маркеров АФП и ХГЧ) и функциональному (УЗИ плода) обследованию женщин во II триместре беременности при здоровом плоде и при СД у плода.
2.Проведен анализ частот встречаемости УЗ-маркеров по двум исследуемым группам. Выявлено 20 УЗ-маркеров характерных для плодов с СД.
3.Разработан математический алгоритм расчета комбинированного риска СД у плода с учетом данных о возрасте пациентки, об уровнях АФП и ХГЧ, с коррекцией на вес женщины, и данных УЗИ плода.
4.С использованием полученных статистических закономерностей создана автоматизированная программа «Прогноз» расчета комбинированного риска СД у плода.
5.Оценена эффективность выявления СД у плода при использовании созданной программы в ретроспективном и проспективном исследовании.
Неинвазивные скрининговые методы в пренатальной профилактике СД
Группы риска по рассматриваемой частой патологии, в нашем случае по СД у плода, в некоторых случаях могут быть определены в популяции при медико-генетическом консультировании семей до беременности. Обычно рекомендации на пренатальную диагностику кариотипа плода получают женщины старшего репродуктивного возраста, семьи с носительством сбалансированной хромосомной аберрации у одного из супругов, а также семьи, где ранее имелось рождение ребенка с СД.
Связь частоты рождений детей с синдромом Дауна с увеличением возраста матери была отмечена задолго до того, как стала известна хромосомная природа этого заболевания [41]. Кроме того, у женщин старшего репродуктивного возраста чаще, чем в общей популяции отмечены репродуктивные потери в виде спонтанных прерываний беременности, мертворождений и рождений детей с пороками развития [55, 150].
Согласно теории, предложенной P. Polani [106], у женщин старшего репродуктивного возраста повышена частота образования ооцитов с хромосомным дисбалансом, обусловленная тем, что в половых клетках женщины в процессе жизни под воздействием неблагоприятных факторов внешней среды происходит постепенное накопление различных нарушений, и в первую очередь, повреждений элементов митотического веретена, ответственного за расхождение хромосом при делении клетки. Ооцит, с незавершившейся профазой І мейоза в гонадах плода, с внутриутробного периода развития до момента наступления овуляции, является "клеткой-мишенью" для различных повреждающих агентов.
Поэтому, наиболее частым видом хромосомных нарушений у плодов женщин старшего возраста являются числовые аберрации хромосом в виде аутосомных моносомий и трисомий, а также Х-хромосомной анеуплоидии и неспецифической гиперплоидии [57].
В первоначальных исследованиях предельным возрастом матери для направления беременных на ПД считали 40 лет, но в последствии, с развитием лабораторной пренатальной службы, возрастная граница была поднята до 38 лет, а в странах с достаточным экономико-социальным развитием предельным возрастом считается в настоящее время 36 лет [53].
Возраст-зависимые риски рождения ребенка с СД для индивидуальных материнских возрастов собраны в больших опубликованных исследованиях. Значения рисков несколько варьируют для каждого возраста в зависимости от величины выборки, сохраняя тенденцию увеличения от 1% для женщин 36 лет до 6-7% для женщин 45 лет [122, 88].
Как скрининговый тест, возраст матери удовлетворяет критериям простоты и приемлемости для пациентов, т.к. он зависит скорее от знания возрастного порога, чем расчета и интерпретации специфического риска. Однако такой метод скрининга мало эффективен, так как при использовании возрастной границы в 36 лет в группу риска попадает лишь около 7% популяции беременных женщин. При этом чувствительность теста составит не более 30 % , что отражает ту часть аутосомосомных трисомий плода, которые могут быть внутри этой возрастной группы. Предсказательная ценность возрастного теста так же низка, так как только один плод с хромосомной аномалией может быть обнаружен при проведении 125 диагностических процедур женщинам старшего возраста. При минимальном риске процедуры в 1-1,5%, примерно один нормальный плод будет потерян из-за риска инвазивной процедуры, на каждый обнаруженный плод с хромосомной аномалией. Этот скрининговый метод оказывает малое влияние на снижение рождений детей с СД или другими хромосомным анеуплоидиями, так как женщины моложе 36 лет, составляющие основную часть беременных и рождающие до 70-80% детей с СД, не будут охвачены предлагаемым обследованием.
Как показали исследования Milunsky [87], посвященные изучению происхождения дополнительной хромосомы у пробанда в случаях трисомий у плода, по крайней мере, в 75-80% случаев СД она имеет материнское происхождение. Наличие хромосомной патологии у предыдущего ребенка обычно не являются причиной серьезного беспокойства родителей в отношении повторного риска рождения ребенка с той же хромосомной патологией, составляя примерно 1% повторного риска.
