Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 4
1.1. Флуоресцентные и окрашенные GFP-подобные белки кишечнополостных 5
1.2. Использование GFP-подобных белков для изучения подвижности клеток, клеточных белков и органелл 26
Глава 2. Результаты и обсуждение 47
2.1. Механизм фотоактивации флуоресценции белка asulCP 47
2.2. Применение фотоактивируемых флуоресцентных белков в биотехнологии 69
2.3. Обсуждение 83
2.4. Заключение 89
Глава 3. Экспериментальная часть 92
3.1. Материалы и оборудование 92
3.2. Методы исследования 94
Выводы 100
Список сокращений 101
Список литературы 102
- Флуоресцентные и окрашенные GFP-подобные белки кишечнополостных
- Использование GFP-подобных белков для изучения подвижности клеток, клеточных белков и органелл
- Механизм фотоактивации флуоресценции белка asulCP
- Применение фотоактивируемых флуоресцентных белков в биотехнологии
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Клонирование гена зеленого флуоресцентного белка (GFP) из гидромедузы Aequorea victoria в 1992 году открыло широкие возможности для мечения белков, органелл и клеток in vivo. Сегодня количество опубликованных работ в области биологии и медицины, выполненных с использованием GFP и GFP-подрбных белков, уже превысило десять тысяч. В 1999 году палитра GFP-подобных белков была значительно расширена - в нашей лаборатории были клонированы гены флуоресцентных белков и нефлуоресцентных окрашенных белков (хромобелков) из кишечнополостных организмов класса Anthozoa. Один из этих белков - asulCP - оказался способен к уникальной фотоконверсии из нефлуоресцентной в ярко флуоресцентную форму. До нашей работы не существовало объяснения явлению фотоактивации флуоресценции asulCP. Также это явление не находило практического применения в биотехнологии, в первую очередь ввиду короткого времени жизни активированного флуоресцентного состояния белка. Достигнутое в ходе работы понимание процессов, стоящих за фотоактивацией флуоресценции asulCP, позволило значительно продвинуться в изучении GFP-подобных флуоресцентных белков и хромобелков. Кроме того, наша работа сделала возможным направленное создание фотоактивируемых флуоресцентных белков (ФАФБ) с заданными свойствами. Полученные в ходе работы ФАФБ открывают возможности для прицельного флуоресцентного мечения и слежения за перемещением клеток, органелл и белков in vivo.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Целями данной работы было изучение механизмов, лежащих в основе фотоактивации флуоресценции белка asulCP, а также разработка фотоактивируемых маркеров для прицельного флуоресцентного фотомечения объектов in vivo.
СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения и экспериментальной части, а также выводов и списка литературы. Работа изложена на 111 страницах и содержит 24 иллюстрации и 108 ссылок на литературные источники.
Флуоресцентные и окрашенные GFP-подобные белки кишечнополостных
В 1955 году Давенпорт и Николь впервые описали светящиеся клетки медузы Aequorea victoria, которые оказались помимо люминесценции способны к флуоресцентной эмиссии зеленого света при облучении в УФ области спектра (Davenport and Nicol, 1955). Несколькими годами позже (Johnson et al., 1962; Shimomura et al., 1962) был описан белковый экстракт из медузы, способный к такой же флуоресценции. Затем Морин и Хастингс (Morin and Hastings, 1971, а) независимо обнаружили тот же белок, известный сегодня как GFP.
