Содержание к диссертации
Введение
1.Обзор литературы
1.1. Возбудитель сифилиса - Treponema pallidum 12
1.2. Антигенные свойства белков Treponema pallidum 15
1.3. Эритроцитарные белковые диагностикумы 25
1.4. РПГА в серодиагностике сифилиса 29
1.5. Место РПГА в диагностике нейросифилиса 39
1.6. Ложноположительные реакции в РПГА. Применение рекомбинантных антигенов как способ повышения специфичности серодиагностики 45
2. Материалы и методы исследований
2.1. Рекомбинантные аналоги иммунодоминантных белков Т. pallidum ...50
2.2. Исследуемый материал 50
2.3. Тест-системы сравнения 53
2.4. Получение сенсибилизированных куриных эритроцитов 54
2.5. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) 57
2.6. Иммуноферментный анализ 61
2.7. Определение стабильности СЭ ускоренным методом 64
2.8. Статистическая обработка результатов 66
3. Результаты исследований и их обсуждение
3.1. Изучение иммунохимических свойств рекомбинантных антигенов -аналогов иммунодоминантных белков Т. pallidum. Сравнительный анализ антигенных свойств рекомбинантных белков в РПГА и ИФА 67
3.2. Разработка технологии производства гемагглютинациоиного диагностикума «ДС-РПГА анти-Люис», основанного на рекомбинантном антигене ТтрА. Характеристики теста «ДС-РПГА-анти-Люис» 76
3.3. Сравнительный анализ гемагглютинационных диагностикумов на основе рекомбинантных и лизатных трепонемных антигенов на разных стадиях сифилиса 91
3.4. Сравнение динамики титров антител к кардиолипину и к белку ТтрА Т. pallidum в процессе проведения противосифилитической терапии 96
3.5. Оценка возможности использования теста «ДС-РПГА-анти-Люис» для диагностики нейросифилиса 99
Заключение 105
Выводы 106
Список литературы 107
- Возбудитель сифилиса - Treponema pallidum
- РПГА в серодиагностике сифилиса
- Рекомбинантные аналоги иммунодоминантных белков Т. pallidum
- Изучение иммунохимических свойств рекомбинантных антигенов -аналогов иммунодоминантных белков Т. pallidum. Сравнительный анализ антигенных свойств рекомбинантных белков в РПГА и ИФА
Введение к работе
Актуальность проблемы.
В настоящее время сифилис является важной проблемой здравоохранения во всем мире. По оценкам ВОЗ, в мире ежегодно регистрируется 12 млн. новых случаев заболевания (Hook et al., 2004). Последнее десятилетие XX века охарактеризовалось в России вспышкой заболеваемости сифилиса с максимумом в 1997 году - 277 случаев на 100 тыс. населения. Рост общей заболеваемости сифилисом вызвал значительное увеличение случаев нейросифилиса. За последние пять лет (1999-2005) число зарегистрированных случаев нейросифилиса в РФ увеличилось в 10,5 раз - с 51 до 538 (Лосева, Аншуков, 2006). Среди них отмечено преобладание стертых и скрытых форм инфекции, что затрудняет диагностику данной стадии сифилиса. В последние годы наметилась тенденция к снижению заболеваемости сифилисом, но среднероссийский показатель заболеваемости еще слишком высок - 68,6 случаев на 100 тыс. населения в 2005 году (Иванова и др., 2006). В связи с этим возрастает необходимость совершенствования лабораторной диагностики сифилиса, внедрение в практику новых диагностических тестов.
Прямая детекция возбудителя сифилиса {Treponema pallidum subsp. pallidum) на некоторых стадиях заболевания затруднена. Культивирование бледных трепонем на искусственных питательных средах сопряжено с большими трудностями и связано, как правило, с потерей патогенности (Овчинников и др., 1987). Использование рекомбинантных антигенов - один из способов изучения полной аминокислотной последовательности белков патогенных штаммов Т. pallidum. Кроме того, рекомбинантные аналоги иммунодоминантных белков бледной трепонемы стандартны и безопасны.
