Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Структура и свойства тирозиназы 9
1.2. Фенольные биосенсоры на основе тирозиназы 15
1.3. Структура и свойства холиноксидазы 22
1.4. Детекция холина с использованием амперометрических биосенсоров 24
1.5. Технология последовательного нанесения полиэлектролитов 27
1.6. Факторы, определяющие структуру нанопленок: ионная сила,
рН, гидратация и высушивание 30
1.7. Биосенсоры на основе технологии
последовательного нанесения полиэлектролитов (ПНП) 33
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 39
2.1. Материалы 39
2.2. Методы 40
2.2.1. Метод последовательного нанесения полиэлектролитов (ПНП) 40
2.2.2. Изготовление тирозиназных биосенсоров 41
2.2.3. Модификация графита полидиэтиламинофосфазеном (ПФ) 42
2.2.4. Электромодификация графитовых электродов оксидом Mn(IV) 42
2.2.5. Изготовление холиноксидазных биосенсоров 42
2.2.6. Приготовление образцов для АСМ 43
2.2.7. Получение АСМ-изображений 43
2.2.8. Обработка топографии поверхностей 43
2.2.9. Силовое картирование нанопленок 43
2.2.10. Электрохимический анализ фенола 44
2.2.11. Определение количества тирозиназы в слое 44
2.2.12. Электрохимический анализ пероксида водорода 46
2.2.13. Электрохимический анализ холина 46
2.2.14. Спектрофотометрическое определение активности холиноксидазы 46
2.2.15. Анализ активности бутирилхолинэстеразы 46
2.2.16. Обработка результатов 46
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 47
3.1. Структурные особенности нанопленок, полученных методом последовательного нанесения полиэлектролитов 47
3.1.1. Влияние ионной силы на структуру полимера на поверхности 47
3.1.2. Влияние количества нанесений структуру полиэлектролитов
на поверхности графита 51
3.1.3. Силовое картирование полиэлектролитных нанопленок 53
3.1.4. Нанопленки на основе белков 63
3.1.5. Предобработка графита полидиэтиламинофосфазеном 67
3.2. Тирозиназный биосенсор 74
3.2.1. Разработка и оптимизация метода послойного нанесения
полиэлектролитов для создания тирозиназного биосенсора 75
3.2.1.1. Влияние природы полиэлектролита на
активность тирозиназных электродов 75
3.2.1.2. Влияния концентрации тирозиназы на величину аналитического сигнала тирозиназных электродов 80
3.2.1.3. Влияние времени адсорбции тирозиназны и поликатиона на величину аналитического сигнала биосенсоров 81
3.2.2. Кинетические параметры тирозиназы в пленках полиэлектролитов 84
3.2.3. Аналитические характеристики тирозиназных биосенсоров 87
3.2.4. Стабильность тирозиназных биосенсоров 91
3.2.5. Применение тирозиназных биосенсоров для анализа активности ферментов 92
3.2.6.1. Анализа активности бутирилхолинэстеразы в кинетическом режиме 92
3.2.6.2. Количественный анализ щелочной фосфатазы 94
3.3. Биосенсоры на основе холиноксидазы 98
3.3.1. Оптимизация системы определения пероксида водорода на основе графитовых электродов, модифицированных оксидом Mn(IV) 98
3.3.1.1. Электрохимические особенности графитовых электродов, модифицированных оксидом Mn(IV) 98
3.3.1.2. Топографические характеристики графитовых электродов, модифицированных оксидом Mn(IV) 100
3.3.1.3. Оптимизация методики модификации графитовых электродов оксидом Mn(IV) 101
3.3.1.4. Аналитические характеристики и стабильность графитовых электродов, модифицированных оксидом Mn(IV) 104
3.3.2. Разработка и оптимизация метода послойного нанесения, полиэлектролитов для создания холиноксидазного биосенсора 108
3.3.2.1. Влияние природы полиэлектролита на активность холиноксидазных электродов 108
3.3.2.2. Влияние концентрации холиноксидазы в растворе
на величину аналитического сигнала тирозиназных электродов 114
3.3.2.3. Влияние времени адсорбции холиноксидазы на величину аналитического сигнала биосенсоров 116
3.3.3. Кинетические характеристики холинокидазы в пленках полиэлектролитов 117
3.3.4. Аналитические характеристики и стабильность холинокидазных биосенсоров 120
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 125
ВЫВОДЫ 126
ЛИТЕРАТУРА 128
- Структура и свойства тирозиназы
- Материалы
- Структурные особенности нанопленок, полученных методом последовательного нанесения полиэлектролитов
Структура и свойства тирозиназы
Тирозиназа - фермент, содержащий в составе активного центра ионы меди (Рис.1-1) [1, 2], и катализирующий две различные реакции: о-гидроксилирование монофенолов (гидроксилазная активность) и окисление о-дифенолов до о-хинонов (оксидазная активность) [3-7].