С того времени, когда удалось клонировать ген GFP из A. victoria, и затем экспрессировать GFP в различных системах (Prasher et al., 1992; Chalfie et al., 1994) интерес к этому белку невероятно возрос. К 1998 году число публикаций, включающих термин "GFP" или "green fluorescent protein" в названиях или абстрактах превышало 500, к 2000 году - 6000, а к моменту написания настоящей работы уже превышало цифру в 10 тысяч публикаций, если учитывать только результаты поиска в системе PubMed. Сегодня GFP интенсивнейшим образом используется для флуоресцентного мечения белков, органелл, клеток и организмов в широком диапазоне видов прокариот и эукариот. Биохимические, спектральные и физические свойства GFP
В отличие от других природных пигментов, GFP и известные GFP-подобные белки формируют внутренний хромофор без каких бы то ни было вспомогательных кофакторов (Wilson et al., 1998), и без использования внешних ферментативных активностей или субстратов, кроме молекулярного кислорода (Heim et al., 1994). Именно это уникальное свойство делает GFP- подобные белки исключительно удобными флуоресцентными маркерами, которые способны независимо формировать хромофор при экспрессии в различных живых организмах, тканях и клетках. Эти маркеры могут быть использованы без нарушения целостности объектов (Chalfie et al., 1994), могут быть специфично связаны в единый «фьюз» с интересующими белками, направлены в конкретные органеллы или ткани (Cubitt et al., 1995). Дикий тип GFP имеет основной пик возбуждения флуоресценции при 396 нм, и минорный при 476 нм (рис. 1.1.1). При этом спектры эмиссии флуоресценции для этих двух пиков очень близки - с максимумами при 503 и 508 нм (Ward, 1979; Ward & Cormier, 1979; Kahana & Silver, 1996).
Исследования физических и химических свойств GFP выявили несколько важных характеристик, относящихся непосредственно к структуре белка. GFP чрезвычайно устойчив к денатурации, для которой необходимо поместить белок в 6М гуанидин при 90С либо вывести значение рН за границы между 4.0 и 12.0. Ренатурация (практически полная или частичная) происходит в течение нескольких минут после нейтрализации денатурирующих условий (Bokman and Ward, 1981; Ward and Bokman, 1982). В пределах неденатурирующих значений рН, возрастание рН приводит к падению пика возбуждения флуоресценции при 396 нм, и возрастанию пика при 476 нм (Ward et al., 1982). После кристаллизации GFP практически не изменяет своих флуоресцентных свойств, если сравнивать с GFP в водном растворе (Perozzo et al., 1988). Поэтому выяснение трехмерной структуры GFP методом рентгеноструктурного анализа, результаты которого были почти синхронно опубликованы в двух работах 1996 года (Ormo et al., 1996; Yang et al., 1996), помогло объяснить как природу флуоресценции в зрелом белке, так и механизм автокаталитического формирования хромофора. Более того, последующие разработки флуоресцентных белков с различными свойствами во многом опирались и опираются именно на предсказуемые по трехмерным моделям изменения в структуре GFP. Трехмерная структура GFP
GFP представляет собой р-бочку с регулярным расположением 11 р— слоев на внешней стороне цилиндра. Цилиндр этот имеет диаметр около ЗОА и длину около 40А. Флуоресцентный центр молекулы — модифицированный остаток тирозина и дополнительный цикл, образованный циклизацией пептидного остова части сс-спирального сегмента. Небольшие а-спиральные участки также закрывают бочонок с торцов. Р-слои расположены очень регулярно, с единственным отклонением от совершенной симметрии между двумя из 11 Р-слоев (рис 1.1.1). Анализ гексапептида, полученного протеолизом очищенного GFP, позволил ещё в 1993 году предсказать, что хромофор образован внутренней последовательностью аминокислот Seryr-Gly, которая пост-трансляционно модифицируется с образованием дополнительного цикла из пептидной цепи белка (рис. 1.1.2) (Cody et al., 1993).
Исследования экспрессии GFP в Е. coli позволили предложить последовательный механизм формирования хромофора: через быструю стадию циклизации между Ser65 и Gly67, с образованием имидазольного кольца, и вторую, более медленную (часы), стадию окисления Тирбб (Heim etal., 1994). Последующие работы по мутагенезу GFP (Delagrave et al., 1995; Heim et al., 1995; Cormack et al., 1996) показали, что именно Gly в положении 67 строго необходим для формирования хромофора. По всей вероятности, такая консервативность позиции 67 определяется необходимостью тесного сближения атомов пептидной цепи. Однако, среди белков с известной трехмерной структурой, содержащих последовательность SYG, в 10 из 206 белков степень сближенности атомов пептидного остова соответствует таковой у GFP (данные за 1997 год - Branchini et al., 1997).