Основную роль в постановке диагноза при сифилисе играет серодиагностика. Социальная значимость данного заболевания предъявляет ряд требований к современным иммунологическим тестам. Данные препараты должны иметь высокие показатели диагностической эффективности на всех стадиях заболевания. Диагностикумы должны быть просты в постановке, иметь короткое время проведения анализа, что дает возможность быстрого получения результата. Ценность диагностикума значительно возрастает, если с его помощью можно осуществлять контроль за проводимой терапией. В этом случая динамика титров специфических антител, выявляемых с помощью диагностикума, должна четко коррелировать с клиническими и лабораторными данными, свидетельствующими об эффективности терапии. Отвечающего всем этим требованиям теста в диагностике сифилиса в настоящее время не существует, поэтому серодиагностика сифилиса носит комплексный характер (Дмитриев, Брагина, 1996).
Широко применяемая для диагностики сифилиса реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) обладает одновременно качествами отборочного и подтверждающего теста: высокие показатели чувствительности, специфичности и воспроизводимости, простота постановки, возможность автоматизации, быстрота получения результатов. Используемые в настоящее время во всем мире гемагглютинационные диагностикумы для серодиагностики сифилиса созданы на основе лизатов сапрофитных и патогенных трепонем. Однако, отличаясь высокой специфичностью и чувствительностью при позднем сифилисе, РПГА тесты, основанные на трепонемных лизатах, уступают в чувствительности при первичном сифилисе тестам РИФ и ИФА (Johnston, 1972, Alessi, Scioccati, 1977, Jaffe et al., 1978, Luger et al., 1981, Pope et al., 1982). Известно, что после успешно проведенной терапии результаты РПГА, ИФА и РИФ диагностикумов длительное время остаются положительными, поэтому данные тесты не используют для оценки эффективности проводимого лечения и при посттерапевтическом контроле (Chambon et al., 1978, Hunter, 1979, Monsiorska-Borowska, 1983).
Накоплен большой опыт по повышению диагностической эффективности иммуноферментных тест-систем и иммуноблоттинга путем
7 использования рекомбинантных аналогов антигенов возбудителя сифилиса (Гражданцева и др., 1980, Zrein et al., 1995, Каур и др., 1998, Young et al., 1998, Иванов, 2000, Sambri et al., 2001, Rostopira et al, 2003, Sato et al, 2004). Высокие показатели чувствительности и специфичности отмечены для диагностикума на основе реакции агглютинации латекса с применением рекомбинантных аналогов протеинов бледной трепонемы (Young et al, 1998).
Данные, касающиеся изучения РПГА на основе рекомбинантных антигенов для выявления антител в сыворотке крови и спинномозговой жидкости больных сифилисом в литературе отсутствуют. Появление альтернативного серологического теста, пригодного для серо- и ликвородиагностики, обогатит возможности клиницистов и иммунологов для постановки точного диагноза заболевания.
Перспективным представляется изучение динамики титров специфических антител, определяемых гемаглютинационным диагностикумом, и оценка возможности использования данного теста для контроля эффективности терапии.
Цель и задачи исследования.
Целью работы явилось изучение иммунохимических свойств рекомбинантных аналогов основных иммунодоминантных белков ТтрА, 47 кДа, 17 кДа , 15 кДа Т, pallidum в реакции пассивной гемагглготинации на разных стадиях сифилиса, выбор рекомбинантных белков с высокой антигенной активностью и создание на их основе гемагглютинационного диагностикума.
