Введение к работе
1. Актуальность темы.
Циклодекстрины (ЦД) - уникальная группа химических веществ, обладающих специфической функциональной активностью. Они представляют большой интерес для пищевой, фармацевтической, химической и других отраслей промышленности благодаря способности образовывать комплексы включения. ЦД используются для стабилизации летучих эфирных масел, ароматических веществ и специй, повышения устойчивости и улучшения усвояемости витаминов, пролонгирования действия лекарств, снижения их вредного воздействия, устранения нежелательного запаха и вкуса и т.д.
Поскольку синтез этих соединений химическими методами очень дорог, в промышленных масштабах ЦД можно получать лишь ферментативным путем при помощи специальных ферментов, называемых цнклодекстрипглюканотрансферазами (ЦГТазами). В целом процесс получения ЦД сводится к следующим основным этапам: 1) культивирование микроорганизма - продуцента ЦГТаз, 2) выделение ферментного препарата из культуральной жидкости, 3) получение ЦД с помощью препарата ЦГТ-азы.
В настоящее время выпуском ЦД заняты фирмы в различных странах мира. Бесспорное лидерство в производстве ЦД принадлежит китайским, а также японским, индийским и американским фирмам. Стоимость Р-ЦД, промышленного производства в зависимости от степени очистки составляет 1,5-8$ США за кг, ос-ЦД - 25-40$ США за килограмм и у-ЦД 40-100$ США за кг.
В настоящее время в России производство ЦГТ-аз и ЦД отсутствует, хотя исследования в этом направлении проводились. Тем не менее, во всех высокоразвитых странах интерес к комплексам включений на основе ЦД только возрастает. Поэтому разработка новых научно-обоснованных биотехнологий производства ЦГТ-аз и ЦД актуальна и перспективна.
Настоящая работа посвящена разработке технологий у-ЦГТазы, у-ЦД и комплексов включения на основе у-ЦД.
Цель и задачи исследования. Основные цели диссертационной работы состояли в поиске нового активного продуцента у-ЦГТ-азы, разработке технологии очищенного ферментного препарата у-ЦГТ-зы Г10Х, получении у-ЦД и комплексов включения на его основе.
Для достижения поставленных целей решались следующие задачи:
скрининг микроорганизмов-продуцентов ЦГТ-аз, выделенных из природных мест обитания, с целью отбора штамма, обладающего наибольшей у-ЦГТ-азной активностью;
идентификация штамма-продуцента у-ЦГТ-азы на основании изучения совокупности его морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик;
подбор оптимального состава питательной среды и условий культивирования на основе изучения физиолого-биохимических особенностей штамма-продуцента;
разработка технологии получения ферментного препарата у-ЦГТ-азы Г10Х;
биоконверсия крахмала в циклодекстрины с помощью полученного препарата у-ЦГТазы Г10Х;
выделение у-ЦД из реакционной смеси;
- получение комплексов включения на основе у-ЦД.
Научная новизна работы.
Проведен направленный скрининг микроорганизмов, обладающих у-ЦГТазной активностью, выделенных из различных видов почв.
В результате скрининга для исследований отобран штамм-продуцент у-ЦГТазы с максимальной активностью (15 ед/см3). На основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры новый штамм, продуцирующий у-ЦГТазу, идентифицирован как Bacillus thuringiensis АЛБ.
Впервые в РФ выделен продуцент ЦГТазы, трансформирующий крахмал преимущественно в у-ЦД. На основе анализа экспериментальных данных и выявленных зависимостей накопления бациллярным штаммом у-ЦГТазной активности от условий культивирования и выхода фермента, от параметров выделения и очистки, разработана биотехнология ферментного препарата у-ЦГТазы.
При использовании полученного в результате скрининга нового штамма-продуцента у-ЦГТазы с учетом экспериментально обоснованных зависимостей выхода у-ЦД от способов предварительной обработки крахмала, разработана биотехнология получения у-ЦД.
Разработаны способы получения комплексов включения у-ЦД с рыбьим жиром и витаминами Е и В2 на основе молекулярных моделей и анализа физических методов обработки.
Выявлено положительное влияние процесса комплексообразования с у-ЦД на устойчивость биологически активных веществ (БАВ) к воздействию света и кислорода воздуха.
Практическая значимость и реализация результатов работы.
В результате скрининга почвенных ЦГТ-активпых изолятов бактерий создана лабораторная коллекция микроорганизмов, секретирующих у-специфпчные ЦГТ-азы. На основе наиболее перспективного штамма коллекции Bacillus thuringiensis АПБ разработана биотехнология получения препарата у-ЦГТазы Г10.Х.
Разработаны проекты Лабораторного регламента и Технических условий на ферментный препарат у-циклодекстринглюканогрансфераза Г10Х. Проведена наработка препарата у-ЦГТ-азы Г10Х в условиях опытного производства. Получешше результаты подтверждены актом ЗАО «Фармацевтическая фирма «Лекко».
Проведен расчет экономической эффективности разработанной технологии у-ЦГТазы Г10х, который показал, что оптовая цена ферментного препарата находится на уровне мировых рыночных цен и составляет 2174 руб за 1 кг.
Штамм бактерий Bacillus thuringiensis АПБ депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-11066. Подана заявка на выдачу патента РФ «Штамм бактерий Bacillus thuringiensis АПБ -продуцент у-циклодекстринглкжанотрансферазы»
Получены комплексы включения рыбьего жира и витаминов Е и В2 с у-ЦД с молярным соотношением компонентов от 1:1 до 1:5. В лабораторных условиях кафедры «Технология продуктов общественного питания» МГУПП изготовлен бисквит с добавлением комплексов витаминов Е и В2 с у-ЦД. Показано, что применяемые комплексы не оказывают негативного влияния на форму, структуру и консистенцию бисквита и аромат продукции, улучшают вкус и повышают пищевую ценность получаемых продуктов, обогащая их БАВ. Результаты проведенной работы подтверждены актом лабораторных испытаний.
На заводе ОАО «Московская косметическая фабрика «Рассвет» произведена опытная партия крема, содержащего комплекс включения витамина Е с у-ЦД.
Добавление комплекса в состав крема не влияло на его внешний вид, цвет, запах и стабильность. Комплекс витамина Е с у-ЦД позволяет предупреждать преждевременное старение кожи и снижает вредное воздействие ультрафиолетового излучения. Полученные результаты подтверждены актом.
Подана заявка на патент «Штамм бактерий Bacillus thvringiensis ЛПБ -продуцент у-циклодекстринглюканотрансферазы» от 01.11.2011 г.
Апробация работы.
Основные положения работы докладывались на Российских и международных конференциях и симпозиумах: V Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва 2009); XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009» (Москва 2009); III Международной научно-технической конференции «Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности (приоритеты развития)» (Воронеж 2009); VII Международной научно-практической конференции и выставке «Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты» (Москва 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 1 заявка на патент РФ, где отражены основные положения диссертации
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 202 источника, и 11 приложений. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включает 21 таблицу и 31 рисунок.