Использование GFP-подобных белков для изучения подвижности клеток, клеточных белков и органелл
Вскоре после открытия, GFP стали применять как флуоресцентный маркер экспрессии генов, локализации и динамики белков в живой клетке. Оказалось, что практически любой белок можно пометить с помощью GFP, закодировав его последовательность в той же рамке считывания. Экспрессируемая в клетках, такая химерная конструкция, как правило, сохраняет локализацию и функцию исследуемого белка. Открывшиеся возможности для исследования внутриклеточных процессов сделали GFP (и, позднее, гомологичные ему белки) излюбленным флуоресцентным маркером для работ in vivo (Chalfie and Kain, 1998; Tsien and Prasher, 1998; Tsien, 1998; Ward, 1998).
С ростом популярности (к 2000 г. число работ с применением GFP уже превысило 6000) развивались и совершенствовались и технологии применения флуоресцентных белков. Обогатилась палитра применяемых цветных маркеров. Были получены мутантные формы GFP - синий (BFP), циановый (CFP), и желтый (YFP), с максимумами эмиссии флуоресценции соответственно 445, 477, 527 нм (Heim et al., 1994; Delagrave et al., 1995; Heim and Tsien, 1996; Ormo et al., 1996; Patterson et al., 2001). Начиная с 1999 года, было также клонировано множество GFP-подобных флуоресцентных белков из коралловых полипов, обладающих спектрами эмиссии флуоресценции с максимумами от 445 до 611 нм (Matz et al., 1999; Fradkov et al, 2000; Wiedenmann et al., 2002). Кроме того, из коралловых полипов были клонированы гомологичные нефлуоресцентные хромобелки. На базе последних удалось получить мутантные флуоресцентные формы, причем пик эмиссии некоторых из них достиг 645 нм (Gurskaya et al, 2001а).
Сегодня разнообразие флуоресцентных белков позволяет одновременно маркировать и локализовать в живой клетке несколько объектов, а также широко использовать технологию FRET микроскопии (Fluorescence Resonance Energy Transfer - Флуоресцентный Резонансный Перенос Энергии), позволяющую определить наличие физических взаимодействий между белками. На базе GFP-подобных белков были созданы сенсорные молекулы, реагирующие изменениями в интенсивности и спектре флуоресценции на изменение параметров окружения - концентрации ионов Са2+ (Miyawaki et al., 1997; Baird, et al., 1999; Jayaraman et al., 2000; Nagai et al., 2001), pH (Llopis et al., 1998; Miesenbock et al., 1998; Elsliger et al., 1999, Hanson et al., 2002; McAnaney et al., 2002), мембранного потенциала (Siegel et al., 1997) и других параметров. Были разработаны варианты GFP-подобных белков, позволяющих in vivo отслеживать временные параметры экспрессии по изменению цвета флуоресценции с зеленого на красный — по мере созревания хромофора белка (Terskikh et al., 2000).