Что касается влияния возраста отца на частоту рождения ребенка с СД, то немногочисленные исследования, посвященные данной проблеме, противоречивы [129, 42, 72, 77].
В практике работы медико-генетических консультаций имеется достаточное количество наблюдений, когда у родителей с нормальным кариотипом, определенном в культуре лимфоцитов периферической крови, наблюдаются повторные случаи рождения ребенка с хромосомной аберрацией.
Факторы, влияющие на чувствительность и специфичность материнского сывороточного скрининга
Каждая беременность представляет собой сложную динамическую систему взаимоотношений между матерью и плодом. Уровни СМ при нормально протекающей беременности характеризуются значительной индивидуальной вариабельностью. К тому же концентрации СМ значительно изменяются по мере развития беременности. Для минимизации вариабельности маркеров индивидуальное значение концентрации данного маркера соотносят со значением базового уровня рассчитанного для конкретного (понедельного) срока беременности. Значения понедельных базовых уровней СМ принято представлять в виде медианы. Медиана относится к классу структурных средних и, в отличие от средней арифметической, на нее гораздо меньшее влияние оказывает увеличение числа наблюдений или резко отличающиеся крайние значения. Для получения достаточно точного значения медианы рекомендуется проанализировать не менее 100 образцов материнской сыворотки на каждую неделю беременности. Частное от деления индивидуального значения маркера на значение базового уровня принято выражать в МоМ (от английского multiple of the median).
Было отмечено, что уровень СМ в среднем уменьшается с увеличением веса матери. Наиболее вероятным объяснением этого эффекта является предположение, что для данного срока гестации продукция этих маркеров является величиной относительно постоянной. И при попадании в кровоток матери они оказываются в большем разведении. [73]
Кроме того, как было указано выше, на уровень СМ на уровень сывороточных маркеров оказывают влияние такие факторы, как наличие у плода пороков ЦНС, мочевыводящей системы, низкая масса тела плода, маловодне и различные акушерские осложнения беременности. Все это затрудняет однозначную интерпретацию отклонений уровней материнских сывороточных маркеров при проведении неинвазивного сывороточного скрининга и для эффективного выявления патологии у плода требует привлечения в качестве скрининг-тестов иных показателей.
Самое широкое распространение среди неинвазивных методов в ПД приобрело ультразвуковое исследование (УЗИ) плода. Имеются многочисленные публикации, посвященные детальному изучению биометрических эхографических показателей нормально развивающегося эмбриона и плода в различные сроки беременности [10, 5, 113]. В результате этих разработок фетометрических показателей нормально развивающегося плода в настоящее время большинство наследственных заболеваний, сопровождающихся анатомическими отклонениями или пороками развития, могут быть распознаны задолго до рождения ребенка. С помощью ультразвуковой диагностической аппаратуры, работающей в реальном масштабе времени, стало возможным не только диагностировать до 90% грубых пороков развития (ПР) практически всех систем и органов плода, но и детализировать вид ПР конкретного органа [9, 118, 110, 134]. Перечень диагностируемых ПР плода благодаря совершенствованию ультразвуковой аппаратуры и датчиков все более расширяется, и становится возможным распознать некоторые из них уже в I триместре беременности [132,133,130]. Основную же информацию по выявлению ПР у плодов дает УЗИ во II триместре беременности, когда основные системы и органы плода уже сформированы и функционируют.
В некоторых случаях УЗИ позволяет непосредственно установить диагноз ПР, в частности при пороках центральной нервной системы. Но чаще эхографическое исследование служит методом предварительного отбора пациенток для дальнейшего генетического обследования, и в первую очередь для цитогенетического исследования плода. Известно, что хромосомные болезни человека являются самыми частыми в популяции новорожденных и, как правило, сопровождаются множественными врожденными пороками развития (МВПР) со значитель но выраженным клиническим полиморфизмом. В этих случаях диагностика ВПР при эхографическом исследовании плодов позволяет сформировать среди беременных группы "высокого" риска по наличию у плода хромосомных аберраций [60, 100, 66,112].
В настоящее время появляется все больше работ, посвященных как отдельным сообщениям о внутриутробной диагностике хромосомных аберраций, сопровождающихся комплексом ультразвуковых (морфологических) маркеров у плода, так и попытке систематизировать эхографи-ческие отклонения, свойственные конкретным хромосомным синдромам [20,21,30].