Гидроскилазная и оксидазная активность тирозиназы в организме человека проявляется в о-гидроксилировании ее природного субстрата Z-тирозина и окислении образовавшегося из него 3,4-диоксифенилаланина [6, 8], являющегося первым промежуточным продуктом при синтезе меланинов - полимерных пигментов кожи и волос, а также адреналина и норадреналина - гормонов, вырабатывающихся в надпочечниках и симпатических нервах [9]. Тирозиназа широко распространена в природе: с ее участием происходит биосинтез меланинов в различных тканях растений и животных, поэтому ее структура и механизм каталитического действия представляют большой интерес для исследователей [1,6].
Тирозиназа или полифенолоксидаза (ЕС 1.14.18.1) - медь-содержащий фермент с двумя активными центрами на молекулу, каждый из которых включает два атома меди, расположенных на расстоянии 3 А друг относительно друга [1, 10]. Химические и спектроскопические исследования тирозиназы показали, что ее активный центр очень схож с активным центром гемоцианина, в котором также находятся два атома меди [13,21]. В зависимости от структуры активного центра тирозиназа может находиться в
Трех раЗЛИЧНЫХ СОСТОЯНИЯХ - Ете,, Еоху И Edeoxy [ 1 ]
В окисленной форме тирозиназы (Еоху, оху-тирозиназа) каждый ион Cu(II) связан двумя сильными экваториальными и одной слабой аксиальной связями с остатками гистидина полипептидной цепи (Рис. 1-2), а молекула кислорода, необходимая для окисления о-дифенолов, связывает два атома меди между собой (Рис. 1-3) [1, 10].
Необходимо отметить, что боковые цепи, содержащие остатки гистидина, являются важными группами, связывающими металл как в природных металлопротеинах, примерами которых кроме тирозиназы являются карбоксипептидазы, миоглобин,
гемоглобин, так и в комплексах металла с белком, полученных в лаборатории [1].
Рис. 1-2. Молекула гистидина. В случае тирозиназы взаимодействие металл-имидазол происходит без образования хелатов. Конфигурация Cu(II) в аху-форме тирозиназы является квадратно-пирамидальной, что не является типичным для соединений Cu(II) в растворе [1, N Рис. 1-3. Структура активного центра Еоху.
Met-форма тирозиназы (Emet), как и оху-форма, содержит два иона Cu(II), связанных с шестью остатками гистидина полипептидной цепи (Рис. 1-4) [2].
В ряде работ говорится о существовании дополнительной связи между ионами меди, приводящей к квадратно-пирамидальной конфигурации Cu(II), как и в случае оху-тирозиназы [1, 10]. Эти предположения основаны на исследованиях искусственно полученной ЭПР-детектируемой формы тирозиназы, содержащей в активном центре ионы Cu(II) и Cu(I) и получившей название half-met-тнрозиназы [10]. Выделенная из природных объектов, например грибов, тирозиназа представляет собой смесь 85% met- и 15% оху-формы [12].
Материалы
В настоящей работе были использованы следующие реактивы: грибная тирозипаза (полифеїіолоксидаза, ЕС 1.14.18.1), активность 2870 U/мг по L-тирозину (Sigma); холиноксидаза из Arthrobacter globiformis (Е.С. 1.1.3.17), активность 13,5 ед/мг (Sigma) и 3 ед/мг (Genzyme); бутирилхолинэстераза из сыворотки крови лошади (БХЭ, ЕС 3.1.1.8) (ISN, США), пероксидаза хрена (Sigma), активность ПО ед/мг; бычий сывороточный альбумин (Sigma); фенол (Merck, Германия); холин (Sigma); фенилвалерат (Oryza Laboratory Inc., США), 4-аминоантипирин (Sigma); хлорид аммония и аммиак водный, 25% (масс.) (Химмед); пероксид водорода, 30% (Merck); МпСЬ НЬО (Merck); полианетолсульфонат натрия (SERVA, США), полиэтиленимин, 50% (масс/объем) водный раствор (Pw = 750000 г/моль) (Sigma); полидиаллилдиметиламмоний хлорид, 20% (масс.) (Mw = 200000 - 350000 г/моль) (Aldrich); графитовые стержни, диаметром 3 мм (Sigma).
Полидиэтиламинофосфазен (Pw = 40000 г/моль) был любезно предоставлен вед. н.с. Института элементорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН Д.Р. Тур.
Препараты хитозана (поли-(1,4)-2-амино-2-деокси-0-глюкопиранозы, Pw = 14, 15, 20, 25, 120, 500) были любезно предоставлены д.х.н., профессором кафедры аналитической химии Химического факультета МГУ Т.Н. Шеховцовой.
Поли- 1-метил-4-винилпиридиний сульфат (Mw = 50000 г/моль, р = 0,90), поли-N-этил-4-винилпиридиний бромид (Mw = 50000 г/моль, р = 0,90), поли-К-пропил-4-винилпиридиний бромид (Mw = 50000 г/моль, Р = 0,84), поли-Ы-бутил-4-винилпиридиний бромид (Mw = 50000 г/моль, Р = 0,86), поли-№амил-4-винилпиридиний бромид (Mw = 50000 г/моль, р = 0,95), поли-Ы-бензил-4-винилпиридиний хлорид (Mw = 50000 г/моль, р = 0,97), поли-и-винилбензилхлоридпиридин (Pw = 500) и полидиметил-этиламмонийэтилметакрилат бромид (Mw = 600000 г/моль) были любезно предоставлены научным сотрудником кафедры высокомолекулярных соединений Химического факультета МГУ, к.х.н. Д.В. Пергушевым.
