Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 7
1.1 Состав зерна и характеристика высокомолекулярных полимеров пшеницы, ржи и ячменя: 7
1.1.1 Крахмал 10
1.1.2 Белки 13
1.1.3 Некрахмальные полисахариды 16
1.2 Ферментные препараты, необходимые для гидролиза высокомолекулярных полимеров зернового сырья : 24
1.1.1 Амилолитические ферментные препараты 24
1.2.1.1 а-амилазы 24
1.2.1.2 Глюкоамилаза 26
1.2.1.3 Пуллуланаза 27
1.2.2 Ферменты, гидролизующие некрахмальные полисахариды 29
1.2.3 Протеолитические ферментные препараты 33
1.3 Спиртовые дрожжи 37
2 Экспериментальная часть 45
2.1 Материалы и методы исследований 45
2.1.1 Объекты исследований 45
2.1.1.1 Сырье 45
2.1.1.2 Промышленные расы спиртовых дрожжей. Чистые культуры 45
2.1.1.3 Ферментные препараты микробного происхождения 45
2.1.2 Методы исследований 47
2.1.2.1 Определение ферментативных активностей 48
2.1.2.2 Общие методы анализа 49
2.1.2.3 Исследование процессов дрожжегенерации 50
2.1.2.4 Колориметрическое определение общего количества растворимых несброженных углеводов 51
2.1.2.5 Определение содержания побочных продуктов брожения 51
2.2 Результаты и обсуждение 52
2.2.1 Исследование влияния различных ферментативных систем на степень гидролиза зернового сырья. Скрининг мультиэнзимных комплексов, способствующих эффективному сбраживанию крахмалистого сырья в этанол 52
2.2.1.1 Анализ и биохимическая характеристика ферментных препаратов.. 53
2.2.1.2 Исследование влияния ферментативных комплексов различного спектра действия на степень гидролиза высокомолекулярных полимеров зернового сырья 69
2.2.1.3 Подбор мультиэнзимных комплексов, способствующих эффективному сбраживанию различных видов зернового сырья... 81
2.2.2 Исследование влияния новых рас спиртовых дрожжей на эффективность биоконверсии зернового сырья в этанол с целью интенсификации спиртового брожения 116
2.2.2.1 Исследование влияния повышенных температур и осмоса на морфологические и культуральные особенности спиртовых рас дрожжей 117
2.2.2.2 Изучение устойчивости новых рас дрожжей к повышенным концентрациям спирта и осмоса 126
2.2.2.3.Интенсификация процесса брожения с применением термотолерантных рас дрожжей 132
2.2.2.4 Исследование метаболизма спиртовых рас дрожжей и его влияние на качественный состав летучих веществ, синтезируемых в процессе брожения 134
2.2.3 Исследование влияния новой расы дрожжей с термотолерантными и осмофильными свойствами и комплекса гидролитических ферментов на эффективность сбраживания зернового сусла в производственных условиях 149
2.2.4 Расчет экономической эффективности процесса брожения при использовании подобранного комплекса ферментов и расы дрожжей Saccharomyces cerevisiae 985-Т 163
Выводы 166
Список использованной литературы
- Ферментные препараты, необходимые для гидролиза высокомолекулярных полимеров зернового сырья
- Ферменты, гидролизующие некрахмальные полисахариды
- Ферментные препараты микробного происхождения
- Исследование влияния новых рас спиртовых дрожжей на эффективность биоконверсии зернового сырья в этанол с целью интенсификации спиртового брожения
Введение к работе
Актуальность темы
Важнейшим направлением развития спиртовой отрасли является повышение эффективности производства, увеличение выхода и качества целевой продукции, снижение ее себестоимости.
За последние 10 лет вследствие сокращения объемов выпуска алкогольной продукции, нестабильности работы спиртовых заводов, низкой рентабельности производства значительно понизился уровень технической оснащенности предприятий. Поэтому, создание новых ресурсосберегающих технологий без больших материальных затрат с целью интенсификации спиртового брожения, снижения потерь сырья, сокращения расхода теплоэнергетических ресурсов, повышения качества и конкурентоспособности продукции является важной и актуальной задачей спиртовой отрасли.
Повышение рентабельности спиртового производства возможно на основе использования высокоактивных биологических катализаторов различного спектра действия, а также новых рас дрожжей с термотолерантными и осмофильными свойствами.
