Содержание к диссертации
Введение
CLASS Глава 1. Обзор литературы. Неинвазивная пренатальная диагностика CLASS 11
Плацента. Строение и функции 13
Попытки и методы неинвазивной диагностики 15
Клетки плода 17
Эритробласты 18
Трофобласты 20
Циркулирующие нуклеиновые кислоты 21
Полимеразная цепная реакция (пцр) 23
Общие сведения 23
Пцр в реальном времени 28
Анализ линейных разрушаемых проб (taqman анализ) 29
Пцр с обратной транскрипцией 31
Одностадийная от-пцр 32
Двухстадийная от-пцр 33
Цифровая пцр 33
Полиморфные маркеры 36
Мини-и микросателлиты 36
Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (пдрф) 37
Однонуклеотидный полиморфизм (онп) 38
Пренатальная диагностика сцепленных с полом заболеваний 40
Гемофилия типов а и в 41
Синдром мартина-белл 42
Дистрофия дюшенна 45
Методы пренатальной диагностики пола плода 46
Пренатальная диагностика резус-фактора плода 48
Отрицательный резус-фактор. Клинические аспекты 49
Гены группы rh 50
Применение циркулирующих нуклеиновых кислот для диагностики синдрома дауна 52
Синдром дауна. Клинические, генетические и социальные аспекты 52
Внеклеточные плодные нуклеиновые кислоты в диагностике синдрома дауна. Попытки, подходы и методы 55
Плацентарные мрнк. Попытки и методы. Выбор исследуемых генов и маркеров 58
CLASS Глава 2. Экспериментальная часть. Материалы и методы CLASS 63
Образцы крови и плазмы крови 63
Выделение геномной днк человека методом фенол-хлороформной экстракции 64
Выделение циркулирующей днк из плазмы 65
Выделение циркулирующей рнк из плазмы 65
Обратная транскрипция 66
Параметры и компоненты пцр в реальном времени, а также пцр и от-
Пцр 67
Пороговый цикл 68
Олигонуклеотиды 69
Условия пнр и последовательности праймеров 70
Цифровая пцр 72
Оценка эффективности проведения пнр 73
Генотипирование полиморфных маркеров rs8130833, rs 1155158 и
Rs7354779 74
CLASS Глава 3. Результаты и их обсуждение CLASS 77
Пренатальное определение пола плода 77
Цифровая пцр 77
Амплификация участков днк, содержащих маркер dys14 с целью определения половой принадлежности плода по образцам плазмы крови беременных женщин 79
Пренатальное определение резус-фактора плода 82
Определение предела обнаружения участков гена rhd в реакционной смеси 82
Установление резус-фактора плода по образцам плазмы крови беременных женщин 83
Разработка подхода для диагностики синдрома дауна у плода по образцам плазмы крови беременных женщин 86
Определение количества и качества выделенной рнк 86
Исследование сохранности рнк в крови и плазме крови 86
Отработка оптимального метода выделения циркулирующих мрнк 89
Идентификация генетических маркеров, пригодных для проведения исследования 90
Генотипирование полиморфных маркеров в генах pla с4, с21 orf 105 и dnmt3l 93
Выводы 97
Список литературы 99
Благодарности 113
- Однонуклеотидный полиморфизм (онп)
- Выделение геномной днк человека методом фенол-хлороформной экстракции
- Амплификация участков днк, содержащих маркер dys14 с целью определения половой принадлежности плода по образцам плазмы крови беременных женщин
- Отработка оптимального метода выделения циркулирующих мрнк
Введение к работе
Актуальность проблемы. Крайне важной является разработка неинвазивных и не требующих длительного времени генетических тестов, позволяющих диагностировать трисомию хромосомы 21 у плода, а также устанавливать его пол и резус-фактор в первом - начале второго триместра беременности.
Выяснение пола плода на ранних сроках беременности может предотвратить повторные случаи рождения больных детей в семьях с отягощенной наследственностью. В настоящее время основным методом пренатального установления пола будущего ребёнка является ультразвуковая диагностика, однако на ранних сроках беременности этот метод позволяет определять пол плода только по косвенным ультразвуковым маркерам.
Для выявления резус-конфликта беременной и плода в настоящее время применяют целый комплекс дорогостоящих и длительных клинических исследований, включающий измерение уровней специфичных материнских антител к резус-фактору, а также ультразвуковое исследование для определения скорости артериального потока крови средней мозговой артерии.