Поли-К-алкил-4-винилпиридиний галогениды (Pw 1000), полученные кватернизацией поли-Ы-винил соответствующими галогенидами (EtBr, р = 0,42; EtBr, р = 0,36 и Ci6H25Br, р = 0,55; EtBr, р = 0,18 и Ci6H33Br, р = 0,72), а также 20%-ный (масс.) водный раствор полидиметилдиаллиламмонийхлорида (ПДДА, M.r. = 200000 - 350000 г/моль) были любезно Все остальные реактивы были марки не ниже ХЧ и использовались без предварительной очистки. Все растворы готовились в деионизированнои воде, полученной при помощи системы очистки воды Milli-Q,
Структурные особенности нанопленок, полученных методом последовательного нанесения полиэлектролитов
Одним из факторов, определяющих структуру полиэлектролита является ионная сила раствора, из которого он сорбируется на поверхность. Методом АСМ было проведено исследование влияния ионной силы раствора на структуру и стабильность пленок полиэлектролитов на поверхности графита, стекла и слюды. На Рис. 3.1.-1 и Рис. 3.1. - 2 приведены изображения топографии структур ПДДА на ВОПГ и слюде, полученные сорбцией из растворов с разной ионной силой. Как следует из представленных данных, при нанесении полимера, растворенного в дистиллированной воде, на поверхности графита формируются формируются сплошные равномерные пленки, в то время как присутствие в растворе 50 или более ммоль/л низкомолекулярной соли, приводит к образованию глобулярных, нитевидных или сетчатых структур и к общему снижению степени заполнения поверхности. Количественный анализ полученных изображений показал, что при нанесении полиэлектролита из раствора, содержащего более 50 мМ низкомолекулярной соли снижает как степень заполнения поверхности пленкой (р), так и ее объем (V) в 5 раз (Табл. 3.1. - 1). Таким образом, введение низкомолекулярной соли в раствор полиэлектролита уменьшает количество вещества, адсорбирующегося на поверхности графита, что может говорить об электростатическом характере взаимодействий полимера с подложкой. (Табл. 3.1.-1).
Если пленку, полученную из водного раствора, затем поместить в среду с высокой ионной силой, происходит ее перестройка, и характер структуры полимерного покрытия становиться островковым (Рис. 3.1. - 3.). Сетчатые же и глобулярные образования, полученные адсорбцией полиэлектролитов из растворов, содержащих низкомолекулярные соли, стабильны в условиях отмывки буферами, и сохраняют характер распределения на поверхности графита.
В контексте создания ферментных сенсоров параметр стабильности в буферных растворах является определяющим, поэтому нам было интересно, возможно ли получение в этих условиях стабильных пленок, плотно заполняющих поверхность графита. На Рис. 3.1.-4. представлены изображения топографии структур, образованных полиэлектролитами при разном числе их нанесения из 50 мМ фосфатного буфера, содержащего 0,1 М NaCl (рН 7,0), на поверхность ВОПГ. Как видно, образование плотной пленки в условиях высокой ионной силы возможно, однако для этого требуется не менее 4-х последовательных погружений подложки в соответствующие растворы полиэлектролитов. кратном нанесении полиэлектролитов. Размер изображений 2x2 мкм.
Для того чтобы понять, является ли эта тенденция общей, была исследована другая пара полиэлектролитов. В качестве поликатиона использовался поли-Ы-этил-4-винилпиридиний Вг (П4ВП), а в качестве полианиона - полиакриловая кислота (ПАК).
Топографические изображения системы П4ВП/ПАК приведены на Рис. 3.1. - 5. В данном случае степень заполнения поверхности графита также определяется количеством нанесений полиэлектролитов и возрастает с увеличением п. При этом структура П4ВП/ПАК, полученная 4-мя циклами нанесения, значительно более неоднородна по сравнению с системой ПДДА/ПАС (Рис. 3.1. - 4. В и Рис. 3.1.-5. В): помимо разрывов в ней присутствуют области, в которых сквозь верхние слои полиэлектролитов просматриваются нижележащие.
Таким образом, можно выделить две общие тенденции формирования наноструктур полиэлектролитов их адсорбцией из растворов с высокой ионной силой. Для образования плотных пленок на поверхности графита необходимо не менее 4-х последовательных погружений подложки в соответствующие растворы полиэлектролитов. Топографически равномерные пленки, тем не менее, могут быть неоднородными по своей внутренней структуре, и степень неоднородности определяется природой образующих пленку полимеров. Последний вопрос представляет интерес в контексте создания ферментных биосенсоров методом ПНП, так как этот параметр, очевидно, будет влиять на их адгезионные характеристики и стабильность. Задача исследования неоднородности поверхностной структуры полиэлектролитных нанопленок может быть эффективно решена с использованием метода сканирующей зондовой спектроскопии (СЗС).