Одним из перспективных направлений в совершенствовании технологии спирта становится рациональное использование всех высокомолекулярных полимеров зернового сырья с целью его экономии и повышения выхода конечного продукта - спирта.
Разрабатываемые научные основы новой технологии будут учитывать состав белковых веществ и некрахмальных соединений различных видов зернового сырья, для повышения степени биоконверсии которых планируется исследовать и подобрать специальные мультиэнзимные композиции целевого назначения. Применение новых комплексных ферментных препаратов (ФП) позволит эффективно использовать компоненты зернового сырья, интенсифицировать биотехнологические процессы, повысить выход спирта.
Новые направления развития технологии производства спирта ставят также такие задачи, как повышение концентрации перерабатываемого сусла, проведение брожения при повышенных температурах и повышенной крепости этанола в бражке. В таких условиях необходимы дрожжи, обладающие осмофильностью, термостабильностью и высокой бродильной активностью. Поэтому скрининг активных рас дрожжей и исследование их физиолого-биохимических свойств является также перспективным направлением совершенствования технологии производства спирта.
Цель и задачи исследования Целью настоящей работы является создание интенсивной технологии получения спирта на основе комплексного использования мультиэнзимных систем целевого назначения и новых рас спиртовых дрожжей с термотолерантными и осмофильными свойствами. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
• провести анализ и исследовать биохимическую характеристику ферментных препаратов различного спектра действия для разжижения и осахаривания крахмала сырья, протеолиза белковых веществ и гидролиза некрахмальных полисахаридов зернового сырья;
• научно обосновать и разработать мультиэнзимные комплексы целевого назначения, обеспечивающие повышение эффективности биоконверсии высокомолекулярных полимеров основных видов зернового сырья, используемого в спиртовом производстве;
• провести анализ промышленных и новых отселекционированных рас спиртовых дрожжей и осуществить скрининг дрожжей с термотолерантными и осмофильными свойствами; • изучить влияние температуры, концентрации сухих веществ зернового сусла и спирта на жизнедеятельность дрожжей;
• разработать и развить подходы к совершенствованию технологии спирта на основе выявления физиолого-биохимических особенностей дрожжей, обуславливающих условия брожения и качество получаемого спирта;
• провести производственные испытания по применению комплексных ферментных препаратов и новых рас дрожжей для интенсификации процессов дрожжегенерации и спиртового брожения.
Научная новизна
На основании установленных закономерностей выявлен механизм интенсификации спиртового брожения при использовании ферментативных систем с различной специфичностью действия и новых рас спиртовых дрожжей с термотолерантными и осмофильными свойствами.
Исследована зависимость действия подобранных ферментативных комплексов на степень деструкции высокомолекулярных полимеров зернового сусла от длительности гидролиза, дозировки и соотношения глюкоамилазы, протеаз, р-глюканазы, ксиланазы и целлюлазы, входящих в комплекс.
Впервые установлена взаимосвязь между степенью биоконверсии полимеров зерна и эффективностью сбраживания зернового сусла. Получен новый экспериментальный материал по изучению закономерностей влияния ферментативных систем с различной специфичностью действия на степень гидролиза крахмала, белка и Р-глюкана зернового сырья, на скорость процессов генерации дрожжей, спиртового брожения и образование этанола.
Установлен синергизм действия ферментов подобранных комплексов на степень биоконверсии полимеров зерна и сбраживания зернового сусла.
Впервые проведены сравнительные исследования различных рас спиртовых дрожжей, используемых в производстве, по морфологическим, физиолого-биохимическим и культуральным признакам. Осуществлен скрининг наиболее активных рас спиртовых дрожжей 985-Т и 987-0 с термотолерантными и осмофильными свойствами. Изучено влияние температуры, концентрации спирта и сухих веществ сбраживаемого сусла на физиолого-биохимические свойства исследуемых рас дрожжей.
В результате проведенных исследований впервые установлена биосинтетическая способность дрожжей р. 985-Т и 987-0 к целенаправленному синтезу этанола и пониженному синтезу побочных метаболитов по сравнению с дрожжами р.ХП. Исследованы закономерности образования этанола и побочных продуктов брожения в зависимости от используемой расы дрожжей, субстрата, температуры брожения и осмоса. Впервые исследовано влияние экстремальных температур и осмоса на образование спирта и сопутствующих метаболитов.
