Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1. Послойная электростатическая самосборка (ЬЬЬ Е8А) 8
2. Покрытие коллоидных частиц микронных и субмикронных размеров
3. Контролируемое осаждение на поверхности коллоидных частиц (БСР) 15
3.1. Получение структур «ядро-оболочка» посредством метода БСР с образованием комплекса полиэлектролит 15
3.2. Получение структур «ядро-оболочка» посредством метода БСР с добавлением осадителя
4. Получение полых полиэлектролитных капсул 18
5. Инкапсулирование макромолекул 21
5.1. Инкапсулирование при помощи регулирования проницаемости стенки 21
Регулирование проницаемости изменением значения рН 21
Регулирование проницаемости изменением полярности среды 23
5.2. Инкапсулирование предварительно осажденных макромолекул 24
5.3. Инкапсулирование макромолекул посредством метода БСР с последующим формированием внешней устойчивой оболочки 26
6. Проницаемость капсульной стенки для низкомолекулярных веществ 29
7. Физические процессы и химические реакции в ограниченном объеме капсул 30 7.1. Осаждение органических веществ исключительно во внутреннем объеме капсул 31
Осаждение рН-чувствительных веществ внутри капсул, модифицированных РЯБ 31
Одновременное осаждение разных веществ внутри капсул, модифицированных РББ 32
Осаждение плохо растворимых в воде веществ внутри капсул, модифицированных /Ж 33
8. Заключение 35
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 38
1. Разработка методов получения микрокапсул 38
1.1. Подбор полиэлектролитов 38
1.2. Подбор матриц 41
Матрицы из меламинформальдегида 43
Матрицы из карбоната марганца 45
1.3.Методы получения микрокапсул посредством послойной адсорбции 46
2. Исследование свойств полученных микрокапсул 48
2.1. Исследование морфологии 48
2.2. Исследование проницаемости стенок микрокапсул 55
2.3. Микрокапсулы для включения гидрофобных веществ 57
3. Визуализация микрокапсул из биополимеров 58
3.1. Визуализация с использованием рентгеноконтрастных коллоидных частиц серебра 58
3.2. Визуализация с использованием нанокристаллов, люминесцирующих в ближней ИК-области 62
3.3. Визуализация с использованием полупроводниковых нанокристаллов ((20 N0$) 66
4. Включение в микрокапсулы белков и ДНК 68
4.1. Получение микрокапсул с белком 68
4.2. Получение микрокапсул с ДНК 72
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 75
1. Материалы 75
2. Методы 76
ВЫВОДЫ 85
Благодарности 86
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 87
- Послойная электростатическая самосборка (ЬЬЬ Е8А)
- Покрытие коллоидных частиц микронных и субмикронных размеров
- Получение структур «ядро-оболочка» посредством метода БСР с образованием комплекса полиэлектролит
Введение к работе
Существует большое разнообразие как синтетических, так и природных полимерных систем для изучения контролируемого высвобождения биологически активных веществ и получения систем направленной доставки лекарств (DDS) [71]. Разработка и изучение новых надмолекулярных образований является одним из направлений интенсивно развивающихся нанотехнологий. К надмолекулярным образованиям относятся, в том числе, такие коллоидные частицы, как микрокапсулы, которые находят применение в различных областях прикладной химии, биохимии и фармакологии.
В 1998 году группой исследователей Института Макса Планка был предложен новый способ получения микрокапсул - послойная (Layer-by-Layer) электростатическая самосборка (Electrostatic Self-Assembly) противоположно заряженных полиэлектролитов на коллоидных частицах микронных и субмикронных размеров [31, 28]. Данная технология позволяет получать микрокапсулы определенной формы и размера, зависящих от используемых матриц-ядер. Оболочка микрокапсул обеспечивает требуемые каталитические или аффинные свойства, стабильность, проницаемость, совместимость и регулирование высвобождения внутреннего материала капсулы.