По данным Benacerraf В. [21], по специфической эхографической картине (наличию комплекса грубых ПР) возможно выявление подавляющего числа случаев трисомии-13 и трисомии-18 у плода. Чувствительность же УЗИ в отношении распознавания СД у плода несколько ниже и варьирует от 40% до 80%. В работах Rizzo N. с соавторами [112] и Gagnon S. с соавторами [59] показано, что у плодов с СД, как правило, отсутствуют грубые ПР, а морфологическая патология представлена средней или незначительной степенью выраженности, что создает дополнительные трудности ее выявления при массовых УЗИ. Для клинической генетики большой интерес представляет анализ данных по изучению УЗ-маркеров, встречающихся у плодов с СД и другой хромосомной патологией в различные периоды онтогенеза, которые могут служить прогностическими критериями при скрининговом УЗИ беременных женщин. Изучению специфики эхографических маркеров хромосомной патологии у плода посвящается большое количество исследований, основанных на УЗ-скрининговом обследовании беременных [8, 120, 50, 29, 96].
Аналитические методы определения концентраций АФПиХГЧ
Концентрацию АФП и ХГЧ определяли методом лантанидного флюоресцентного иммуного анализа с разрешением по времени (тест-системы Дельфия .Wallac Оу, Perkin Elmer).
Определение ХГЧ основано на твердофазном, дву-сайтовом флюоресцентном иммунометрическом аналезе, при котором два моноклональных антител (мышиного происхождения) взаимодействуют с двумя различными антигенными детерминантами молекулы ХГЧ. Молекулы ХГЧ, содержащиеся в стандартах, контролях и образцах пациентов, сначала реагируют с иммобилизованными моноклональными антителами к специфическому антигенному сайту на бета-субъединице ХГЧ. Меченные европием антитела к специфическому сайту на альфа-субъединице в дальнейшем реагируют с интактной молекулой ХГЧ, уже связанной с сорбированным на твердой фазе антителом. Усиливающий раствор диссоциирует ионы европия из меченого антитела в раствор, где они формируют высокофлюоресцентные хелатные комплексы с компонентами усиливающего раствора. Интенсивность флюоресцентного сигнала пропорциональна количеству ХГЧ в образце.
Определение АФП основано на твердофазном, двух-сайтовом флюоресцентном иммунометрическом анализе, при котором два моноклональных мышиных антител взаимодействуют с двумя различными антигенными детерминантами молекулы АФП. Определение проводили с использованием одной инкубации. При этом содержащиеся в стандартах, контролях и образцах пациентов молекулы АФП, одновременно реагируют с иммобилизированными моноклональными антителами к специфичному антигенному сайту молекулы АФП. Меченные европием моноклональные антитела взаимодействуют с другой частью молекулы АФП.
Усиливающий раствор диссоциирует ионы европия из меченого антитела в раствор, где они формируют высокофлюоресцентные хелатные комплексы с компонентами усиливающего раствора. Интенсивность флюоресцентного сигнала пропорциональна количеству АФП в образце.
Ультразвуковое исследование проводилось сотрудниками лаборатории пренатальной диагностики МГНЦ РАМН, сотрудниками городского Центра пренатальной диагностики на базе клинического родильного дома № 27 и других учреждений г. Москвы. При проведении ультразвукового исследования производилась расширенная фетометрия с измерением копчико-теменного расстояния, бипариетального лобно затылочного размера, окружности головы плода, диаметра грудной клетки, брюшной полости, размеров длинных трубчатых костей плода, интра- и экстраорбитального размеров, поперечного размера мозжечка.
Производилась детальная оценка доступных визуализации анатомических структур плода с проведением при необходимости дополнительных измерений: размеров желудочков, большой цистерны головного мозга, размеров всех внутренних органов и полостей. При оценке соответствия полученных фетометрических данных сроку беременности использовались фетометрические таблицы, разработанные отечественными [5, 13], а также зарубежными исследователями [8]. Во всех случаях оценивалась установка кистей и стоп плода, его расположение в полости матки, локализация и особенности строения плаценты, количество сосудов в пуповине, а также количество околоплодных вод.
Пренатальный неинвазивный скрининг осуществлялся с целью выявления пациенток с повышенным риском рождения детей с СД, т.е. формирования группы "высокого" риска. Этим женщинам рекомендовалась инвазивная процедура и цитогенетическое исследование плода.
Инвазивные процедуры (кордоцентез или трансабдоминальная аспирация ворсин хориона/плаценты) выполнялись на базе 27 клинического родильного дома г. Москвы. Цитогенетическое исследование плода проводилось в лаборатории пренатальной диагностики МГНЦ РАМН при исследовании «прямых» хромосомных препаратов из ворсин хориона/плаценты или культур лимфоцитов пуповинной крови по методам, принятым в лаборатории [6].
Так как главной задачей исследования было создание автоматизированной программы расчета комбинированного индивидуального риска СД у плода, в работе был использован широкий арсенал математических расчетов. Теоретическую основу алгоритма расчета индивидуального риска составляла формула Байеса, записанная в предположении о независимости данных ИФА сыворотки и УЗИ плода.
