Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор научно-технической и патентной литературы 6
1.1. Характеристика пектинсодержащего сырья 6
1.1.1.Пектиновые вещества растений 6
1.1.2. Другие полисахариды растительного сырья и их связь с пектином.. 8
1.1.3. Классификация и свойства пектинсодержащего сырья 9
1.2. Традиционная технология пектина и основные стадии его получения 12
1.3. Ферментативный гидролиз растительных полисахаридов 22
1.3.1. Общая характеристика процессов ферментативного гидролиза 24
1.3.2. Получение пектина с помощью ферментных препаратов 26^
1.3.3. Негидролитические ферментативные реакции 29
1.4. Свойства пектиновых веществ 31
1.5. Характеристика различных форм пектиновых препаратов 34
1.6. Использование ферментных препаратов и применение пектина в пищевой промышленности 36'
1.7. Заключение к литературному обзору. Цель и задачи исследования 39
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 41
2.1. Объекты исследования 41
2.1.1. Сырьё для получения пектина 41
2.1.2. Ферментные препараты 42
2.2. Методы исследования 44
2.2.1. Методы определения активностей ферментов 44
2.2.2. Методы определения количества и качества пектина 49
2.3. Схема постановки эксперимента 60
ГЛАВА 3. Изучение каталитических свойств и специфичности действия ферментных препаратов 62
3.1. Определение каталитической активности ферментных препаратов 62
3.2. Определение основных каталитических параметров действия карбогидраз и пектинлиаз 65
3.3. Определение оптимальных условий действия ферментных препаратов на субстраты пектинсодержащего сырья 68
3.3.1. Определение температурного оптимума 68
3.3.2 Определение оптимальных значений рН 70
ГЛАВА 4. Исследование процесса ферментативной обработки пектинсодержащего сырья 72
4.1. Анализ пектинсодержащего сырья 72
4.2. Влияние исследуемых ферментных препаратов на гелеобразующую способность пектинов 76
4.2.1. Определение температурного режима ферментативного процесса.. 78
4.2.2. Выбор гидромодуля (оптимальное соотношение вода: сырье) для ведения ферментативного процесса 80
4.2.3. Выбор оптимального рН для получения желирующего продукта 81
4.2.4. Определение влияния продолжительности ферментативного процесса на гелеобразующую способность пектина 81
4.2.5. Подбор режимов инактивации ферментных препаратов 83
4.2.6. Выбор оптимальной дозы ферментного препарата и их композиции..84
4.3. Определение основных параметров ферментативной обработки пектинсодержащего сырья 87
4.3.1. Определение гидромодуля (соотношения сырьё: вода) в гидролизуемой системе 88
4.3.2. Выбор дозы ферментных препаратов карбогидразного и лиазного действия 89
4.3.3. Определение продолжительности ферментативной обработки пектинсодержащего сырья 92
4.4. Создание композиции ферментов и соотношение пектинлиазы и карбогидразы для оптимизации процесса гидролиза 95
4.4.1. Выбор оптимального соотношения карбогидраз и лиаз с учетом их каталитической активности 96
4.4.2 Сравнительное исследование действия композиций ферментных препаратов на выход пектина и его физические показатели 98
4.4.3. Изучение продуктов ферментативного гидролиза при использовании композиции ферментных препаратов 100
ГЛАВА 5 Получение и характеристика препаратов низкоэтерифицированного пектина 103
ГЛАВА 6 Характеристика пектиновых препаратов, полученных в стендовых и заводских условиях 108
6.1. Характеристика пектиновых препаратов, полученных в стендовых условиях... 108
6.2. Промышленные испытания биотехнологического способа получения концентратов пектина 115
ГЛАВА 7. Техно-экономический раздел 118
Выводы и предложения 127
Список литературы
- Другие полисахариды растительного сырья и их связь с пектином..
- Методы определения активностей ферментов
- Определение оптимальных условий действия ферментных препаратов на субстраты пектинсодержащего сырья
- Выбор гидромодуля (оптимальное соотношение вода: сырье) для ведения ферментативного процесса
Введение к работе
Одним из важнейших направлений повышения эффективности
* современных пищевых производств является создание малоотходных
технологий, более широкое вовлечение в производство переработку вторичных
ресурсов, в том числе пектинсодержащих отходов сокового и сахарного
производств.
Пектин как природный полисахарид растительного происхождения, обладает желирующими, гелеобразующими и сорбционными свойствами и благодаря этому широко используются в пищевой промышленности.[93]
К сожалению, в настоящее время в отечественной промышленности используется пектин зарубежного производства, собственное производство этого ценного полисахарида в нашей стране отсутствует. В связи с этим, исследования в области получения пектина приобретают важное практическое значение.