Микрокапсулы, имеющие размер от нескольких десятков нанометров до микрометра, со стенками нанометровой толщины представляют как научный, так и технологический интерес, поскольку могут использоваться как новый перспективный тип микро- и наноконтейнеров для решения различных задач. В частности, включение белков и нуклеиновых кислот в многослойные пленки может найти применение в биотехнологии, например, в качестве средства доставки внутрь клеток ДНК и белка для получения вакцин и в генной терапии.
Данная технология микрокапсулирования, однако, до настоящего времени отрабатывалась только на микрокапсулах, состоящих из синтетических полиэлектролитов. Получение при помощи послойной сборки микрокапсул на основе природных материалов не было описано и изучено. В связи с этим, представляется актуальной разработка технологии получения микрокапсул методом LbL ESA на основе биополимеров и изучение свойств полученных капсул.
Представленная работа является частью исследований, проводимых в Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова на кафедре биотехнологии по теме «Синтез новых фармакологически активных веществ, изучение их биологических свойств и методов направленного транспорта с целью создания противоопухолевых, противовирусных, антипаркинсонических средств» (регистрационный номер НИР: 1Б-5-866), а также в Государственном научном центре по антибиотикам по теме «Разработка новых лекарственных форм известных биологически активных веществ».
Часть работы выполнялась в Институте Макса Планка коллоидной химии и химии поверхностей (Потсдам, Германия) в отделении «Поверхности», отделе «Полые капсулы» в группе «Полифункциональные микро- и нанокапсулы» под руководством к.ф.-м.н. Сухорукова Г.Б. в рамках программы «Софья Ковалевская», финансируемой фондом Александра Гумбольдта Министерства образования и исследований Германии.
Послойная электростатическая самосборка
LbL-метод получил свое развитие на основе формирования монослойных ультратонких полимерных пленок на макроскопической подложке (пленки Ленгмюра- Блоджет). В 1966 году Пег et а!, предложил для сборки пленок чередуемую адсорбцию [I], которую позже развил Mallouk и др. [2]. В 1991 году Decher и др, предложил метод получения полиэлектролитных пленок, основанный на поочередной адсорбции поликатионов и полианионов [3]. Решающим фактором в полиионной сборке является изменение знака поверхностного заряда после адсорбции полиэлектронига. Общая схема сборки многослойной пленки на твердой подложке представлена на рисунке I, заряда поверхности (рис. 1Ь). Затем подложку отмывают от раствора поликатиона чистой водой и помещают в раствор полианиона (рис. 1с). После адсорбции полианиона поверхностный заряд становится отрицательным (рис. Ы). Многократное повторение этого цикла приводит к образованию многослойной полиэлектролитной пленки (рис. 1е). Описываемый процесс осуществляется при значениях рН раствора, обеспечивающих высокую степень ионизации полиэлектролита. Однако, электростатическое притяжение не единственное взаимодействие, играющее значительную роль в адсорбции слоев - известны также пленки, образованные только за счет водородных связей [75, 76].
Универсальность метода не накладывает никаких ограничений на тип полиэлектролита. К настоящему времени, этот метод использовался более чем для 50 различных заряженных макромолекул, включая синтетические полиэлектролиты и проводящие полимеры [4-9]. Кроме того, данная процедура позволяет включать в состав пленок не только полиэлектролиты, но и заряженные наночастицы, керамику, вирусы и липидные везикулы. Потенциал этого метода был протестирован в нескольких лабораториях [10-14]. Было установлено, что пленки могут содержать более 100 слоев. Так, могут быть получены ультратонкие упорядоченные пленки толщиной от 1 до 1 ООО нм с точностью до одного адсорбированного слоя, толщина которого составляет порядка 1 нм.
