Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Состояние вопроса и задачи исследований
1.1 Роль стартовых культур в формировании качества сырокопченых колбас 7
1.2 Биотехнологические свойства пропионовокислых и бифидобактерий 21
1.3 Антимутагенные свойства пробиотических микроорганизмов 33
1.4 Заключение по литературному обзору и задачи исследований 45
Глава 2. Организация проведения экспериментов. материалы и методы исследований
2.1 Объекты исследований и постановка эксперимента 48
2.2 Методы исследований 50
2.3 Статистическая обработка результатов 56
Глава 3. Теоретические и экспериментальные предпосылки применения пробиотических микроорганизмов при производстве сырокопченых колбас
3.1 Изучение биотехнологического потенциала пробиотических микроорганизмов 58
3.2 Исследование антимутагенных свойств пропионовокислых и бифидобактерий 61
3.3 Исследование устойчивости пробиотических микроорганизмов к поваренной соли 64
3.4 Влияние нитрита натрия на устойчивость и антимутагенную активность пробиотических микроорганизмов 67
Глава 4. Обоснование технологических параметров производства сырокопченых колбас с использованием стартовых культур
4.1 Выбор дозы вносимого бакконцентрата в фарш для сырокопченых колбас 71
4.2 Исследование процесса сушки сырокопченых колбас 76
4.3 Исследование санитарно-гигиенических показателей при производстве сырокопченых колбас 78
Глава 5. Влияние пробиотических микроорганизмов на формирование качества сырокопченых колбас
5.1 Сенсорная оценка сырокопченых колбас с пробиотическими свойствами 80
5.2 Исследование физико-химических показателей сырокопченых колбас 85
5.3 Изучение вкусо-ароматических свойств сырокопченых колбас 86
5.4 Влияние технологических факторов на антимутагенные свойства пробиотических микроорганизмов 93
5.5 Исследование качества сырокопченых колбас при хранении 95
Глава 6. Разработка технологии сырокопченых колбас с использованием пробиотических микроорганизмов
6.1 Особенности технологии производства сырокопченых колбас с использованием пробиотических культур И00
6.2 Управление качеством и контроль за безопасностью производства сырокопченых колбас с использованием принципов системы ХАССП ) 106
Выводы 132
Библиография 133
Приложения
- Биотехнологические свойства пропионовокислых и бифидобактерий
- Статистическая обработка результатов
- Исследование антимутагенных свойств пропионовокислых и бифидобактерий
- Исследование процесса сушки сырокопченых колбас
Введение к работе
При любом уровне экономического развития пищевой отрасли мясные изделия пользуются высоким потребительским спросом. Снижение ИХ себестоимости при гарантированном сохранении стандартного качества -важнейшее условие расширения ассортимента и увеличения объемов выпуска этого вида продукции. Одним из реальных путей решения этой задачи в настоящее время является разработка и внедрение новых технологий, ориентированных на обеспечение качества и безопасности мясных продуктов.
Перспективным направлением является реализация биотехнологических методов в мясной промышленности, связанная с созданием новых технологических решений, основанных на эффективном использовании как собственных ферментных систем биологических объектов, так и целенаправленно внесенных микроорганизмов (бактериальных стартовых культур), продуцирующих ферменты, белки, незаменимые аминокислоты и витамины. Многообразие технологических приемов обработки мясного сырья микроорганизмами позволяет вырабатывать готовые продукты высокого качества, обладающих не только функциональными, но и пробиотическими свойствами. Эффективность применения бактериальных стартовых культур зависит от их биоактивности, состава и свойств микроорганизмов, условий культивирования, состава сырья, режимов технологической обработки.
Достижения в развитии методов биомодификации сырья животного происхождения, изучение особенностей метаболизма микроорганизмов, повышение их функциональных свойств заложены в фундаментальных и прикладных исследованиях Л.В. Антиповой, В.М. Богданова, Л.И.
Воробьевой, В.И. Ганиной, Н.С. Королевой, И.А. Рогова, В.Ф. Семенихиной, А.Б. Лисицына, Н.Н. Липатова (ст), В.В. Хорольского, L. Bener, G.B. Gibson, W.P. Hammes, F.K. Liicke, N.P. Shan и др.