* Как известно, до настоящего времени, промышленными источниками
пектина остаются цитрусовые, яблочные выжимки, свекловичный жом и др.
Для получения пищевого высокоэтерифицированного пектина из
используемого сырья наиболее приемлемым являются яблочные выжимки -
отходы сокового производства.
Наиболее современным и экологически чистым является биотехнологический способ, основанный на действии ферментов микробного происхождения, используемых в качестве гидролизующих агентов. Ферментативный гидролиз имеет ряд неоспоримых технологических преимуществ, главное из которых увеличение выхода пектина при сохранении его студнеобразующих свойств.
Такие исследования позволят предложить промышленности
w эффективные ферментные препараты микробного происхождения и режимы их
использования в технологии получения пектина, в том числе его модифицированных форм.
Другие полисахариды растительного сырья и их связь с пектином..
Высушенное сырьё характеризуется определенной формой и размером частиц, химическим составом, которые характерны для различных видов и партий сырья. Для производства пектина целесообразно использовать высушенное сырье, очищенное от минеральных веществ и подгоревших частиц, существенно влияющих на качественные показатели целевого продукта.
Общим для пектинсодержащего сырья является пористость его структуры. Наличие пор, их форма и размеры, а также химический состав частиц сырья определяют не только скорость массообменных процессов в системе пектинсодержащее сырьё - жидкость, но и определяют методы извлечения целевого вещества.
Извлечение пектина из высушенного пектинсодержащего сырья без предварительного набухания в воде приводит к снижению эффективности процесса в целом вследствие ухудшения массопередачи и деградации пектиновых веществ. [112]
Гидролиз протопектинового комплекса включает две стадии: расщепление связей между цепями макромолекул протопектина с другими компонентами клеточных стенок и гидролиз самих полимерных цепей протопектина с образованием продуктов гидролиза с различной молекулярной массой и растворимостью в воде.
Склонность к гидролизу определяется природой функциональных групп и связей в полимере. При гидролизе боковых функциональных групп изменяется химический состав полимера; при гидролизе основной цепи происходит деструкция и уменьшается молекулярная масса целевого вещества. При полном гидролизе образуются моногалактуроновые кислоты и некоторое количество олигоуронидов. [113]
Необходимым условием извлечения пектина из растительной ткани является проникновение гидролизующего агента в клетки исходного сырья.
Таким образом, гидролиз протопектина является процессом внутренним и определяется следующими основными факторами: температурой и продолжительностью процесса, показателем рН среды, типом гидролизующего агента, физико-химическими свойствами пектиновых веществ и морфологической структурой растительной ткани. От соотношения расхода масс твердой и жидкой фаз, размера частиц сырья процесс гидролиза не зависит. [98]
Основной технологической задачей процесса химической деструкции протопектина является достижение наиболее высокой степени гидролиза при минимальной его продолжительности минимальной деполимеризации пектиновых веществ.
Повышение температуры увеличивает движущую силу гидролиза, что является более эффективным, чем увеличение концентрации ионов водорода. Результаты исследований показали, что повышение температуры при снижении концентрации ионов водорода и продолжительности процесса позволяет получить пектиновые вещества с высокими качественными показателями. [81,43]
Одним из основных процессов в производстве пектина является экстрагирование. Однако в современной технологии пектиновых веществ процесс экстрагирования не изучен. При этом оптимальные параметры проведения процесса гидролиза в системе твердое тело - жидкость (температура гидролизной смеси, рН среды, соотношение расхода масс, характер взаимодействия фаз) являются одновременно и параметрами процесса экстрагирования. [98]
В технологическом процессе получения растительных полисахаридов ключевой стадией является экстракция - перевод полисахарида из ткани высших растений в среду растворителя. Экстракция представляет собой двухстадийный процесс, включающий превращение макромолекулы полисахарида из нерастворимой формы в растворимую и диффузию последней из ткани в раствор. Первый процесс осуществляется под действием гидролизующего агента, который по отношению к полисахаридам можно разделить на две группы - мягкие и жесткие. Для последних механизм экстракции дополняется третьей стадией - разрушение полисахаридов под действием гидролизующего агента. [131,133]
Методы определения активностей ферментов
Пектат-трансэлиминазной активности (ПТЭ) характеризует способность ферментного препарата катализировать расщепление а - 1,4 связей пектина с образованием продуктов реакции с ненасыщенными связями между 4 и 5 атомами углерода в молекуле галактуроновой кислоты.