Включение белков и нуклеиновых кислот в многослойные пленки может быть использовано в биотехнологии (для создания биосенсоров, для ферментативных реакций, для придания объектам биосовместимости, в распознавании антиген-антитело) [15-17, 81]. Исследования показали, что адсорбция белков не приводит к их химической модификации, и после адсорбции они сохраняют относительно высокую активность. Большинство протеинов амфотерны и ведут себя либо как поликатионы, либо как полианионы в зависимости от значения рН (ниже или выше их изоэлектрической точки), что, соответственно, обуславливает возможность их включения в слои как положительно или отрицательно заряженные билдинг-блоки в процессе формирования пленки [82].
Биосовместимость субстратов, необходимая, например, при имплантациях, может быть достигнута нанесением в качестве внешнего слоя полисахаридов (наличие в структуре карбоксильных, сульфо- или аминогрупп обуславливает их заряд) [83-86]. Данная технология используется в ультратонком многостадийном химическом катализе, в изготовлении оптических приборов и мембран для разделения газов [18-20].
Одна из наиболее важных особенностей этих многослойных пленок - выборочная проницаемость для различных молекул. Проницаемость пленки зависит от толщины слоя, пористости, структуры, химического состава слоев и размера проникающих веществ. Несколько исследований в этом направлении [21-23] показали, что эти пленки не пропускают макромолекулы, в то время как полярные молекулы с маленькой молекулярной массой легко проходят через эти пленки,
Покрытие коллоидных частиц микронных и субмикронных размеров
Один из путей контролируемого осаждения заряженных полимеров на поверхности заключается в образовании нерастворимого комплекса в результате коагуляции многовалентных противоионов и полиэлектролитов (рис. 4 А). Полиэлектролиты, подобные PSS или РАН могут быть осаждены Ме3+- и СОз2"-ионами, соответственно. Так, противоионом для PSS может являться ион Y3+ [49], или ТЬ3+ [48, 68], для РАН — карбонатный ион лимонной кислоты [49] или сульфатный ион 4- пиренсульфата [68]. Для осаждения полимера к суспензии коллоидных частиц в растворе многовалентных ионов при непрерывном перемешивании добавляли по каплям раствор полиэлектролита, что приводило к образованию довольно гладкой пленки на поверхности частиц, состоящей из комплекса противоион/полиэлектролит толщиной около 40 нм. Надлежащий выбор концентрации частиц, полимеров и скорости гетерокоагуляции позволяет формировать равномерный слой полимерного осадка на поверхности коллоидных частиц.
Обра зован не комплекса пол тлектрол ипг/противо ион Рисунок 4. Схема способов контролируемого осаждения на поверхности коллоидных частиц
Получение структур «ядро-оболочка» посредством $СР-метода с добавлением осадителя
Гетерокоагуляция - не единственный метод усиления образования агрегатов и контролируемого осаждения полимеров на поверхности коллоидных частиц. Другим подходом для формирования структур «ядро-оболочка» является техника покапельного добавления осадителя (см. рис. 4 В).
Для проверки возможностей этого метода в [48] в качестве составляющих слоев были выбраны ДНК и декстран в силу их плохой растворимости в этаноле. Водная суспензия МФ-частиц была смешана с раствором ДНК (или декстрана), после чего при непрерывном перемешивании по каплям добавлялся этанол. С увеличением содержания этанола (до 60%) в смеси происходило выпадение ДНК (или декстрана) в течение 15 минут. После центрифугирования, в супернатанте было обнаружено менее 20% ДНК (5% декстрана), несвязавшихся с поверхностью коллоидных частиц. Конфокальные исследования показали гомогенное покрытие частиц для всех исследуемых систем. Оценка средней толщины полученной пленки на коллоидных частицах в случае ДНК показала значение в 50 монослоев ДНК, то есть толщину приблизительно 100 нм [31].
SCP-метод в отличие от LbL ESA позволяет оперировать многими веществами. Условия осаждения, такие как градиент растворителя или добавление комплекс-иона, можно подобрать для широкого класса полимеров и наночастиц. Необходимо также отметить, что еще одним преимуществом техники контролируемого осаждения на поверхности является его значительно меньшие временные затраты для получения пленок, состоящих из десятков мономолекулярных слоев. Сборка при помощи SCP занимает несколько минут в сравнении с часами при использовании LbL ESA. Оба метода дополняют друг друга.