Среди ингредиентов, определяющих функциональные свойства продуктов питания, особое место занимают микроорганизмы с пробиотическими свойствами, формирующие нормальную микрофлору желудочно-кишечного тракта. Это является одним из решающих факторов формирования значимости продуктов питания с пробиотическими свойствами.
Как известно, колбасы и сырокопченые колбасы с длительным сроком хранения занимают значительную долю в рационе питания населения, а выбор мясных продуктов с пробиотическими свойствами ограничен в виду недостаточных сведений об антагонизме действия пробиотических культур в мясном сырье, содержащем различные пищевые ингредиенты, о влиянии различных технологических факторов на выживаемость микроорганизмов, о роли и значении этих культур в формировании функционально-технологических свойств сырья и готового продукта.
Разработка объективных критериев оценки пробиотических свойств микроорганизмов, основанных на изучении их физиологических, биохимических характеристик, создает возможность для технологического использования их в производстве сырокопченых колбас.
Анализ научно-технических результатов исследований в данном направлении показывает перспективность разработок, связанных с изучением влияния условий культивирования и сохранения биоактивности пробиотических микроорганизмов под действием физических и химических факторов в ходе технологического процесса производства сырокопченых колбас.
С точки зрения пробиотических свойств микроорганизмов большой интерес представляют пропионовокислые бактерии и бифидобактерии, которые имеют многоуровневую защиту против мутагенов среды, в связи с этим применение пробиотических микроорганизмов, обладающих высоким биотехнологическим потенциалом и антимутагенными свойствами в качестве стартовых культур в производстве сырокопченых колбас является актуальным и перспективным.
Биотехнологические свойства пропионовокислых и бифидобактерий
В настоящее время наметилась тенденция использования пробиотических микроорганизмов совместно с другими стартовыми культурами для производства мясных продуктов. Учитывая этот факт, целесообразность представляет использование уникальных свойств пропионовокислых и бифидобактерий в биомодификации мясного сырья.
В связи с возрастающими потребностями биотехнологии, изменениями экологического и радиационного фонов, широкого применения в практике химических, цитостатических и гормональных средств возникает необходимость поиска новых, эффективных, безопасных культур.
В настоящее время достаточно фактических данных о позитивном влиянии на макроорганизмы бактерий, встречающихся в желудочно-кишечном тракте в гораздо меньшем количестве. Это грам положительные пропионовокислые бактерии.
Род Propionibacterium включает в себя 3 подгруппы пропионовокислых бактерий: классические, кожные и Propionibacterium propionicus (116, 132, 150),
Главное место обитания классических пропионовокислых бактерий -твердые сычужные сыры и более 60 % штаммов, выделенных в Финляндии из «Эмментальского» сыра. К ним относятся P. shermanii и P. Freudenreichii (2).
Классические пропионовокислые бактерии характеризуются как аэротолерантные или микроаэрофильные бактерии, хотя есть штаммы, предпочитающие аэробные условия. Пропионовокислые бактерии - это палочки самой разнообразной величины, от самых коротких, почти кокков, до длинных. Клетки расположены единично, парами или короткими цепочками. Некоторые виды характеризуются утолщениями и веточками на концах. Величина клеток может сильно меняться в зависимости от их возраста и условий культивирования. Молодые клетки в аэробных условиях имеют вид коротких палочек, а в анаэробных, а также при повышенных температурах становятся более длинными. Имеются сведения о наличии пропионовокислых бактерий в пределах одного вида взаимопревращаюшихся от шарообразных до палочковой форм и обратно (87,117).
Они отличаются под микроскопом от других бактерий по своеобразному «полисадному» расположению клеток, иногда образующих короткие изогнутые цепочки и «иероглифы» вследствие деления с защелкиванием. Длина клеток у представителей видов варьирует от 0,5 до 1,5 мкм. Толщина клеток (0,5-1,0) мкм. Клетки имеют тенденцию к рудиментарному ветвлению, образуя местами небольшие утолщения, отростки и вздутия. В род Propionibacterium включены перечисленные выше микроорганизмы из-за наличия у них многих общих свойств и высокой степени гомологии ДНК. Важным признаком их объединения послужило образование пропионовой кислоты, как главного продукта метаболизма. Все виды рода сбраживают пируват, диоксиацетон и глицерин с образованием тех же конечных продуктов, что и при брожении глюкозы. Все пропионовокислые бактерии каталазоположительны. Среди классических пропионовокислых бактерий особую обособленную группу занимают Р. freudenreichii и Р, shermanii.