С целью пренатальной диагностики хромосомных синдромов в клинической практике проводится цитогенетический анализ клеток различных тканей плода. Для проведения этого анализа требуется применение инвазивной диагностики, обладающей, наряду с высокой точностью, превышающей в среднем 99%, серьёзными недостатками, - риском инфицирования плода и нежелательного прерывания беременности.
Цель и задачи работы. Целями данной работы были разработка систем для неинвазивного пренатального определения пола и резус-фактора плода по крови беременной женщины, а также разработка подхода для диагностики синдрома Дауна у плода. Для определения пола и резус-фактора плода проводилось обнаружение в крови будущей матери циркулирующих ДНК плода, содержащих участки генов DYS14 и RHD, соответственно. Для диагностики синдрома Дауна использовался метод, основанный на количественном генотипировании полиморфных маркеров в циркулирующих в крови матери РНК хромосомы 21 плода.
Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:
Определить соответствующие возможностям медицинских центров России условия выделения и длительного хранения образцов плазмы крови, а также циркулирующих ДНК и РНК.
Разработать пригодную для неинвазивной пренатальной диагностики систему определения ДНК, содержащую маркер DYS14, расположенный внутри многокопийного гена хромосомы Y, кодирующего белок TSPY1, используя в качестве материала циркулирующие ДНК плода из плазмы крови беременных.
Разработать систему для пренатального определения резус-фактора плода с помощью амплификации в реальном времени двух экзонов гена RHD, используя в качестве материала циркулирующие ДНК из плазмы крови беременных.
Выбрать гены хромосомы 21, которые, согласно литературным данным, преимущественно экспрессируются в плаценте. Проанализировать их экспрессию с помощью ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) из РНК плазмы крови беременных женщин и контрольных образцов мужчин.
С помощью генотипирования образцов беременной женщины, будущего отца ребёнка и плода по полиморфным маркерам в выбранных генах оценить долю плодной РНК каждого гена в плазме материнской крови. Оценить возможность применения этого метода для диагностики трисомии по хромосоме 21.
Научная новизна работы.
Созданы новые системы для безопасного неинвазивного определения пола и резус-фактора плода на ранних сроках беременности, обладающие большей чувствительностью по сравнению с описанными в литературе.
Отработан оригинальный протокол хранения образцов плазмы, выделения и генетического анализа циркулирующих РНК с помощью ПЦР в реальном времени.
Проведено комплексное исследование концентрации мРНК трёх генов хромосомы 21 в плазме крови беременных женщин и доли данных мРНК, имеющих плодное происхождение.
Практическая ценность работы. Разработанные системы могут применяться в неинвазивной пренатальной диагностике при установлении пола и резус-фактора плода. Дальнейшая оптимизация предложенного подхода для диагностики синдрома Дауна позволит выявлять наличие трисомии у плода на ранних сроках беременности.
Апробация работы. Диссертационная работа была представлена на заседании Секции молекулярной биологии Учёного Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 20 июля 2010 года. Результаты настоящей работы докладывались на V-ом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (г. Москва, Россия, 2009 г.). Материалы работы были представлены на международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (г. Москва, Россия, 2009 г.), а также на VI-ом съезде Российского Общества Медицинских Генетиков (г. Ростов-на-Дону, Россия, 2010 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, включая 2 статьи, а также материалы съездов и международной конференции.
Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на 113 страницах машинописного текста и содержат 6 таблиц и 19 рисунков. В работе процитированы 141 зарубежный и 7 отечественных литературных источников.
Однонуклеотидный полиморфизм (онп)
Однонуклеотидный полиморфизм (ОНП) {англ. — «Single Nucleotide Polymorphism», SNP) представляет собой вариации в нуклеотидной последовательности, которые встречаются в среднем один раз на каждые 1 000 нуклеотидов в геноме человека [72]. Полиморфизмом в данной ситуации называют внутривидовые различия в одном локусе. Наличие ОНП означает, что в данном месте у разных хромосом человека содержатся разные нуклеотиды (рисунок 5). Ценность ОНП заключается в том, что его всегда можно найти очень близко от интересующего исследователя гена или даже в самом гене [69]. использования ОНП для генетического
картирования. Это весьма привлекательная возможность — геном человека и любых других видов буквально заполнен этими «простыми» полиморфизмами. Например, в одной из баз данных по ОНП («dbSNP»), содержится более 10 миллионов примеров ОНП [69]. Вероятно, на самом деле, их существует намного больше. Данный метод имеет широкие перспективы использования в медицинской генетике.