Кроме того, на базе GFP и гомологичных ему белков был разработан ряд методик, позволяющих либо косвенно оценить подвижность молекул в живой клетке, либо оптически внести характерный флуоресцентный сигнал и непосредственно проследить за перемещением помеченных молекул. Здесь мы проследим эволюцию таких технологий, использующих GFP и GFP-подобные белки в качестве маркеров для изучения динамики белков и органелл в живых клетках. Технология «обесцвечивания» флуоресцентной метки
Эта технология используется для изучения динамики флуорофоров (White and Stelzer, 1999; Lippincott-Schwartz et al., 2001; Reits and Neefjes, 2001). Она основана на обесцвечивании флуоресцентной метки в пределах некоторого интересующего участка мощным световым облучением. Затем отслеживается скорость обмена флуорофорами между облученным участком и его окружением. Белок GFP оказался очень удобным маркером для экспериментов, использующих технику обесцвечивания флуоресцентной метки (photobleaching). Этот белок дает яркую, стабильную флуоресценцию, и не «выгорает» в условиях низкой интенсивности возбуждающего света. При более мощном освещении GFP обесцвечивается необратимо, причем необходимая интенсивность облучения не приводит к заметным нарушениям в жизнедеятельности клеток (Patterson et al., 1997). GFP значительно более стабилен, чем известные небольшие флуоресцентные молекулы, что позволяет проводить продолжительные эксперименты, а также повторно работать с одной и той же клеткой.
Наконец, как уже было сказано выше, GFP синтезируется самой клеткой и составляет единое целое с исследуемым белком. До недавнего времени прицельное мечение любого выбранного белка in vivo было практически недоступно для методик, использующих низкомолекулярные флуоресцентные красители (ситуация изменилась к лучшему с появлением работы Gaietta et al. 2002, см. ниже). Последнее соображение особенно важно и справедливо и для других подходов, использующих GFP и гомологичные флуоресцентные белки для изучения локализации и динамики белков в живых клетках. Здесь мы остановимся на двух основных вариациях технологии обесцвечивания флуоресцентной метки - методах FRAP и FLIP. Метод FRAP
Метод FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching восстановление флуоресценции после обесцвечивания) основан на измерении скорости восстановления флуоресценции в пределах "выжженного" района. Участок живой клетки облучается интенсивным светом, вызывающим обесцвечивание флуорофора. По времени, за которое восстанавливается флуоресценция в пределах «выжженного» участка, а также по степени такого восстановления можно судить о скорости диффузии и доле, которую составляет мобильная фракция белка.
Механизм фотоактивации флуоресценции белка asulCP
Три года назад из морского анемона Anemonia sulcata был клонирован ген GFP-подобного окрашенного белка (Lukyanov et al., 2000), описанный в обзоре литературы настоящей работы. Этот белок, названный asulCP (другие названия - asFP595, asCP), эффективно поглощает свет с максимумом поглощения при 568 нм, определяя пурпурную окраску кончиков щупальцев морского анемона (рис. 1.1.8). Исходно не флуоресцентный, asulCP становится ярко флуоресцентным (разгорается) с максимумами возбуждения при 575 нм и эмиссии при 595 нм, в ответ на облучение интенсивным зеленым светом. Затем белок довольно быстро (в течение минуты) релаксирует к нефлуоресцентному состоянию, или же может быть "потушен" немедленно коротким облучением синим светом (рис. 1.1.9). Оба процесса, как фотоактивации при облучении зеленым, так и фотоинактивации при облучении синим светом, обратимы для дикого белка asulCP, и могут быть повторены множество раз. Природа этих удивительных превращений до настоящей работы оставалась неясной.
В ходе этой части работы, результаты которой опубликованы в статье (Chudakov et al., 2003а) мы исследовали свойства белка asulCP дикого типа и полученных мутантных белков и предложили свое объяснение наблюдаемым эффектам.