Исследована динамика сбраживания новыми расами спиртовых дрожжей зернового сусла с повышенной концентрацией сухих веществ, обработанного подобранными ферментативными комплексами. Теоретически обоснованы и экспериментально проверены в работе пути интенсификации процессов дрожжегенерации и спиртового брожения. Практическая значимость
На основе установленных закономерностей подобраны ферментативные системы, обеспечивающие эффективный гидролиз высокомолекулярных полимеров пшеницы, ржи и ячменя; разработаны нормы расхода ферментов комплекса протеолитического, Р-глюканазного, ксиланазного и целлюлазного действия.
Проведенные исследования по сравнительному анализу спиртовых дрожжей позволили дать обоснованные рекомендации по выбору расы дрожжей, которые позволяют эффективно вести технологический процесс и получать спирт высокого качества с пониженным содержанием побочных продуктов брожения. На основе экспериментального материала предложен новый интенсивный способ спиртового брожения с сокращением общей длительности биотехнологических процессов на 30-40 ч (дрожжегенерации — на 8-10 ч и основного брожения на 22-30 ч).
Научно обоснована и экспериментально подтверждена разработанная технология интенсификации спиртового брожения на основе целенаправленного использования комплексных ферментных препаратов и новых рас дрожжей, позволяющая:
- интенсифицировать технологические процессы осахаривания, генерации дрожжей и спиртового брожения;
- повысить степень использования зернового сырья, улучшить реологические свойства сусла;
- перерабатывать высококонцентрированное сусло, сократить объем барды;
- снизить образование побочных метаболитов, повысить качество и выход спирта.
Результаты работы подтверждены в производственных условиях Мичуринского экспериментального завода, Северо-Осетинского «Рос.Слава»; разработаны Технологические инструкции по применению комплексного ферментного препарата КФПА и новой расы дрожжей Saccharomyces cerevisae 985-Т (ТИ №10-22623-02) в спиртовом производстве. Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы представлены на следующих конференциях: Международная конференция молодых ученых «От фундаментальной науки к новым технологиям» (Москва-Тверь, 2001 г); Всероссийская научно-техническая конференция с международным участием «Качество и безопасность продовольственного сырья и продуктов питания» (Москва, 2002г); Научно-практическая конференция «Технологические аспекты комплексной переработки специального назначения» (Углич, 2002г).
Публикации
По материалам диссертационной работы опубликовано 9 печатных работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложений. Диссертационная работа изложена на 208 страницах машинописного текста, содержит .
Ферментные препараты, необходимые для гидролиза высокомолекулярных полимеров зернового сырья
Изучение амилаз началось с открытия Кирхгофом в 1814 г. вещества, способного превращать крахмал в сахар. Препарат, полученный Кирхгофом из пшеничной муки, обладал способностью разжижать крахмальный клейстер и превращать его в сахарный сироп. Уже в этих первых исследованиях Кирхгоф отметил губительное действие на это вещество серной кислоты. В это же время он подчеркнул, что сахарообразование является необходимым условием для сбраживания крахмалсодержащих материалов и, таким образом, положил начало научному объяснению технологии брожения.
Биологически активное вещество в дальнейшем было выделено из солода и подверглось детальному изучению. Было обнаружено , что его действие на крахмал проходит через три стадии — разжижение, декстринизацию и осахаривание. Это привело к признанию существования в солоде двух различных компонентов, которые в дальнейшем были получены в отдельности и названы а-амилазой (декстринирующий компонент) и 3— амилазой (осахаривающий компонент) (60).
В бродильной промышленности широко используются микроскопические грибы рода Aspergillus. Основными компонентами амилолитического комплекса этих грибов следует считать а-амилазу, действие которой подобно действию а — амилазы солода, и глюкоамилазу — осахаривающий фермент. Конечным продуктом полного гидролиза крахмала здесь является глюкоза (60). В настоящее время наиболее широкое распространение в спиртовом производстве получили ФП а-амилазы, синтезируемые бактериями рода Bacillus.