С введением ПНР анализ каждого молекулярно-генетического маркера (за исключением ПДРФ) технически стал представлять собой подбор пары праймеров, позволяющих специфически и уникально амплифицировать данный полиморфный участок генома. В нашей работе мы анализировали ОНП с помощью ПЦР в реальном времени. ОНП неравномерно распределены по геному - есть места более плотно заселённые, есть — менее. Большинство ОНП оказываются в некодирующих областях генома, которые занимают примерно 98% его последовательностей и не проявляются фенотипически. ОНП в кодирующих областях, особенно меняющие аминокислоты в белках, редки в геноме [69]. В среднем человеческий ген содержит 126 ОНП, 46 из которых являются «обычными» (частота наименее представленного аллеля 5%), и 5 находятся в кодирующих областях [73]. В последнее время большое внимание уделяется возможности Рисунок 5. Схематическое изображение цепей ДНК, содержащих разные аллели однонуклеотидного полиморфного маркера. Пренатальная диагностика сцепленных с полом заболеваний
В настоящее время известно более 300 заболеваний и признаков, передающихся сцеплено с полом: гемофилии А и В, различные формы X-сцепленной умственной отсталости, например синдром Мартина-Белл, прогрессирующие мышечные дистрофии Дюшенна и Беккера, нефрогенный несахарный диабет, некоторые формы гидроцефалии, Х-сцепленная глухота и др. [74-76].
В большинстве случаев это сцепленные с хромосомой X заболевания, так как хромосома Y содержит относительно небольшое число генов. Мутации в этих генах приводят к развитию заболеваний, при которых наблюдается нарушение функционирования мужских половых желез. Такие мутации возникают, как правило, de novo. Как и менделирующие моногенные заболевания, гены которых локализованы на аутосомах, заболевания, сцепленные с хромосомой X, могут наследоваться и рецессивно, и доминантно [1].
Заболевания с Х-сцепленным рецессивным типом наследования возникают у лиц мужского пола, мутантныи ген у которых находится в гемизиготном состоянии. У женщин, носителей мутантного гена, этот ген находится, как правило, в гетерозиготном состоянии на одной из хромосом X [1]. Поэтому в семьях с такими заболеваниями крайне важно пренатальное определение пола на раннем сроке беременности.
Доминантный Х-сцепленный тип наследования встречается крайне редко и точно доказан лишь для нескольких заболеваний. В этом случае мутантныи ген локализован в хромосоме X, он может проявляться как при гетерозиготном, так и гемизиготном состоянии. Особенность заболеваний с этим типом наследования - различия в тяжести клинической картины у больных женского и мужского пола. У женщин с гетерозиготной мутацией часто наблюдается неполная пенетрантность и умеренно выраженная экспрессивность патологического гена. Среди них довольно распространено бессимптомное носительство, что можно объяснить преимущественной инактивацией Х-хромосомы с патологической мутацией. Таким образом, разное фенотипическое проявление этих заболеваний у лиц мужского и женского пола делает необходимым пренатальное определение пола плода на раннем сроке беременности в семьях с Х-сцепленными заболеваниями [1]. Далее, для примера, приведены клинические описания нескольких сцепленных с полом заболеваний.
Гемофилия типов А и В Гемофилия А является редким генетическим заболеванием крови (популяционная частота — 1:10 000 новорождённых мальчиков), вызванным наличием у больного автоантитела к фактору свёртываемости VIII [77] и, соответственно, нарушением первой фазы свёртываемости крови. Главным признаком болезни являются частые и длительные кровотечения. Кровоточивость возникает периодически, как правило, через 1-2 часа после травмы, иногда совсем незначительной. У некоторых больных кровоточивость связана со временами года.