За единицу активности принята такая масса фермента, которая за 1 час при 40 С вызывает образование ненасыщенных продуктов реакции, увеличивающих оптическую плотность реакционной смеси на 0,1. I.Приготовление раствора с массовой долей ферментного препарата 5 %.
На лабораторных весах в стаканчике вместимостью 250 мл взвешивают 50,00 г исследуемого препарата. Навеску тщательно растирают стеклянной палочкой с небольшим количеством дистиллированной воды до получения однородной массы. Затем количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 мл, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Раствор центрифугируют в течение 10 мин при 5000 об/мин. 2. Приготовление раствора с массовой долей свекловичного пектина 0,8 % и степенью этерификации не менее 35 %.
На лабораторных весах взвешивают 1,00 г пектина (массовая доля пектина в реактиве составляет 80 %, определяется по ГОСТ 20264.3-81) и осторожно, во избежание комкования, переносят в колбу с 60 мл дистиллированной воды. Полученный раствор при комнатной температуре перемешивают на магнитной мешалке в течение 1 - 1,5 ч. Затем раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и корректируют рН до 8,4 раствором трис/оксиметил/аминометана. Если рН раствора пектина превышает значение 8,4, корректировку проводят раствором соляной кислоты. Величину рН проверяют на приборе. После этого общий объем раствора пектина доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают и фильтруют через ватно-марлевый фильтр (4 слоя марли и 1 слой ваты). Раствор пектина хранят в холодильнике при 4 С не более двух суток. 3. Приготовление раствора хлористого кальция концентрацией 0,01 моль/мл. Навеску 1,11 г хлористого кальция количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 мл и доводят общий объем до метки дистиллированной водой. 4. Приготовление раствора трис/оксиметил/аминометана концентрацией 0,2 моль/мл. Навеску трис/оксиметил/аминометана 24,23 г количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 мл и доводят общий объем дистиллированной водой до метки. 5. Приготовление раствора соляной кислоты концентрацией 0,1 моль/мл. 3,2 мл (3,64) концентрированной соляной кислоты растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, затем количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 мл и доводят общий объем до метки дистиллированной водой. б. Приготовление буферного раствора трис-соляно кислого (рН 8,4),
Смешивают 25 мл раствора трис (оксиметил) аминометана с 18 мл раствора соляной кислоты и добавляют дистиллированную воду до 85 - 90 мл. При необходимости проводят подтитровку буферного раствора до значения рН 8,4 раствором основания или кислоты и доводят общий объем до 100 мл дистиллированной водой. Проведение анализа. Перед началом определения активности получают реакционную смесь путем смешивания растворов пектина, трис-солянокислого буфера и хлористого кальция в соотношении 5:2:1. Смесь хранят при комнатной температуре не более 8 -12 ч.
В опытную пробирку наливают 8 мл реакционной смеси и прогревают в течение 5 мин при 40 С. В прогретую реакционную смесь добавляют 2 мл раствора фермента и инкубируют в течение 0,25 ч (15 мин) при 40 С. Затем отбирают I мл смеси и переносят в пробирку, содержащую 9 мл раствора соляной кислоты (опытный раствор).
В контрольную пробирку, содержащую 9 мл раствора соляной кислоты, добавляют 0,2 мл раствора фермента, перемешав содержимое, добавляют 0,8 мл реакционной смеси (контрольный раствор).
Оптическую плотность опытного раствора (До) измеряют против контрольного раствора на спектрофотометре в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 1 см при длине волны 235 нм. Обработка результатов. Пектат-трансэлиминазную активность вычисляют по формуле ПТЭ = До-Ю/Т М-0,1, где ПТЭ - пектат-трансэлиминазная активность, ед/г; До - оптическая плотность опытного раствора; 10 - разведение реакционной смеси; T - время реакции, ч; М - масса фермента в реакционной смеси, г; 0,1 - условное увеличение оптической плотности в течение часа.
Оптическая плотность опытного раствора по отношению к контрольному должна быть в пределах 0,100 - 0,350. Если увеличение оптической плотности не достигает нижнего предела, то снижают разведение раствора ферментного препарата при его приготовлении.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое значение активности, полученное при анализе двух параллельных навесок препарата, относительное допускаемое расхождение между которыми не должно превышать 5 %. Результат округляют до первого десятичного знака. [18]
Определение оптимальных условий действия ферментных препаратов на субстраты пектинсодержащего сырья
Как видно из графика (рис.2) накопление продуктов ферментативной реакции идет по прямой, а при концентрации субстрата больше 100 мг/мл кривая выходит на прямую. Это значение соответствует максимальной скорости гидролиза для целлюлолитического фермента и имеет значение 2,8 мкг/мин, а Км= 38 мг/мл.