Спектры действия света, необходимого для фотоактивации и фотоинактивации флуоресценции белка asulCP
Белок asulCP фотоактивируется (становится ярко флуоресцентным) в ответ на облучение зеленым светом и фотоинактивируется при облучении синим светом. Оказалось достаточно сложно снять точный спектр действия активирующего света, так как интенсивность освещения необходимая для фотоактивации asulCP достаточно высока (см. ниже), и максимальная мощность облучающего света спектрофлуориметра ниже порога интенсивности фотоактивирующего света. Используя различные источники освещения, перечисленные в главе 3, мы установили расположение оптимумов фотоактивирующего и фотоинактивирующего света:
Облучение asulCP при длинах волн 532 нм, 543 нм и 546 нм вызывало яркое разгорание белка. В то же время, облучение светом 514 нм приводило лишь к незначительной фотоактивации флуоресценции, и существенно тушило предварительно разожженный asulCP, что указывает на перекрывание двух спектров действия (фотоактивации и фотоинактивации) в районе 514 нм. Весьма вероятно, что спектр действия фотоактивирующего света соответствует спектру поглощения asulCP, пик которого приходится при 568 нм (Рис. 2.1.1.А).
Облучение синим светом - при длинах волн 458 нм, 430-490 нм и 460-490 нм не вызывало фотоактивации, и приводило к мгновенной и полной фотоинактивации предварительно разожженного белка asulCP. Точный спектр действия фотоинактивирующего света было сложно установить, так как до фотоактивации белок asulCP дикого типа практически не флуоресцирует, а после фотоактивации релаксирует к нефлуоресцентному состоянию достаточно быстро (время полурелаксации составляет 7 секунд, см. ниже). Однако мы сняли точный спектр действия фотоинактивирующего света, а также некоторые значимые изменения в спектре поглощения при фотоактивации, используя один из полученных нами мутантных белков asulCP (см ниже, раздел "Мутантный белок asulCP-A148G ").
Интенсивность и продолжительность облучения, необходимые для фотоактивации флуоресценции белка asuICP Интенсивность и продолжительность облучения зеленым светом, необходимые для фотоактивации, зависят от многих параметров: толщина и прозрачность объекта, концентрация белка, используемая длина волны. В целом, повышение яркости флуоресценции наблюдается, если скорость фотоактивации превышает скорость релаксации разожженного белка. Например, облучение экспрессирующей asuICP колонии Е. coli во флуоресцентном микроскопе, с использованием 10-кратного объектива (TRITC фильтры, 100В лампа) вызывало быструю фотоактивацию, достигавшую максимума в течение 10-20 секунд. Облучение с использованием 5-кратного объектива вызывало лишь постепенную фотоактивацию, яркость которой достигала своего максимума в течение 10 минут. Четырехкратное снижение мощности света, получаемого с использованием 5-кратного объектива (добавлением нейтральных светофильтров), сводило на нет эффект фотоактивации белка. Кинетика релаксации фотоактивированного белка asuICP и её зависимость от температуры Мы измерили кинетику релаксации фотоактивированного белка asuICP при комнатной температуре (25С), и было показано, что время полурелаксации разожженного белка составляет 7 секунд (рис. 2.2.1.А). В то же время, фотоактивированный белок asuICP оставался флуоресцентным значительно дольше - более 24 часов - при условии немедленного охлаждения разожженной пробы в жидком азоте с последующим помещением на -70С. Этот факт сыграл свою роль в построении модели фотоактивации. Анализ окружения хромофора в GFP-подобных белках. К началу настоящей работы методом рентгеноструктурного анализа уже были получены данные о трехмерных структурах двух GFP-подобных белков - собственно GFP медузы Aequorea victoria, и красного флуоресцентного белка DsRed из кораллового полипа (Ormo et al., 1996; Yang et al., 1996; Wall et al., 2000; Yarbrough et al., 2001). Мы использовали эти данные в качестве доступных трехмерных моделей для анализа белка asulCP и других GFP-подобных флуоресцентных белков и нефлуоресцентных окрашенных белков - хромобелков.