Наружные кровотечения могут возникать при небольших порезах, при прорезывании или при удалении зубов, после операций. Внутренние кровотечения могут начаться от незначительных ушибов. Первые признаки заболевания начинаются при рождении, в момент перерезки пуповины. На первом году жизни кровотечения чаще всего бывают из слизистых оболочек носовой и ротовой полости, в 2-3 года кровоточивость проявляется кровоизлияниями в суставы и мягкие ткани, в 7-9 лет присоединяются кровотечения из дёсен при смене зубов и кровотечения из внутренних органов. У больных детей периоды ремиссии (состояния вне обострения заболевания) короче, чем у взрослых. Гемофилия может протекать в виде латентной (бессимптомной), лёгкой, средней или тяжёлой формы. Тяжесть заболевания зависит от степени дефицита фактора VIII. Гемофилия В, или болезнь Кристмаса, вызвана недостаточностью фактора свёртываемости IX [78]. Эта болезнь встречается гораздо реже гемофилии А - 1:200 000. Клинические симптомы гемофилии А и В очень схожи. При гемофилии В лёгкой и средней тяжести осложнения бываю редко. Тяжёлые формы гемофилии осложняются обширными гематомами (скоплениями крови в той или иной области в результате разрыва кровеносных сосудов), внутричерепными кровоизлияниями, нарушением функций суставов после кровоизлияния в них. Встречаются также кровотечения из внутренних органов, чаще всего это желудочно-кишечные и почечные кровотечения.
Выделение геномной днк человека методом фенол-хлороформной экстракции
При разработке системы для пренатального неинвазивного определения пола плода были задействованы образцы крови беременных с установленным ранее, в лаборатории пренатальной диагностики МГНЦ РАМН, кариотипом плода по культивированным лимфоцитам периферической крови. Кариотипирование проводили с помощью окрашивания хромосом GTG-окраской, основанного на предварительной обработке препаратов раствором трипсина и использовании красителя Гимза [143]. Анализ проводится в световом микроскопе с увеличением в 1 000 раз.
При разработке системы для пренатального неинвазивного определения резус-фактора плода были задействованы образцы крови беременных с установленным ранее, отрицательным, резус-фактором.
При разработке подхода для пренатальной неинвазивной диагностики синдрома Дауна были задействованы все предоставленные образцы крови.
Выделение геномной ДНК человека методом фенол-хлороформной экстракции
250 мкл венозной крови человека смешивали с равным объёмом лизирующего буфера (состав: 10 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 10 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), 100 мМ NaCl, 0,1 %-ный раствор тритона Х—100),
добавляли ДТТ (дитиотриэтол), ДСН (додецилсульфат натрия) и протеиназу К в конечной концентрации 0,2%, 40 мМ и 20 мкг/мл, соответственно, и инкубировали либо при 37С в течение ночи, либо 2 часа при 65С.
Затем последовательно обрабатывали фенолом, смесью фенол/хлороформ (1:1) и хлороформом (дважды на каждой стадии).
ДНК осаждали добавлением равного объёма изопропилового спирта (с добавлением 5М NaCl и гликогена) с последующей инкубацией при -20С в течение 30 минут и центрифугированием при скорости 13 400 оборотов/минуту в течение 30 минут.
Осадок промывали 70%-ным раствором этилового спирта, сушили на воздухе и растворяли в 50 мкл воды MilHQ.
РНК из образцов удаляли РНКазой ТІ («Fermentas», Литва); ДНК повторно обрабатывали фенолом и переосаждали этанолом.
Препараты ДНК хранили при -20С.
Концентрацию ДНК измеряли на спектрофотометре NanoVue («HealthCare Bio-Sciences АВ», Швеция).
Выделение циркулирующей ДНК из плазмы
Выделение внеклеточной циркулирующей ДНК проводили по двум различным методикам из плазмы крови, замороженной без Тризола:
1. С помощью набора «QIAamp UltraSens Virus» («QIAGEN», США).
2. С помощью набора «QIAamp Viral RNA Mini Kit» («QIAGEN», США).
В обоих случаях выделение проводили в строгом соответствии с приложенной к набору инструкцией.