Согласно современной классификации в номенклатуре ферментов а— амилаза получила название а-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза, КФ 3.2.1.1. Роль а-амилаз при гидролизе крахмала исключительно велика. Из трех основных функций при действии на клейстеризованный крахмал (разжиженние, декстринизация, осахаривание) разжижение и декстринизация зависят от а-амилаз. Они атакуют не только клейстеризованный, но и нативный крахмал, разрушая крахмальные зерна. Действуя на целое крахмальное зерно, а-амилаза атакует его, разрыхляя поверхность и образуя каналы и бороздки, т. е. как бы раскалывает зерно на части. Клейстеризованный крахмал гидролизуется ею с образованием на окрашиваемые йодом продукты, в основном состоящие из микромолекулярных декстринов; а-амилазы действуют на а-1,4— глюкозидные связи, расщепляя амилозу внутри ее цепи, т. е. являются эндоамилазами. В результате этого образуются а-декстрины, дальнейший гидролиз которых, в конечном счете, дает мальтозу и глюкозу.
К группе амилолитических ферментов относятся также глюкоамилаза, пуллуланаза и некоторые другие ферменты.
Фермент глюкоамилаза (а-1,4-глюкан глюкогидролаза, КФ 3.2.1.3) в литературе известен под различными названиями: амилоглюкозидаза, у-амилаза, лизосомальная а-глюкозидаза, кислая мальтаза, матулаза, така-амилаза В и экзо-1,4-а-глюкозидаза. Глюкоамилаза катализирует последовательное отщепление концевых остатков а-О-глюкозы с нередуцирующих концов субстрата. Это фермент с экзогенным механизмом воздействия на субстрат.
Многие глюкоамилазы обладают способностью так же быстро, как и а— 1,4-связь, гидролизовать а-1,6-глюкозидные связи. Но это происходит только в том случае, когда за а-1,6-связью следует а-1,4-связь, поэтому декстран ими не гидролизуется. Отличительной особенностью глюкоамилаз является способность в десятки раз быстрее гидролизовать высокополимеризованный субстрат, чем олиго- и дисахариды (45).
В литературе высказывается мнение, что механизм атаки субстрата глюкоамилазой может быть двух типов: либо одноцепочечной, либо множественной атаки, и что активный центр имеет подцентровую структуру.
Следует заметить, что не все глюкоамилазы микробного происхождения способны полностью гидролизовать крахмал до глюкозы. Еще в 60-х годах И.Фукумото предложил все микробные глюкоамилазы разделить на два типа: полностью гидролизующие крахмал до глюкозы и гидролизующие крахмал до глюкозы на 80-85 %.
Ферменты, гидролизующие некрахмальные полисахариды
В последнее время все больше внимание в спиртовом производстве уделяется некрахмальным полисахаридам (клетчатке, гемицеллюлозам, гумми), которые по традиционной технологии не используются для получения этанола (70, 181, 185). Гидролиз этих веществ зерна может дать дополнительный выход готового продукта на 3-5 % (21, 103). О влиянии некрахмальных полисахаридов на ход производственного процесса известно давно (70, 181, 191). Так, кроме белков, технологическую сложность извлечения крахмала определяют также гемицеллюлозы и пентозаны.
Определенную трудность в переработке некоторых злаков представляют собой слизи. Последние характеризуются как вещества или смесь веществ углеводного характера, способные набухать в воде и давать вязкие растворы. Установлено, что слизи препятствуют набуханию крахмала и понижают атакуемость его ферментами.
При приготовлении ржаного и ячменного сусла необходимы ФП целлюлолитического действия для гидролиза некрахмальных полисахаридов. Так как эти виды сырья характеризуются повышенным содержанием целлюлозы, гемицеллюлозы и гумми-веществ, атакуемость крахмала амилолитическими ферментами затруднена за счет высокой вязкости разваренной массы.
Известно, что целлюлоза по молекулярному строению является высокополимерным полисахаридом, состоящим из остатков глюкозы, соединенных между собой Р" 1,4-глюкозидными связями. Целлюлоза — линейный полимер. Большинство остатков глюкозы в целлюлозе содержат три свободных гидроксила у 2,3 и 6-го углеродных атомов, которые являются основой для образования водородных связей и формирования прочных волокон (45).
При характеристике целлюлолитических ферментов следует обязательно учитывать состояние субстрата — целлюлозы. Различают два вида целлюлозы: нативная, ничем не обработанная целлюлоза, которая полностью сохранила исходное строение и структуру микрофибрилл и, так называемая, модифицированная целлюлоза, т. е. частично обработанная, в которой нарушены водородные связи и фибрилярная структура волокна.