Действительно, сборка двух противоположно заряженных полиэлектролитов не может быть осуществлена при помощи методики контролируемого осаждения из-за быстрой коагуляции полиэлектролитных комплексов. В данном случае оболочка может быть получена только при помощи послойной адсорбции. Кроме того, упорядочение мономолекулярных слоев в направлении, перпендикулярном поверхности коллоидных частиц, также более удобно осуществить при помощи LbL-метода. В то время как LbL- метод обычно приводит к формированию стабильной пленки, оболочки, полученные техникой SCP, могут бьггь легко разрушены путем обратного увеличения растворимости или экстракции комплекс-иона.
Наилучшие результаты могут быть достигнуты при использовании комбинации этих методов, что открывает большие возможности для сборки многокомпонентной пленки. В качестве составляющих в пленочную композицию может быть включено широкое разнообразие материалов вне зависимости от заряда и молекулярной массы. Пошаговое чередование обоих методов способствует решению различных задач, связанных с микро- и наноструктурированными материалами. Например, возможно проведение неорганических реакций между предварительно пространственно локализованными в оболочке реагентами или инкапсулирование полимеров в полиэлектролитные капсулы при помощи покрытия предварительно осажденных полимеров, таких как ДНК или декстран, стабильными LbL-оболочками.
Получение структур «ядро-оболочка» посредством метода БСР с образованием комплекса полиэлектролит
Структура многослойной полиэлектролитной пленки чувствительна к различным физико-химическим свойствам окружающей среды.
Регулирование проницаемости изменением значения рН
В частности, рН - один из физико-химических параметров, который влияет на связи в стенке капсулы, особенно, если заряд одного из полиэлектролитов в комплексе зависит от значения рН.
Проницаемость полых капсул, состоящих из 4 РЗБ/РАН слоев и собранных на МФ- и СёСОз-ядрах, была исследована для Р1ТС-меченного декстрана 75 ООО и 2 000 000) и Р1ТС-меченного альбумина [53]. На рисунке 8 (справа) дано конфокальное изображение капсул в присутствии Р1ТС-декстрана в рН=10. Внутренняя часть капсул темная, в то время как фон флуоресцирует. Это доказывает, что при данном рН стенки капсулы не проницаемы для Р1ТС-декстрана. Даже деформированные капсулы не показывают никакой флуоресценции внутри. Однако при рН=3 внутренняя часть капсулы становится столь же флуоресцирующей как внешний объем (рис. 8, слева). Объяснением данного факта может служить "открытое" и "закрытое" состояние капсул при низком и высоком рН, соответственно.
Проницаемость стенок изучалась при различных значениях pl в диапазоне от 3.5 до 12. "Открытое" состояние капсул для FITC-декстрана наблюдалось при значении рН ниже 6. а при рН выше 8 большинство капсул "закрыто". Существенной разницы в проницаемости между капсулами, полученными па МФ- и CdCCh-ядрах, нет.
Оптические исследования показали отсутствие недоза пол не иных капсул, из чего можно заключить, что проницаемость стенки является прямой функцией величины рН.
Механизм, лежащий в основе рН-зависимой проницаемости капсулы, еще полностью не изучен. Возможно, объяснение лежит во взаимодействии полиэлектролитов в стенке оболочки. Так как полимеры необратимо адсорбируются в стенке оболочки, уменьшение рН не стимулирует десорбцию полимеров. Уменьшение рН приводит к увеличению заряда РАН, что в свою очередь, приводит к накоплению положительного заряда в стенке оболочки. Данный процесс может изменять морфологию стенки оболочки, усиливая взаимное отгадки ванне, что приводит к появлению дефектов в полимерной сетке.