Выделение циркулирующей РНК из плазмы
Сохранность РНК в образцах плазмы крови является одним из лимитирующих факторов разработки подхода, поэтому мы провели ряд экспериментов, нацеленных на стабильный выход РНК и последующее успешное прохождение ПНР с обратной транскрипцией. Для выделения РНК использовали два классических метода: Хомчинского [144] - с применением смеси фенола и гуанидин тиоцианата (реагент Тризол, состав: 0,8 М гуанидин тиоционат, 0,4 М тиоционат аммония, 0,1 М ацетат натрия (рН 5,0), 5% глицерина, 38% фенола (рН4,0), вода, обработанная диэтилпирокарбонатом) в качестве основного действующего вещества и ионообменных колонок («QIAamp Viral RNA mini kit», Qiagen, США), а также новый комбинированный метод, объединяющий в себе первые два метода [145]. Классические методы применялись в точном соответствии с рекомендациями автора метода [144] и производителя набора, за исключением того, что для выделения с помощью реагента Тризол соотношение объёма реагента к объёму плазмы крови составляло 1,25:1. Хеунг и соавторы доказали преимущество именно этого соотношения плазмы и реагента [146]. Выделение РНК всеми методами проводили из 500 мкл плазмы крови. Измерение концентрации РНК проводилось на спектрофотометре NanoVue («HealthCare Bio-Sciences АВ», Швеция). Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием программы «SPSS 17.0 for Windows». Для протяжённых переменных рассчитывались средние величины и стандартные отклонения (М± т).
Для количественного ПЦР исследования транскриптов чрезвычайно важным является качество очистки РНК. Для повышения точности исследования, во всех случаях, сравниваемые образцы мы обрабатывали одновременно, по одной и той же методике и с использованием одних и тех же реагентов (вплоть до контроля номера производственной серии каждого отдельного реактива) [45].
Обратная транскрипция
В нашей работе мы применяли двухстадийную ОТ-ПЦР (принципы проведения реакции описаны в разделе «ОТ-ПЦР» главы «Обзор литературы»). Обратную транскрипцию проводили следующим образом: і 0,1—1 мкг РНК смешивали с 100 пмоль праймера (N)6 (TV — любой, случайно выбранный нуклеотид), смесь инкубировали в течение 5 минут при температуре 70С и охлаждали на льду.
Затем добавляли 5-тикратный буфер (все реактивы для обратной транскрипции производства «Fermentas», Литва), 1мМ смеси дНТФ (дезоксинуклеозидтрифосфатов), 20 единиц ингибитора рибонуклеаз, воду, обработанную диэтилпирокарбонатом, и инкубировали 5 минут при 25С.
Затем добавляли 200 единиц обратной транскриптазы RevertAid M-MulV, инкубировали в течение 10 минут при температуре 25С, затем в течение 1 часа при температуре 42С.
Завершали реакцию инкубированием при 70 С в течение 10 минут с последующим охлаждением на льду.
Параметры и компоненты ПЦР в реальном времени, а также ПЦР и ОТ ПЦР
ПЦР в реальном времени является достаточно простым методом определения уровня экспрессии гена (генов) в исследуемом образце. Однако, анализируя результаты эксперимента, следует уделять должное внимание всем его параметрам и качеству компонентов реакции - при всей кажущейся простоте, важно учитывать критические факторы метода.
Далее рассмотрим параметр «пороговый цикл», используемый во всех графиках, отражающих результаты наших исследований, а также важность качества праймеров при создании систем для амплификации участков ДНК.
Следует также отметить, что все эксперименты, проведённые нами с помощью ПЦР в реальном времени, сопровождались отрицательным контролем прохождения реакции - без матричной ДНК. На рисунках не приведены уровни сигнала флуоресценции отрицательных контролей - они находились ниже установленной для анализа линии базового уровня.
Амплификация участков днк, содержащих маркер dys14 с целью определения половой принадлежности плода по образцам плазмы крови беременных женщин
Маркер DYS14 расположен внутри многокопийного гена Y-хромосомы, кодирующего белок TSPY. Ген представлен в геноме человека в виде 50 копий. Разработанная нами система позволяет детектировать 9 гомологичных копий гена.
В качестве контроля определения Y-хромосомы использовали маркер SRY, расположенный внутри однокопииного гена. По этому маркеру принято определять половую принадлежность образцов в судебной медицине, при малых количествах генетического материала. Положительным контролем прохождения ПЦР в реальном времени служил участок однокопииного гена «домашнего хозяйства» GAPDH.
В исследовании использовали 25 образцов крови беременных мальчиками и 15 - девочками, согласно данным кариотипирования. Ниже приведены результаты проведения ПЦР в реальном времени участка маркера DYS14, позволяющие судить о половой принадлежности плода (рисунок 10).
Анализ 39 образцов плазмы крови беременных подтвердил результаты кариотипирования - был установлен мужской пол плода в 24 случаях и женский - в 15, 1 результат оказался ложноотрицательным. Таким образом, чувствительность разработанной системы составляет 96%, а специфичность -100%.