В соответствии с номенклатурой и классификацией ферментов к комплексу целлюлаз, участвующих в деструкции целлюлозы, следует отнести: 1,4-р-1 -глюкан-4-глюканогидролазы (КФ 3.2.1.4.). Это эндоглюканаза, способная неупорядоченно гидролизовать в целлюлозе, лихенине, в р-глюканах зерна Р 1,4-связи, помимо целлюлоолигосахаридов может образовываться в реакционной среде глюкоза и целлотриозы; 1,4-р 0-глюканглюкогидролаза (КФ 3.2.1.74). Это зкзо-1,4-(3 глюкозидаза, которая гидролизует 1,4-связи в 1,4-p-D глюканах с последовательным отщеплением глюкозных остатков; 1,4-Р-Е)-глюканцеллобиогидролаза (КФ 3.2.1.91.). Это целлобиогидролаза, которая отщепляет целлобиозу с нередуцирующих концов целлоололигосахаридов; P-D-глюкозидглюкогидролаза (КФ 3.2.1.2.1.). Это Р-глюкозидаза, или целлобиаза, которая, гидролитически отщепляет концевые нередуцирующие остатки P-D-глюкозы с освобождением молекулы глюкозы. Фермент может гидролизовать P-D— глюкозиды и целлобиозу. При испльзовании растительного сырья немаловажную роль играют гемицеллюлазные ферменты. С помощью этих ферментов можно получать глюкозу и пентозы.
Гемицеллюлозы — полисахариды, входящие в состав растительных стенок, соединяющих клетки с образованием тканей. Это — гетерополисахариды, состоящие их двух-четырех типов Сахаров. Обычно основная цепь состоит из остатков Сахаров одного типа, связанных между собой Р 1,4-связями, а боковые ветви образованы остатками других Сахаров, присоединенных к основной цепи.
Правильнее все гемицеллюлозные вещества разделить на две группы: Р-глюканы и пентозаны, а гумми-вещества рассматривать отдельно. р-глюканы - высокомолекулярные полимеры; при полном гидролитическом расщеплении образуют одну глюкозу. По структуре р-глюканы могут быть линейными и разветвленными, р-глюканы ячменя представляют почти линейные полисахариды, где остатки глюкозы почти на 70 % соединены (3-1,4 и (5-1,3-связями (30 %), которые могут быть в цепи только одиночными.
Пентозаны имеют ветвистое строение, они состоят из остатков ксилаз, арабиноз и небольшого количества остатков галактуроновой кислоты. Основной тип связей - р—1,4- ,а в местах ветвления - р 1,3-связь (45).
Гумми-вещества по своему составу близки к гемицеллюлозам (р-глюкану и пентозанам). Считается, что они являются либо продуктами незавершенного синтеза гемицеллюлаз, либо продуктами их частичного гидролиза.
По данным литературы, гумми-вещества состоят из глюкозы, галактозы, иногда маннозы, ксилозы, арабинозы, рамнозы и остатков уроновых кислот, т. е. тех же веществ, которые образуются при гидролизе гемицеллюлоз.
Все гемицеллюлазные ферменты можно разделить на три группы: p-D— глюканазы, р-ксиланазы и р-глюкозидазы (45).
К P-D-глюканазам относят группу ферментов, катализирующую расщепление р-глюканов с Р 1,2-, р-1,3-, Р-1,4- и Р-1,6-связями. В эту группу входят шесть энзимов: целлюлаза, или эндо-1,4-Р-глюканаза, эндо-1,3-р-глюканаза, эндо-1,6-Р-глюканаза, ламинариназа, лихеназа и эндо-1,2 Р-глюканаза.
Ферментные препараты микробного происхождения
В спиртовой промышленности, перерабатывающей крахмалистое сырье, широко применяются ферменты гидролитического действия. Для этой цели ранее использовался зерновой солод, который являлся источником не только целого комплекса гидролаз — ферментов амилолитического, протеолитического, целлюло- и цитолитического действия, но и азотистого питания для дрожжей (18-20, 142). При использовании солода осуществлялись процессы гидролитического расщепления крахмала сырья, его клеточных стенок и белковых веществ собственными ферментами солода. В настоящее время взамен солода широкое применение нашли концентрированные ферментные препараты амилолитического действия (101,102).