Для достижения поставленной цели ставились следующие задачи: 1. Провести сравнительный анализ антигенных свойств рекомбинантных белков - аналогов основных мембранных протеинов ТтрА, 47 кДа, 17 кДа , 15 кДа Т. pallidum в РПГА и ИФА на разных стадиях сифилитической инфекции;
2. Выбрать рекомбинантные аналоги белков Т. pallidum с высокой антигенной активностью и разработать на их основе технологию получения стабильного гемагглютинационного диагностикума для выявления специфических антител;
3. Провести сравнительный анализ гемагглютинационных диагностикумов на основе рекомбинантных и лизатных трепонемных антигенов на разных стадиях сифилиса;
Сравнить динамику титров антител к кардиолипину и к белку ТтрА Т. pallidum в процессе проведения противосифилитической терапии;
С использованием рекомбинантных белков методами РПГА и ИФА исследовать особенности антителопродукции в образцах ликвора и определить возможность использования гемагглютинационного теста для диагностики нейросифилиса.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Методом РПГА в образцах сывороток крови больных сифилисом определяются в основном антитела к рекомбинантному аналогу антигена ТтрА Т. pallidum, а в образцах ликвора больных нейросифилисом - к белкам ТтрА и Тр 17.
2. Рекомбинантные антигены - аналоги иммунодоминантных белков Т. pallidum обладают высокой диагностической значимостью, что позволяет использовать их для создания иммунодиагностикумов.
3. Высокая корреляция динамики титров специфических и антикардиолипиновых антител позволяет использовать гемагглютинационный диагностикум на основе рекомбинантного ТтрА антигена для мониторинга проводимого противосифилитического лечения и контроле в посттерапевтический период.
9 Научная новизна исследования.
Впервые методом РПГА исследованы иммунохимические свойства четырех рекомбинантных антигенов - аналогов иммунодоминантных белков ТтрА, 47,17 и 15 кДа Т. pallidum.
Установлено, что гемагглютинационными диагностикумами в образцах сывороток крови больных сифилисом на разных стадиях инфекции определяются преимущественно антитела к белку ТтрА.
Показано, что гемагглютинационный диагностикум, основанный на использовании рекомбинантного белка - аналога иммунодоминантного эпитопа ТтрА антигена Т. pallidum, может использоваться для ликвородиагностики при нейросифилисе.
Впервые показана возможность использования гемагглютинационного диагностикума на основе рекомбинантного аналога белка ТтрА для оценки эффективности противосифилитического лечения и при контроле в посттерапевтический период.
Практическая значимость.
На основе формалинизированных куриных эритроцитов, сенсибилизированных рекомбинантным антигеном ТтрА, сконструирован РПГА тест для диагностики сифилиса. Разработанная тест-система «ДС-РПГА-анти-Люис» может применяться в комплексной диагностике заболевания в качестве скринингового и подтверждающего теста. Данный гемагглютинационный диагностикум адаптирован для тестирования образцов ликвора, что позволяет использовать его для выявления поражений ЦНС при сифилисе. Созданный гемагглютинационный диагностикум может использоваться для подтверждения динамических изменений титров антикардиолипиновых иммуноглобулинов, определяемых РМП, при проводимом лечении и в посттерапевтический период.
Разработан проект технологической документации на гемагглютинационный диагностикум для определения специфических
10 антител к Т. pallidum «ДС-РПГА-анти-Люис». В 000 НПО «Диагностические системы» налажен выпуск производственно-экспериментальных серий данной тест-системы.
Подана заявка № 2006112226 на патент РФ на изобретение.
Апробация работы.