Для удобства отображения на рисунке приведены результаты анализа четырёх из 25 проанализированных образцов плазмы крови беременных мальчиками женщин. На рисунке также отображены результаты амплификации участка маркера SRY, - они не явились информативными в данной ситуации, как видно, - одна копия этого маркера не всегда детектируема при малых количествах анализируемого генетического материала.
Таким образом, разработанная нами система позволила достоверно и безопасно установить пол плодов по образцам крови беременных женщин на ранних сроках беременности.
Пренатальное определение резус-фактора плода
Определение предела обнаружения участков гена RHD в реакционной смеси
Ген RHD, участвующий в определении резус-фактора человека, идентичен на 92% по нуклеотидной последовательности гену RHCE, обнаруживаемому и при отрицательном резус-факторе, поэтому одна из основных задач при установлении резус-статуса исследуемого образца, - это детекция именно гена RHD.
Апробацию разработанной системы с целью определения предела обнаружения участка ДНК, содержащего ген RHD, проводили на образцах крови мужчин с установленным ранее, по анализу крови, положительным резус-фактором. Проводили ряд последовательных разведений водного раствора геномной ДНК, до 2 копий в мкл. Методика проведения разведений и расчёта числа копий приведена ранее, в разделе «Цифровая ПНР» главы «Материалы и методы». В результате проведения экспериментов была установлена возможность обнаружения, как минимум, двух копий ДНК, содержащих ген RHD в реакционной смеси (рисунок 12), что позволило нам судить о пригодности системы в пренатальной диагностике по образцам плазмы крови беременной. В исследовании использовали 28 образцов крови беременных с установленным ранее, по анализу крови, отрицательным резус-фактором матери.
Анализ 21 образцов указал на положительный резус-фактор плода, в 7 случаях был установлен отрицательный резус-фактор. Результаты анализа были подтверждены анализом крови детей после их рождения. Таким образом, чувствительность и специфичность разработанной системы составляет 100%.
Ниже приведены результаты проведения ГЩР в реальном времени участков экзонов 7 и 10 гена RHD (именно в этих экзонах наблюдаются максимальные отличия от гена RHCE), позволяющие судить о резус-факторе плода (рисунок 13). Положительным контролем прохождения ГЩР в реальном времени служил участок однокопийного гена «домашнего хозяйства» GAPDH. Для удобства отображения приведены результаты анализа четырёх образцов плазмы крови беременных женщин.
Таким образом, предложенная нами система позволяет безопасно и достоверно устанавливать резус-фактор плода по крови его будущей матери. Разработка подхода для диагностики синдрома Дауна у плода по образцам плазмы крови беременных женщин
Определение количества и качества выделенной РНК
Для определения количества и качества выделенной РНК использовали фрагменты генов «домашнего хозяйства» АСТВ и В2М. Ген бета-актина (АСТВ) был выбран из-за высокой экспрессии во всех клетках человека, что позволяет идентифицировать мРНК этого гена из минимальных возможных концентраций тотальной РІЖ. Однако ген бета-актина имеет более 10 псевдогенов, геномные последовательности которых полностью гомологичны последовательности его мРНК. Это является большим недостатком, поскольку при наличии даже небольших следов геномной ДНК в образцах кДНК псевдогены участвуют в амплификации, образуя продукты ПЦР такой же длины. Для минимизации этого эффекта праймеры были подобраны таким образом, чтобы давать фрагменты разной длины в случае амплификации кДНК и геномной ДНК, что позволяет оценивать степень загрязнения геномной ДНК.
Аналогичная ситуация с наличием большого числа псевдогенов характерна для большинства генов, которые часто используются как стандарты в исследованиях экспрессии. Поэтому нами в качестве второго стандарта был выбран ген В2М, не имеющий псевдогенов. Для него праймеры были подобраны таким образом, чтобы амплифицировать только кДНК гена, а не геномную ДНК.
Отработка оптимального метода выделения циркулирующих мрнк
Было проведено сравнение трёх известных из литературы методов выделения РНК: два классических метода с использованием смеси фенола и гуанидин-тиоцианата (с помощью реагента Тризол) и с использованием ионообменных колонок, а также новый комбинированный метод, объединяющий в себе первые два [145]. Сравнение проводилось следующим образом. Образцы плазмы разделяли на 3 равные части. Из каждой части выделяли РНК одним из трёх методов и проводили ОТ—ПЦР на 3 маркерных гена. Добавление реагента Тризол, если было необходимо по протоколу, проводилось сразу перед выделением.
