Введение к работе
Актуальность проблемы
Зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его гомологи нашли широкое применение в современной молекулярной и клеточной биологии благодаря уникальному свойству образовывать хромофор из собственных аминокислот без участия внешних кофакторов за исключением молекулярного кислорода Таким образом, цвет флуоресцентного белка кодируется его геном Эта особенность позволяет использовать GFP-подобные белки для решения таких задач, как мечение белков, слежение за экспрессией генов, исследование транспорта и взаимодействий белков в живой клетке Помимо этого, варианты GFP-подобных белков могут быть использованы как внутриклеточные биосенсоры рН, окислительно-восстановительного потенциала, ионов Са2+ и др
К настоящему времени цветовая палитра, образуемая флуоресцентными белками перекрывает видимую область спектра от синего до дальне-красного Такое цветовое разнообразие определяется в основном структурой хромофора В природных GFP-подобных белках хромофор формируется путем циклизации аминокислот X-Tyr-Gly полипептидной цепи белка, сопровождающейся дегидратацией и дегидрогенированием В результате образуется хромофор, 4-(л-гидроксибензилиден)-5-имидазолон, характеризующийся флуоресценцией с максимумом эмиссии при ~ 500 нм Такой "зеленый" хромофор может претерпевать различные модификации, в результате которых происходит расширение его л-системы, что в свою очередь приводит к батохромному сдвигу в спектрах белка
В большинстве белков, характеризующихся поглощением и эмиссией света в красной и дальне-красной области спектра (550 — 650 нм), расширение я-системы "зеленого" хромофора осуществляется за счет ацилиминной группы Красные флуоресцентные белки (RFP) представляют значительный интерес для современной клеточной биологии и биотехнологии, поскольку они, во-первых, расширяют спектральный диапазон, перекрываемый флуоресцентными белками, что позволяет одновременно вводить разноцветные флуоресцентные метки в различные белки-мишени Во-вторых, в отличие от GFP, при работе с красными флуоресцентными белками вклад автофлуоресценции клетки минимален Стоит также отметить, что ткани животных наиболее прозрачны в дальне-красном и инфракрасном диапазоне (650 — 900 нм), поэтому белки, обладающие эмиссией в этой области спектра, позволили бы изучать процессы в рамках целого организма Очевидно, что информация о структуре хромофора красных флуоресцентных белков и механизме посттрансляционных модификаций, приводящих к батохромному сдвигу, имеет большое значение как для создания новых генетически кодируемых внутриклеточных флуоресцентных меток, так и для улучшения свойств уже существующих
Цели исследования
Основной целью данной работы являлось изучение структурных основ спектральных превращений флуоресцентных белков из коралловых полипов рода Zoanthus, а также изучение механизма образования хромофоров в этих белках
Научная новизна и практическая значимость работы
В исследованных к настоящему времени белках GFP-семейства способность к флуоресценции в красном диапазоне является результатом дополнительного окисления GFP-хромофора Эта реакция приводит к расширению л-электронной системы GFP-хромофора за счет образования C=N-C=0 заместителя В данной работе обнаружена новая посттрансляционная модификация хромофора, приводящая к смещению флуоресценции в красную область спектра Показано, что при созревании красного флуоресцентного белка из Zoanthus sp 2 (z2FP574) происходит реакция окислительного декарбоксилирования остатка аспаргиновой кислоты хромофоробразующей последовательности Asp-Tyr-Gly При изучении механизма этой батохромной модификации Z2FP574 было обнаружено, что на промежуточной стадии образуется зеленая флуоресцентная форма белка, содержащая хромофор GFP-типа Показано, что в ходе дальнейшего сопряженного окисления-декарбоксилирования происходит образование ацилиминной группы и, как результат, расширение я-системы хромофора Предложен механизм образования хромофора в z2FP574, который отличается от такового во всех других известных RFP
Полученная в данной работе информация о механизме образования "красного" хромофора в z2FP574 потенциально может быть использована для увеличения цветового разнообразия флуоресцентных белков, а также для улучшения их спектральных свойств Кроме того, z2FP574 является уникальным белком, поскольку в ходе его созревания сначала образуется зеленая флуоресцентная форма, превращающаяся со временем в красную Таким образом, Z2FP574 является флуоресцентным таймером Флуоресцентные метки на основе мономерного варианта Z2FP574 можно было бы использовать для слежения одновременно за перемещением, локализацией и возрастом целевого белка
Апробация работы
Материалы диссертации были доложены на международных конференциях VIII чтения, посвященные памяти академика Ю А Овчинникова (Москва — Пушино, 2006), 30-й FEBS конгресс — 9-я ГОВМВ конференция "Мир белков Белки и пептиды структура, функции и организация" (Венгрия, Будапешт, 2005), Международная конференция по физико-химической биологии, посвященная 70-летию со дня рождения академика Ю А Овчинникова (Москва, 2004), а также на XVI зимней молодежной научной школе
"Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2004)
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ
Структура работы
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы Работа изложена на 107 страницах и содержит 36 рисунков, 7 таблиц и 126 ссылок на литературные источники
Похожие диссертации на Химические основы спектральных превращений флуоресцентных белков из коралловых полипов
![Синтез соединений на основе химических превращений производных [А]-оксокарбоновых кислот и их биологическая активность](/i/i/4375/363898.png "Синтез соединений на основе химических превращений производных [А]-оксокарбоновых кислот и их биологическая активность Пулина Наталья Алексеевна")