Из представленных данных (рис.3) видно, что концентрации субстрата, при которой кривая выходит на прямую равна 9 мг/мин. Это значение соответствует максимальной скорости гидролиза для глюканазы и имеет значение 17,0 мкг/мин, а Км= 4,4 мг/мл.
Из представленных данных (рис.4) видно, что значение максимальной скорости гидролиза: для пектинлиазы Bacillus macerans она равна 33,2 мкг/мин, а для пектинлиазы Bacillus subtilis 19,3 мкг/мин.
Было установлено, что более специфичным ферментным препаратом при их сравнении является пектинлиазный препарат Bacillus macerans и Км = 27,0 мг/мл, а для пектинлиазы Bacillus subtilis Км = 42,0 мг/мл.
Как видно из графиков скорость реакции и Км имеет разные значения для используемых ферментных препаратов, и это объясняется различной природой полимерных субстратов и зависит от сложности образования продуктов реакции. Из представленных данных видно, что из карбогидраз наибольшей субстратной специфичностью к целлюлозе обладает ферментный препарат из культуры Trichoderma reesei, для глюканазы из культуры Bacillus subtilis, а к протопектину - пектинлиаза из культуры Bacillus macerans.
Скорость ферментативной реакции в большой степени зависит от температуры. Сначала, как и у всякой реакции, по мере повышения температуры скорость ферментативной реакции возрастает и достигает максимальной при определенной температуре, называемой оптимальной, которая различна для каждого фермента.
По мере дальнейшего повышения температуры начинается снижение скорости действия ферментов, которая прекращается полностью при повышенных температурах, специфичных для каждого фермента.
Температурный режим ферментативной обработки пектинсодержащего сырья отработан для четырех наиболее эффективных препаратов; пектинлиазы Bacillus macerans, а также карбогидраз: глюканазы и целлюлазы Trichoderma reesei., а также амилазы комплексного препарата из смешанных культур Bacillus subtilis и Penicillium emersonii. Температурный режим варьировали от 35 С до 70 С с интервалом 5аС. (рис.5)
Полученные зависимости позволяют выбрать оптимум температуры: для пектинлиазы Bacillus macerans, равный 45 С + 5 С, а целлюлазы Trichoderma reesei 55 С + 5 С. Исследуемая глюканаза Bacillus subtilis и амилаза комплексного препарата из смешанных культур Bacillus subtilis и Penicillium emersonii является термостабильными ферментами и проявляют оптимальную активность при температуре 60 С + 5 С.
Немалое влияние на скорость ферментативной реакции, а следовательно на активность фермента, оказывает рН среды. Его оптимальные значения находятся в довольно узких пределах.
Взаимодействие фермента и субстрата зависит от распределения зарядов в молекуле фермента, которая содержит различные ионизированные группы. Изменение рН среды изменяет состояние ионизации этих групп, что может привести к повышению или снижению скорости реакции.
Определение активности ферментных препаратов проводили в зоне рН от 4,6 - 5,6, что и соответствует естественному рН смеси сырья с водой. Исследования проводили в диапазоне рН от 2 до 7 с шагом 1. (рис.6)
Известно, что для гидролиза растительного сырья недостаточно одного фермента, поэтому для полного гидролиза и экстракции пектиновых веществ необходим комплекс карбогидраз, которые входят в ферментный препарат из смешанных культур Bacillus subtilis и Penicillium emersonii.
Рисунок 7 Влияние рН на активность комплексного ферментного препарата из смешанных культур Bacillus subtilis и Penicillium emersonii Протеолитическая активность Глюканазная активность Целлюлолитическая активность Амилазная активность
По результатам проведенных исследований (рис. 6 и 7) видно, что для представленных ферментов оптимальные рН составляют: целлюлаза Trichoderma reesei рН 4,0 -5,0, глюканаза Bacillus subtilis рН - 6,0, протеаза и амилаза Bacillus subtilis и Penicillium emersonii рН - 6,0, а для пектинлиазы Bacillus macerans рН 6,0 - 7,5.
На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что для обработки пекти нсодержаще го сырья не требуется дополнительной корректировки естественного рН смеси сырья с водой. При гидромодуле 1:14 рН сырьевой массы соответствует оптимальным условиям действия ферментов. Из исследуемых ферментных препаратов наиболее отвечают этим требованиям: целлюлазы Trichoderma reesei, глюканазы Bacillus subtilis, пектинлиазы Bacillus macerans и Bacillus subtilis, а также комплексный препарат из смешанных культур Bacillus subtilis и Penicillium emersonii.