Проводили выделение РНК из 30 свежих образцов плазмы (хранение: 1—10 дней при -70С) и из 30 образцов плазмы длительного срока хранения (4-6 месяцев при -70С). Результаты исследования подтвердили данные последних публикаций о значительном преимуществе комбинированного метода для выделения из плазмы крови РНК невирусного происхождения (таблица 5). Данный метод оказался единственным, с помощью которого удалось успешно выделить РНК из образцов плазмы после длительного хранения с достаточно высоким выходом. Идентификация генетических маркеров, пригодных для проведения исследования
Для анализа хромосомного дисбаланса пригодны полиморфные маркеры в циркулирующих РНК, обладающие следующим свойствами:
1. РНК должны специфично экспрессироваться в плаценте, причём в той её части, которая содержит только клетки с генотипом плода.
2. Кодирующие гены должны лежать в критической области, ассоциированной с синдромом Дауна, на хромосоме 21q22.
3. Поскольку для анализа подходят только гетерозиготные генотипы, то полиморфные маркеры должны обладать максимальной гетерозиготностью. Анализ баз данных и литературных источников помог выявить несколько генов и полиморфных маркеров, обладающих всеми перечисленными свойствами. Это гены PLAC4, DNMT3L и нетранслируемая РНК C21orfl05. В них суммарно доступно для анализа 3 полиморфных маркера, обладающих достаточно высокой гетерозиготностью (более 30%).
На рисунке 15 представлены схематические изображения генов и полиморфных маркеров внутри этих генов. Отображено также схематическое расположение генов внутри критического района синдрома Дауна - участка хромосомы 21, трисомия которого приводит к синдрому Дауна [115].
Проведена экспериментальная проверка частот встречаемости всех 3 полиморфных маркеров (rs8130833, rsl 155158 и rs7354779) в генах PLAC4, C21orfl05 и DNMT3L, соответственно, в выборке из 100 человек, представляющей население города Москвы. Была подтверждена высокая гетерозиготность всех проанализированных маркеров.
Для определения специфичности выбранных полиморфных маркеров для плаценты была проведена ОТ—ПНР фрагментов, фланкирующих все 3 маркера, из РНК, полученной из плазмы крови беременных женщин. Одновременно с этим проводилась ОТ—ПЦР тех же маркеров из РНК контрольной группы мужчин. Было проведено от 30 до 42 циклов ПЦР с шагом в 2 цикла, и определено количество циклов, при которых был получен специфичный сигнал (Таблица 6). Как видно из представленных результатов, для амплификации полиморфного маркера в гене PLAC4 потребовалось 36-40 циклов ПЦР. Однако оказалось, что экспрессия данного гена не полностью специфична для беременных женщин. При этом концентрация его РНК в плазме крови мужчин меньше в 10-20 раз, что соответствует дополнительным 4 циклам ПЦР, и это соотношение остаётся неизменным для всех проанализированных проб.
Возможно, неспецифичность экспрессии связана с тем фактом, что ген PLAC4 полностью расположен в интроне гена ВАСЕ2, который экспрессируется в большинстве органов и тканей организма. Данное утверждение было проверено путём амплификации 5 участков гена PLAC4 в 10 образцах кДНК яичников небеременных женщин, которая показала наличие экспрессии всех 5 участков гена.
По данным литературы, для амплификации фрагментов генов C21orfl05 и DNMT3L требуется проведение не менее 44 циклов ПЦР, что свидетельствует о крайне низком уровне их экспрессии. Поэтому нами дополнительно была проведена амплификация 3 участков данных генов, содержащих полиморфные маркеры, с использованием 44 46 циклов ПЦР. Для большинства образцов (62%) было показано наличие специфичного продукта ПЦР. Мы считаем, что полиморфные маркеры в гене PLAC4 предпочтительны для использования в неинвазивной диагностики синдрома Дауна у плода по крови матери ввиду наивысшей концентрации РНК данного гена. При этом мы считаем, что гены C21orfl05 и DNMT3L также пригодны, однако их использование предполагает повышенных требований к чистоте лабораторных помещений.