При этом для оценки вероятности результатов ИФА среди женщин с синдромом Дауна у плода и среди женщин с нормальным исходом беременности использовалась гауссовская плотность, характеризующая совместное распределение значений АФП и ХГЧ в этих группах. Для оценки параметров гауссовской плотности использовались выборочные данные лаборатории пренатальной диагностики МГНЦ РАМН.
Проверка согласия выборочных распределений с теоретически нормальным распределением проводилась с использованием критерия согласия Колмогорова-Смирнова [12]. С использованием статистики Стьюдента был оценен коэффициент корреляции концентраций АФП и ХГЧ.
Результаты использования компьютерной программы расчета риска СД у плода «Прогноз»
Для обеспечения удобства доступа пользователя к информации о каждой из женщин, направленных на обследование, предусмотрены следующие возможности:
возможность просмотра списка женщин, подвергнутых проверочным тестам на наличие синдрома Дауна у плода по каждому из трех возможных ключей: в порядке алфавитного списка пациентов, в порядке возрастания уникального кода пациента, в порядке возрастания номера карты пациента;
возможность сортировки списка пациентов в соответствии со следующими ключами сортировки: просмотр полного списка, просмотр группы пациентов, отнесенных к группе повышенного риска синдрома Дауна у плода, просмотр группы пациентов определенного возраста, просмотр группы пациентов с определенным сроком беременности, просмотр группы пациентов с определенным уровнем концентрации АФП, просмотр группы пациентов с определенным уровнем концентрации ХГЧ, просмотр группы женщин с синдромом Дауна в текущей беременности, просмотр группы женщин с синдромом Дауна по данным анамнеза;
возможность оперативного поиска информации в базе данных пациентов либо по фамилии пациента, либо по номеру карты обследования пациента, либо по совокупности указанных признаков; возможность удаления отдельных пациентов из списка; возможность печати журнала приема пациентов как в полном объеме так и печати отдельных групп пациентов в соответствии с условиями сортировки списка; возможность печати индивидуальной карты биохимического обследования пациента с количественной оценкой индивидуального риска синдрома Дауна у плода; возможность печати полной индивидуальной карты пациента.
Информация о каждом из пациентов включает в себя: 1) административные данные (фамилия имя отчество, пол, дата рождения, возраст, место жительства, дата обращения, направляющее учреждение); 2) лабораторные процедурные данные (возраст, вес, срок беременности, дата поступления образца в лабораторию, дата проведения анализов, результаты УЗИ плода, данные анамнеза); 3) данные результатов ИФА (дата проведения анализов пациентов и значения концентраций АФП и ХГЧ, единицы измерения концентраций, оценка индивидуального риска СД у плода и значение, соотвествующее границе группы риска по СД. В процессе ввода абсолютных значений концентраций данных иммуно-ферментного анализа в произвольных единицах измерения обеспечивается их автоматический пересчет в безразмерные единицы (МоМ) в соотвествии с базовыми уровнями , сформированными на основе анализа эмпирической выборки беременных женщин; 4) выводы и рекомендации ("результат скрининга на СД отрицательный (риск низкий)", "результат скрининга на СД отрицательный, однако рекомендуется акушерский и УЗИ мониторинг беременности", "риск рождения ребенка с СД повышен, рекомендуется цитогенетическое исследование плода").
Кроме того, предусмотрена возможность сбора и накопления данных по фактическим исходам беременности для каждой из обследованных женщин. Эта информация позволяет, во-первых, оценить фактическую достоверность прогнозируемых оценок риска, полученных на основе реализованного алгоритма, и, во-вторых, проводить адаптацию алгоритма по мере накопления собственных данных путем сопоставления результатов диагностического прогноза и фактического исхода беременности.
Подсистема "Справочники" обеспечивает возможность ввода и корректировки универсальных данных, используемых при заполнении карты пациента. Указанная подсистема обеспечивает: возможность ввода, редактирования каталога медицинских учреждений, из которых направлен пациент на обследования по поводу наличия синдрома Дауна у плода; возможность ввода, редактирования каталога основных кариотипов; возможность ввода и корректировки каталога данных анамнеза пациентов; возможность ввода и корректировки каталога единиц измерения концентрации параметров ИФА с коэффициентами их пересчета в безразмерные единицы (МоМ) возможность ввода и корректировки каталога основных диагнозов новорожденного; возможность оперативного просмотра и печати оценок математического ожидания концентраций АФП и ХГЧ в (МоМ), рассчитанных на основе статистического анализа собственной выборки обследованных пациентов. Указанные показатели рассчитанные на представительной собственной выборке пациентов позволяет пользователю косвенно осуществлять контроль методических и инструментальных погрешностей измерения концентрации АФП и ХГЧ.