Согласно известной структуре, фенольный остаток Тугбб (центральной аминокислоты хромофора) GFP ориентирован на Thr203 и His 148, причем образует с последним водородную связь (Ormo et al., 1996; Yang et al., 1996). Наши исследования показали исключительное влияние аминокислотных позиций 148, 203 и, что важно для настоящей работы, позиции 165, на флуоресцентные свойства GFP-подобных белков коралловых полипов (Lukyanov et al., 2000; Gurskaya et al., 2001b; Янушевич и др., 2002; Bulina et al., 2002). (Для облегчения сравнений, здесь и далее все аминокислоты обозначены в соответствии с выравниванием GFP-подобных белков относительно последовательности GFP, см. рисунок 1.1.4. Важно отметить, что аминокислотный остаток в позиции 148 строго различается для флуоресцентных белков и хромобелков, аминокислотные последовательности которых известны на сегодняшний день (таблица 2.1.1). Известные флуоресцентные белки коралловых полипов (их более 20) содержат Serl48. Причем, подобно GFP, данные о трехмерной структуре белка DsRed показывают, что 66 тирозин хромофора стабилизирован за счет позиции 148 (Wall et al., 2000; Yarbrough et al., 2001). Скорее всего, в большинстве флуоресцентных белков коралловых полипов консервативный Serl48 вовлечен в стабилизацию хромофора во флуоресцентном состоянии. В хромобелках (за исключением исследуемого нами белка asulCP), позиция 148 это Cis либо Asn, в то время как asulCP содержит исключительный А1а148. Одновременно, asulCP проявляет и исключительные свойства, будучи способен находиться как в нефлуоресцентном окрашенном ("хромо") так и во флуоресцентном состояниях. (Здесь и далее "хромо" состояние будет означать, что белок имеет высокий коэффициент молярной экстинкции, но низкий квантовый выход флуоресценции. Во флуоресцентном состоянии белок характеризуется высоким квантовым выходом). Единственная замена X148S приводит к тому, что хромобелки коралловых полипов (включая и asulCP) становятся ярко флуоресцентными, с параметрами возбуждения/эмиссии флуоресценции, соответствующими их пикам поглощения (Lukyanov et al., 2000; Bulina et al., 2002). Вероятно, конфигурация флуоресцентного хромофора и его взаимодействие с аминокислотным окружением в мутантах X148S хромобелков сходно с таковым у флуоресцентных белков.
Применение фотоактивируемых флуоресцентных белков в биотехнологии
Технология обесцвечивания флуоресценции GFP и GFP-подобных белков, подробно описанная в части 1.2. обзора литературы, сегодня широко используется для слежения за перемещением клеточных структур и белков in vivo. Эта мощная технология, однако, не позволяет напрямую пометить флуоресцентной меткой и отследить пути и кинетику перемещения объектов.
Прямое наблюдение за выбранным объектом in vivo становится возможным лишь с появлением фотоактивируемой флуоресцентной метки. Сегодня существует несколько технологий, позволяющих оптически вносить изменения в спектры возбуждения и эмиссии флуоресценции GFP-подобных белков. Однако идеальный фотоактивируемый маркер должен быть нефлуоресцентной меткой, способной «включаться» (то есть, становиться ярко флуоресцентной) в ответ на облучение светом определенной длины волны, интенсивности и продолжительности.
В большой степени, таким требованиям отвечают некоторые из полученных нами мутантных фотоактивируемых флуоресцентных белков (ФАФБ). Среди множества фотоактивируемых вариантов, полученных в ходе настоящей работы, можно выделить мутантный белок asulCP-A148G, с дополнительными заменами F7L, Y26C, T30I, A142V (далее будем называть его ФАФБ1), как наиболее контрастный и яркий вариант белка, разгорающегося при облучении интенсивным зеленым светом, и белок hcriCP-N165A (ФАФБ2) - как лучший из двух полученных мутантных белков, способных к фотоактивации в ответ на облучение синим светом. ФАФБ1 способен проходить как обратимую, так и необратимую фотоконверсию из нефлуоресцентной в ярко флуоресцирующую форму при облучении зеленым (530-570 нм) светом различной интенсивности. ФАФБ1 может быть использован для прицельного фотомечения, делая возможным слежение за перемещением клеток, клеточных органелл и белков in vivo.