Пропионовокислые бактерии растут в пределах температур (15-40) С, хотя есть данные, что рост происходит при более низкой температуре до минус 10 С. Оптимальная температура классических пропионовокислых бактерий (30±1) С. Оптимальная величина рН роста пропионовокислых бактерий 6,5-7,0, максимальная 8,0, минимальная 4,6 (18,126,133).
Пропионовокислые бактерии относятся к солеустойчивым бактериям. При содержании в лактатной среде 4 % NaCl происходит нормальный рост и брожение.
При выделении пропионовокислых бактерий учитывают такие свойства, как способность использовать лактаты, хороший рост в анаэробных условиях при нейтральном значении рН.
Статистическая обработка результатов
Для объективной оценки полученных экспериментальных данных проводили их математическую обработку по результатам 4-5 повторностей. Исследуемые показатели подвергали обработке методами математической статистики и корреляционного анализа с применением ЭВМ , используя пакет стандартных программ.
Статистическая обработка данных заключалась в следующей поэтапной обработке результатов исследований:
Для обработки аналитических данных эксперимента была выбрана доверительная вероятность а=0,95 при уровне значимости р=0,05. 6. Коэффициент корреляции значений Мх и Му определяли по формуле:
Как было отмечено в литературном обзоре гтропионовые и бифидобактерии являются представителями нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и животных. Несмотря на очевидную практическую ценность, они остаются наименее изученными с точки зрения их использования в мясной промышленности.
Теоретической предпосылкой использования пропионовокислых бактерий для биотехнологической обработки мясного сырья является широкий температурный диапазон роста (15-30) С. Есть данные, что они растут при более низких температурах (2-7) С, оптимальное значение рН 6,5-7,0, при рН ниже 5,0 жизнеспособность снижается, они характеризуются достаточно высокой устойчивостью к соли. При метаболизме пропионовокислых бактерий образуются пропионовая и уксусная кислоты, обладающие консервирующими свойствами. От других брожений они отличаются высоким выходом АТФ, участием некоторых уникальных ферментов и реакций, они восстанавливают нитриты при утилизации лактата, обладают высокими антимутагенными свойствами (18, 20,103,133,154).
Несмотря на уникальные свойства, пропионовокислые бактерии пока не нашли широкого применения в мясной промышленности из-за недостаточности сведений о механизме их проявления в мясном субстрате. Работа Нефедовой Н.В. (66, 70) ограничена изучением влияния пропионовокислых бактерий в биомодификации свойств мясного фарша и микробиологическими исследованиями сырья при посоле и готовых продуктов при хранении. Что касается других свойств - устойчивости к физическим и химическим факторам при культивировании их в мясной системе, проявление антимутагенной активности сведений в литературе не обнаружено.
С учетом вышеизложенного представляет интерес разработка новых подходов к выбору пробиотических микроорганизмов для биотехнологической обработки сырья, отвечающей специфическим требованиям технологических процессов производства мясных продуктов.
Для выбора наиболее перспективных штаммов пробиотических микроорганизмов изучали их биотехнологический потенциал. Для исследований были использованы различные штаммы моно и поликультур пропионовокислых и бифидобактерий, а также комбинированные закваски.
Микроорганизмы в процессе своей жизнедеятельности способны продуцировать вещества, к которым относятся экзополисахариды (ЭПС). Пропионовокислые бактерии синтезируют вязкие ЭПС в окружающую среду (3, 17), которые, на наш взгляд, будут участвовать в формировании функционально-технологических свойств и структурообразовании мясного фарша. В этой связи, концентрация ЭПС и вязкость выбраны как одни из важных показателей при подборе культур для практического применения. О биоактивности пробиотических культур судили по количеству жизнеспособных клеток, свидетельствующему о состоянии популяции микроорганизмов, и удельной скорости роста, характеризующей состояние клетки. Результаты исследований представлены в таблице 2,
Анализ полученных результатов показывает, что все представленные микроорганизмы обладают высокой биохимической активностью, о чем свидетельствует количество жизнеспособных клеток 1010-I0nKOE/cM3.