Из анализа патентной и специальной литературы, приведенной в литобзоре, следует, что одним из резервов повышения эффективности спиртового производства является подбор полиферментного комплекса, обеспечивающего биоконверсию всех высокомолекулярных полимеров зернового сырья. В связи с тем, что состав основных полимеров зерна зависит от вида зерновой культуры, используемой в производстве, необходимо провести исследования по изучению влияния различных ферментативных систем на степень гидролиза и полноту сбраживания основных зерновых культур, наиболее широко применяемых на спиртовых заводах, таких как, пшеница, рожь и ячмень. Создание оптимальных мультиэнзимных комплексов для каждого вида сырья позволит более рационально использовать все составные компоненты зернового сырья, интенсифицировать процессы дрожжегенерации и брожения, снизить потери сырья, повысить выход целевого продукта - этанола.
Анализ и биохимическая характеристика ферментных препаратов
На первом этапе исследований проведён анализ концентрированных ферментных препаратов отечественного и импортного производства с целью подбора эффективного ферментативного комплекса для рационального и полного использования составных частей зернового сырья.
Исследовали ферментные препараты различного спектра действия, обладающие гидролитической способностью по отношению к высокомолекулярным полимерам зернового сырья.
Анализировали ферментные препараты (ФП) - источники а-амилазы, применяемые для разжижения крахмала: Амилосубтилин, Зимаджунд, Ликвамил и др.; для осахаривания - различные источники глюкоамилазы: Глюкаваморин, Глюкозим, Диазим Х4, Глюкоамилаза ГА и др (табл. 1).
С целью подбора протеолитических ферментов, осуществляющих гидролиз белковых веществ растительного сырья, исследовали протеазы различного происхождения: Амилопротооризин, Протосубтилин, БНЗ, Experimental GC 710, Протеаза GC, Алкалаза и др. Для гидролиза некрахмальных полисахаридов анализировали ферменты целлюлолитического действия: Целловиридин, Ксилоглюканофоетидин, Конверзим BG-N, Целлюлаза УК, Зимафилт, Ламинекс BG, Целлюлаза GC, Шеарзим, Брюзайм, Фиброзайм. Активность ферментных препаратов различного спектра действия представлена в таблице 1:
В качестве источника термостабильной-1 а-амилазы использовали ферментные препараты Амилолихетерм, Термамил 120-Л, синтезируемые Bacillus licheniformis. Источники термостабильной-2 а-амилазы - ФП Термамил SC и Зимаджунт N (продуцент В. stearothermophilus), мезафильной бактериальной амилазы — Амилосубтилин и БАН (продуцент В. Subtilis).
Термостабильные амилолитические препараты различались по уровню ферментативной активности в различных температурных диапазонах. Так уже при 60С уровень амилолитической активности термостабильной-2 а-амилазы возрастал в 7,3 раза, при 70С - 8,3 раза; у термостабильной-1 а-амилазы — в 2,0 и в 2,7 раза соответственно.
Немаловажное значение оказывает не только температурный режим гидродинамической и ферментативной обработки сырья, но и рН водно-мучной суспензии, при котором происходит разжижение и клейстеризация крахмала. Обычно он находится в интервале 5,5-6,5 и соответствует оптимальным пределам действия этих ферментов. В результате крахмал хорошо декстринируется, вязкость снижается, сусло разжижается и отличается хорошей подвижностью. Однако на спиртовых заводах величина рН водно-мучных замесов и зернового сусла варьирует в широком диапазоне: от 4,5 до 11,0. В этом случае требуется корректировка рН для создания оптимальных условий для действия ферментов или применения ФП с соответствующим для данных условий оптимумом рН.
В связи с этим было исследовано влияние значений рН субстрата на активность бактериальных а-амилаз (рис. 2). Новые кислотоустойчивые ФП термостабильной-2 а-амилазы выдерживали значение рН менее 5,0 (продуцент кислотоустойчивых амилаз - В. stearothermophilus); рН-оптимум действия этих ферментов находится в интервале 4,8-6,0. Для а-амилазы В. licheniformis оптимальный рН действия составляет 5,5-8,0.
Исследование влияния новых рас спиртовых дрожжей на эффективность биоконверсии зернового сырья в этанол с целью интенсификации спиртового брожения
Повышение рентабельности спиртового производства возможно на основе использования высокоактивных биологических катализаторов различного действия, подбор которых проведен в разделе 2.2.1, а также новых рас дрожжей с термотолерантными и осмофильными свойствами (48, 113).