Мы продемонстрировали возможности, которые дает в руки исследователям появление ФАФБ на нескольких примерах. Мы осуществили фотомечение клеток и проследили за их миграцией в развивающемся эмбрионе Xenopus laevis. Мы также провели эксперимент по прицельному фотомечению митохондрий и проследили за их перемещением в живой эукариотической клетке. Также была прослежена диффузия фотоактивированного ФАФБ1 в эукариотической клетке. Результаты этой части работы опубликованы в статье Chudakov et al., 2003b. Выбор оптимального ФАФБ как инструмента для прицельного фотомечения объектов Описанный во второй главе ряд мутантых белков, полученных направленным мутагенезом asulCP и хромобелков hcriCP и cgigCP, включает множество фотоактивируемых вариантов. Кроме описанных, не охарактеризованы и не включены в настоящую работу многие разгорающиеся мутантные белки, имеющие дополнительные аминокислотные замены, не приводяшие к существенным изменениям свойств белков.
Параметры фотоактивации для всех этих белков варьируют в широких пределах и существенно отличаются от таковых для белка дикого типа. В частности, различаются: длина волны (точнее, спектр действия) фотоактивирующего света; необходимая для фотоактивации интенсивность облучения; контраст яркости флуоресценции до и после фотоактивации; коэффициент молярной экстинкции и квантовый выход фотоактивированного белка; длины волн возбуждения и эмиссии флуоресценции фотоактивированного белка; время релаксации разожженного белка после фотоактивации; способность к эффективной необратимой фотоактивации флуоресценции, а также необходимая для такой фотоактивации мощность облучения. Руководствуясь в первую очередь достигаемыми контрастом яркости флуоресценции и яркостью (коэффициентом молярной экстинкции и квантовым выходом флуоресценции) разожженного белка, а также способностью к эффективной необратимой фотоактивации, мы постарались выбрать мутантный вариант, наиболее подходящий на роль фотоактивируемого флуоресцентного маркера, который может быть использован в биотехнологии.
Выбор основывался на наблюдениях поведения мутантных белков при облучении на разных длинах волн во флуоресцентном микроскопе и дальнейших более скрупулезных исследованиях с использованием спектрофлуориметра в сочетании с внешними источниками света. Более объективная и эффективная технология отбора контрастных и ярких вариантов ФАФБ из, например, большого числа мутантов, полученных методом случайного мутагенеза, может быть разработана с использованием флуоресцентного клеточного сортера (проточного цитофлуориметра — FACS). В перспективе можно ожидать значительного усовершенствования ФАФБ по параметрам контраста, яркости и эффективности фотоактивации. Мы выделили среди имеющихся вариантов мутантный белок asulCP ФАФБ1 - как наиболее контрастный и яркий вариант белка, разгорающегося при облучении зеленым светом. Свойства ФАФБ1. Параметры облучения, необходимого для обратимой и необратимой фотоактивации
Свойства ФАФБ1 очень сходны со свойствами белка asulCP дикого типа. ФАФБ1 - это практически не флуоресцентный хромобелок, способный разгораться (становиться ярко флуоресцентным) в ответ на интенсивное облучение зеленым светом и тушиться (возвращаться к нефлуоресцентному состоянию) при облучении синим светом. Фотоактивированный в зеленом свете ФАФБ1 становится ярко флуоресцентным, с параметрами возбуждения/эмиссии флуоресценции 575/600 нм, но постепенно релаксирует к нефлуоресцентному состоянию. Время полурелаксации обратимо разожженного белка при комнатной температуре составляет около 50 секунд, что значительно дольше, чем для белка дикого типа, см. рисунок 2.2.1.А. Существенно, что, подобно многим мутантным фотоактивируемым белкам, описанным в главе 2, облучение ФАФБ1 более интенсивным зеленым светом приводит к необратимой фотоактивации флуоресценции (Рис 2.2.1.В,С).