Комбинированная закваска, состоящая из Bifidum longum 339М, P. freudenrechii subsp freudenreichii AC-2500 имеет высокую удельную скорость
Исследование антимутагенных свойств пропионовокислых и бифидобактерий
Различные добавки, используемые в пищевой промышленности, и химикаты в сельском хозяйстве содержат то или иное количество канцерогенов и мутагенов, неблагоприятно влияющих на здоровье человека. В связи с этим представляет интерес снижение мутагенного груза путем биотехнологической обработки сырья с использованием пробиотических микроорганизмов.
Пропионовокислые бактерии обладают высокими антимутагенными свойствами (18, 117). Следует отметить, что антимутагенные свойства зависят от видовой и штаммовой принадлежности пропионовокислых бактерий, а также от условий культивирования, состава питательных сред и других факторов (20, 152).
В этой связи исследования были направлены на изучение антимутагенной активности пробиотических микроорганизмов и отбор наиболее перспективных штаммов для технологии производства сырокопченых колбас. Для определения антимутагенной активности использовали тест Эймса, а в качестве индикатора мутагенности - тест -штамм Salmonella typhimuruim ТА -100. В первой серии опытов определяли антимутагенную активность клеток и культуральной жидкости.
Из данных представленных на рисунке 2 видно, что наибольший антимутагенный эффект проявляют клетки пропионовокислых бактерий. Антимутагенность (AM) трехштаммовой культуры составляют 80 %, а Р. shermanii КМ-186 - 74 %. Примерно одинаковую AM проявляют пропионовокислые бактерии АС-2500 и комбинированная закваска, антимутагенная активность которых составляет около 70 %. AM других монокультур, в том числе бифидобактерий, была достаточно высокой и находится в пределах 50-60 %.
Культуральная жидкость исследуемых штаммов также обладает антимутагенной активностью, но несколько ниже, чем в клетках микроорганизмов и составляет (25-55) %.
По данным Алекперова У.К. и Воробьевой Л.И. (1, 20. 152) антимутагенами культуральной жидкости являются ряд аминокислот -аргинин, гистидин, метионин, цистеин и глутаминовая кислота, которые продуцируют пропионовые бактерии. По всей видимости, этим и обусловлен антимутагенный эффект.
Механизм антимутагенного действия белкового фактора до конца не ясен. Можно предположить, что экзогенный белок (пептид) функционирует как регуляторный сенсорный белок, окисление которого индуцирует сигнал на любой стадии клеточного регуляторного каскада, в результате чего активизируется естественная АМ-защита. При этом белок действует как биоантимутаген, ингибируя мутаген через взаимодействие ДНК-репарирующими системами. АМ-защита пропионовых бактерий не только «стоит на страже» сохранения собственного генотипа, но может быть использована для стабилизации генотипов и микробных ферментации других организмов.
Установлено, что не только метаболиты, но и клетки пропионовых и бифидобактерий проявляют высокую десмутагенную активность (рис. 2). Следует также отметить, что вещества клеточного экстракта обладают десмутагенными свойствами и связывают, инактивируют или предотвращают транспорт мутагенов в клетки бактерий. Но если мутаген все-таки проникает в клетку, то он может быть инактивирован внутриклеточными антимутагенами: аминокислотами клеточного пула, глутатионом, ферментами антирадикальной защиты, а в случае повреждения ДНК, как мы отмечали ранее, в работу вступают антимутагены репарогены.
Полученные результаты исследований согласуются с литературными данными, что пропионовые бактерии проявляют многоуровневую защиту против мутагенов среды. Проведенные эксперименты показали, что наибольший антимутагенный эффект оказывают клетки трехштаммовой культуры пропионовокислых бактерий и комбинированной закваски пропионовокислых и бифидобактерий.
Исследование процесса сушки сырокопченых колбас
Особое значение для процесса созревания сырокопченых колбас имеет общее содержание влаги в объекте. Кроме того, развитие структурообразования и общее состояние микрофлоры также зависят от влагосодержания.