Узким местом на спиртовых заводах остается бродильное отделение (73, 183). Увеличение производительности бродильного отделения путем установки дополнительных емкостей требует больших капитальных затрат. Повысить эффективность работы бродильного отделения можно как за счет расширения ассортимента используемых ферментов, так и за счет улучшения качества спиртовых дрожжей (114, 162). Новые направления развития технологии производства спирта ставят такие задачи, как повышение концентрации перерабатываемого сусла, проведение брожения при повышенных температурах и повышенной крепости спирта в бражке, обеспечения дальнейшего сокращения себестоимости спирта за счет экономии сырья, топлива и электроэнергии. В таких условиях нужны расы дрожжей, обладающие осмофильностью, термостабильностью и высокой бродильной активностью (120).
Кроме того, дрожжи - это лабильные микроорганизмы, которые могут изменять свои технологические свойства, следствием чего является нестабильность процесса спиртового брожения, повышение риска инфицирования производства (52), непредсказуемое качество конечного продукта(9, 13, 22,41, 44, 56, 112, 115, 124, 202, 203). Поэтому рациональный выбор устойчивой к неблагоприятным факторам расы дрожжей с термотолерантными и осмофильными свойствами является актуальным (144,148, 186).
Приведенный в литературном обзоре анализ используемых рас дрожжей на заводах отрасли, а также полученных из музеев ВНИИПБТ, ВНИИгенетики, УкрНИИспиртбиопрод, по бродильной активности, продуктивности и термотолерантности показал, что наряду с основными промышленными культурами Saccharomyces cerevisiae расы XII, Y-717, К-81 применяются новые расы дрожжей 985-Т и 987-0.
Из них наибольшую устойчивость к супраоптимальному осмосу и температуре проявляли термотолерантная и осмофильная раса дрожжей 985-Т и осмофильная раса 987-0, селекционированные в отделе биотехнологии ферментных препаратов ВНИИПБТ (146). Поэтому в дальнейшей работе в качестве объекта исследований использовали расу дрожжей 985-Т, а в отдельных экспериментах 987-0.
В связи с тем, что в стандартных условиях при 30С достаточно высокой бродильной активностью и продуктивностью обладают дрожжи расы XII, наиболее широко применяемые в течение длительного времени на спиртовых заводах, их использовали в качестве контроля в сравнительных исследованиях по эффективности применения расы 985-Т.
Следует отметить, что основная масса колоний промышленных рас дрожжей отличается, как правило, по морфологическим и культуральным свойствам! Поэтому на первом этапе работ проводили сравнительные исследования различных рас спиртовых дрожжей, применяемых в промышленности: расы XII и К-81, а также новых рас 985-Т и 987-0. Исследование морфологических особенностей промышленных рас дрожжей осуществляли на пшеничном сусле с концентрацией сухих веществ 17% и 28% при температурах 30С и 37С в зависимости от условий эксперимента.
Полученные результаты представлены на рис. 14-21 (фото) и в табл. 20,21
При сравнении рас дрожжей, выращенных на пшеничном сусле с концентрацией сухих веществ 17% при температуре 30С все дрожжи сбраживали сусло с нормативными показателями брожения. Выход спирта соответствовал 66,4-66,6 мл/100 г крахмала, концентрация несброженных углеводов - 0,23-0,26%. Концентрация дрожжевых клеток составила: у р.ХП - 125 млн/мл, у 985-Т - 145 млн/мл, у 987-0 - 142 млн/мл, у К-81 - 160 млн/мл. Новые расы дрожжей термотолерантная 985-Т и осмофильная 987-0 по морфологическим признакам были достаточно близки друг к другу.
При микроскопировании клетки исследуемых рас дрожжей по сравнению с р.ХП были так же крупными, округлыми, отмечено наличие клеток овальной, несколько удлиненной формы. Клетки р. К-81 были более мелкими и отличались более округлой формой (рис. 14-17). Средний размер клеток составил: р.ХП —7,2-12,5x2,5-7,5 мкм р.985-Т - 7,0-10,0x5,0-7,5 мкм р.987-0 - 7,0-12,0x5,0-7,5 мкм р.К-81 - 5,0-6,7x3,3-5,0 мкм
При повышенной температуре клетки рас XII, К-81, 987-0, как видно из рис. 16, 17 и табл. 21, претерпевали некоторые морфологические и культуральные изменения: преобладали клетки с утолщенными стенками, количество мертвых клеток на 18 ч брожения составило 19%, 9% и 12% соответственно. Повышение температуры до 37С не сказывалось на изменении морфологических признаков у расы 985-Т, которая проявила наибольшую термоустойчивость (рис. 16).