На следующем этапе исследованы пектинсодержащие промышленные виды сырья. Такое сырье имеет свои химические особенности, в частности, у плодов яблок по мере созревания происходит увеличение растворимого пектина, а у сахарной свеклы, напротив, в созревающих корнеплодах накапливается протопектин.
Различие в физико-химических показателях (табл.4) объясняется особенностью строения растительной клетки, а также спецификой первоначальной обработки сырья при получении основных продуктов: соков и сахара
Выбор гидромодуля (оптимальное соотношение вода: сырье) для ведения ферментативного процесса
Вода необходима для модификации сырья и является средой для протекания биокаталитических реакций и физико-химических процессов: набухание частиц сырья, обеспечение доступа ферментов к субстрату, выход пектина из пористой структуры набухших частиц сырья. Поэтому считали необходимым подобрать оптимальное соотношение сырьё: вода для эффективного ведения ферментативного гидролиза, варьируя гидромодуль от 1:4 до 1:14. (рис. 15)
Показано, что показатель гидромодуля ниже 1:9 не обеспечивает достаточного присутствия воды для полной экстракции пектина. Оптимальное соотношение сырьё: вода (гидромодуль) составляет 1:14. Такой режим позволяет провести полную экстракцию пектина.
Используя лабораторный метод выделения пектина, было проведено сравнительное исследование действия карбогидраз: целлюлаз, полученных из культур Trichoderma reesei и Trichoderma viride, глюканазу из Bacillus subtilis, комплексного препарата из Bacillus subtilis и Penicillium emersonii, а также пектинлиазы из культур Bacillus macerans и Bacillus subtilis с целью определения оптимальной дозы ферментных препаратов для достижения максимального выхода пектина, (рис. 16,17,18)
Доза препарата, % к массе сырья Рисунок 16 Влияние дозы ферментного препарата на выход пектина из свежих яблочных выжимок. -— Глюканаза Bacillus subtilis - Целлюлаза Trichoderma reese— Комплексный препарат из смешанных культур Bacillus subtilis и Penicillium emersonii —А— Пектин л иаза Bacillus macerans Для свежих яблочных выжимок оптимальная доза: - для карбогидраз Tnchoderma reesei и Bacillus subtilis - 0,02 % к массе сырья (1,52 единиц целлюлазы на грамм сырья и 0,21 единиц глюканазы на грамм сырья); - пектинлиаза Bacillus macerans - 0,05 % к массе сырья (178,7 единиц пектинлиазы на грамм сырья); - комплексного препарата из смешанных культур Bacillus subtilis и Penicillium emersonii - 0,08 % к массе сырья (0,056 единиц протеазы на грамм сырья).
На основании полученных данных выбрана оптимальная доза для наиболее эффективных ферментных препаратов разной направленности действия (на сухое яблочное сырьё): - для глкжаназы Bacillus subtilis - 0,1% к массе сырья (1,03 единиц глюканазы на грамм сырья); - для целлюлазы Trichoderma reesei - 0,1% к массе сырья (7,6 единиц целлюлазы на грамм сырья); - для комплексного препарата из смешанных культур Bacillus subtilis и Penicillium emersonii - 0,1 % к массе сырья (0,07 единиц протеазы на грамм сырья); - для пектинлиазы Bacillus macerans - 0,25 % к массе сырья (893,6 единиц пектинлиазы на грамм сырья).
При использовании свекловичного жома отмечено, что лучший результат получен с ферментным препаратом целлюлаза Trichoderma reesei, а не пектинлиаза Bacillus macerans (рис.17) в случае яблочных выжимок, что по всей вероятности связано с различием в строении и рН сырья.
Из приведенных данных видно, что оптимальной дозой для свекловичного свекловичный жом является: - для целлюлазы Trichoderma reesei - 0,6 % к массе сырья (45,6 единиц целлюлазы на грамм сырья); - для глюканазы Bacillus subtilis - 0,8 % к массе сырья (8,24 единиц глюканазы на грамм сырья); - для комплексного препарата из смешанных культур Bacillus subtilis и Penicillium emersonii - 0,6 % к массе сырья (0,42 единиц протеазы на грамм сырья).
Для выделения свекловичного пектина необходима большая доза ферментных препаратов, по сравнению с яблочным, а также достаточно использование одного фермента - целлюлазы Trichoderma reesei.
В заключении можно отметить, что в случае использования пектинлиазы наблюдается прямая зависимость между дозой препарата и накоплением пектина в экстракте. Это объясняется разрушением протопектина яблочных выжимок. При использовании целлюлаз также отмечается линейная зависимость накопления пектина от дозы препарата.