В дальнейших исследованиях изучено влияние комбинированного бакконцентрата на изменение влагосодержания в сырокопченых колбасах в процессе его производства. Для этого в условиях быстрого созревания в климокамере проводили опытную выработку сырокопченых колбас с учетом подобранной дозы бакконцентрата в количестве 1 ед. активности на 100 кг несоленого сырья. В контрольные образцы колбас добавляли стартовые культуры Bitec LS-25 согласно инструкции по их применению. Результаты представлены на рисунке 7.
Как видно из диаграммы, в опытных образцах сырокопченых колбас массовая доля влаги на (5-Ю) сутки ниже на (2-3) % по сравнению с контролем. Это в первую очередь связано с интенсивным снижением рН в этот период, о чем свидетельствуют данные, полученные в предыдущих экспериментах. В процессе сушки потеря влаги в опытном образце на (15-20) сутки составляет (24-34) % от начального значения влагосодержания, а в контроле (20-30) %. Разница в скорости сушки между опытным образцом и контролем составляют 4 %. На 20 сутки процесса изготовления сырокопченых колбас в опытном образце содержание массовой доли влаги составляет 27,3 %, а в контроле данное значение достигается на 22 сутки. Известно, что при величине рН 5,4 близкой к изоэлектрической точке белков, мясо имеет наименьшую водосвязывающую способность, при которой интенсивнее происходит процесс сушки. Данные значения рН в опытном образце создают хорошие предпосылки для удаления влаги в продукте в процессе сушки сырокопченых колбас и формирования плотной структуры продукта.
Полученные результаты позволяют сделать вывод, что при ускоренном способе производства сырокопченых колбас использование комбинированного бакконцентрата пропионовокислых бактерий и бифидобактерий способствуют процессу удаления влаги и сокращению производственного цикла, что имеет большое практическое значение.
В ходе технологического процесса изготовления сырокопченых колбас создаются условия, хотя и замедляющие, но не исключающие жизнедеятельность микроорганизмов в продукте (9, 44, 72, 114).
Начальная микрофлора мяса включает в себя в основном грамотрицательные бактерии, в том числе из группы кишечных палочек и протея, гнилостные спорообразующие аэробные бациллы, анаэробные клостридии, энтерококки, стафилококки. Кроме этих групп микроорганизмов в фарше содержатся в небольших количествах дрожжи, микрококки и молочнокислые бактерии. Микрококки имеют полезные свойства, участвуют в формировании цвета в силу денитрофицирующей активности, а молочнокислые бактерии обладают гликолитической активностью (68, 82, 85).
Как показано в разделе 4.1. в процессе производства сырокопченых колбас происходит интенсивное развитие пропионовокислых и бифидобактерий. Поскольку в процессе изготовления сырокопченых колбас взаимосвязь между группами полезных и нежелательных микроорганизмов устранить не удается, при их изготовлении следует создавать условия, препятствующие размножению последних.
Микробиологическая стабильность сырокопченых колбас достигается в процессе их производства путем последовательного воздействия целого ряда барьерных факторов, которые имеют решающие значения на отдельных этапах созревания колбас и позволяют обеспечить стабильность готового продукта. Основными барьерными факторами при производстве ферментированных колбас являются температура, рН, влагосодержание, активность воды, наличие консервантов и антагонистическая активность микрофлоры используемых заквасок. (55, 56).
В связи с вышеизложенным, дальнейшие исследования посвящены изучению влияния пропионовокислых и бифидобактерий на санитарно-гигиенические показатели сырокопченых колбас в процессе их производства. Для этого в процессе производства сырокопченых колбас изучали рост патогенной и условно-патогенной микрофлоры Е. coli и Pr, vulgaris.
При исследовании патогенной и условно-патогенной микрофлоры, представленной в данном случае E.coli и Pr.vulgaris, в процессе производства сырокопченых колбас установлено, что в контрольных образцах эти микроорганизмы присутствуют до 20 суток, а в опытных - до 15 суток (табл. б). Это свидетельствует о более высокой антагонистической активности пропионовокислых и бифидобактерий при наличии кислой среды, создающей неблагоприятные условия для жизнедеятельности патогенной и условно-патогенной микрофлоры по сравнению с контролем.