Результаты работы доложены на Научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии», Барнаул, 1999 г., на VIII Всероссийском съезде дерматовенерологов, Москва, 2001 г., на Первом Российском конгрессе дерматовенерологов, Санкт-Петербург, 2003 г., на Всероссийской конференции дерматовенерологов «Современные направления диагностики, лечения и профилактики ИППП и дерматозов», Нижний Новгород, 2004 г., на 15-м Европейском Конгрессе клинической микробиологии и инфекционных заболеваний, Копенгаген, Дания, 2005 г., на IX Всероссийском съезде дерматовенерологов, Москва, 2005 г., на Курсах информации для врачей курируемой зоны по лабораторной диагностике ИППП, Нижний Новгород, 2005 г., на Областной научно-практической конференции «Итоги деятельности дерматологической службы Нижегородской области в 2005 г.», Нижний Новгород, 2006 г., на Областной научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматологии», Тюмень, 2006 г., на V съезде дерматологов и венерологов Республики Беларусь, Минск, 2006 г., на VI Научно-практической конференции «Социально значимые заболевания в дерматовенерологии. Диагностика, терапия, профилактика», Москва, 2006 г.
Структура и объем диссертации.
Материал диссертации изложен на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 226 источников на
11 русском языке и на иностранных языках. В текст включены 22 таблицы и 10 рисунков.
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе одна в центральной печати.
Возбудитель сифилиса - Treponema pallidum
Бледная трепонема - возбудитель сифилиса - была открыта в 1905 году F. Schaudinn и Е. Hoffman. Она относится к порядку Spirochaetales, семейству Spirochaetaeceae, роду Treponema, виду Treponema pallidum subsp. pallidum и получила свое название из-за слабой способности воспринимать окраску. Визуализация микроорганизма возможна посредством темнопольной микроскопии, электронной микроскопии и фазово-контрастиой микроскопии при импрегнации серебром.
Т. pallidum - это микроорганизм спиралевидной формы с одинаковыми по высоте завитками, число которых может достигать 14, средние размеры бактерии - 6 - 14 х 0,2 - 0,3 мкм. Основной способ размножения - поперечное деление (Медицинская микробиология, 1998). Трепонемы отличаются характерными движениями: вращением вокруг своей продольной оси, поступательным, маятникообразным, волнообразным, контрактильным. Активное перемещение в среде сопровождается сгибанием клетки под прямым углом без потери спиралевидной формы. Такого рода сгибательные движения отсутствуют у других спирохет и являются одним из классификационных признаков рода Treponema. По аналогии с грамотрицательными микроорганизмами бактерия имеет наружную и внутреннюю цитоплазматическую мембрану, тонкий слой пептидогликана, жгутики (эндофлагелла), лежащие в периплазматическом пространстве и тянущиеся от обоих концов к центру микроорганизма, и протоплазматический цилиндр (Дмитриев, Фриго, 2004). Внутри протоплазматического цилиндра также содержатся нитевидные структуры (цитоплазматические фибриллы), направленные параллельно периплазматической флагелле, функция которых до сих пор не ясна (Norris, 1993).
Геном Т. pallidum представлен кольцевидной хромосомой, состоящей из 1 138 006 пар оснований со средним содержанием гуанин-цитозина 52,8%. Это 13 один из мельчайших прокариотических геномов. ДНК содержит 1041 предсказанную кодирующую последовательность со средним размером 1023 Ьр, представляющими 92% генома бледной трепонемы. Гены с предсказанной биологической ролью составляют 55%, гены, соответствующие генам других видов бактерий - 17%, и 28% - ранее неизвестные гены. У Т. pallidum идентифицировано 42 генных семейства, ответственных за основные функции жизнеобеспечения микроорганизма (Fraser et al., 1998).
Бледная трепонема является облигатным паразитом и не культивируется in vitro. Это объясняет лимитирование процессов биосинтеза и способность выживать за счет организма хозяина. Т. pallidum может синтезировать в ограниченных количествах аминокислоты и кофакторы ферментов. Нет путей синтеза пуринов, пирамидинов и жирных кислот. Важную роль в жизнедеятельности возбудителя сифилиса играет транспорт необходимых питательных веществ из окружающей среды. Этим объясняется присутствие широкого спектра транспортных белков с большим выбором субстратных специфичностей, кодируемых 5% генома. Идентифицированы транспортные системы Сахаров, аминокислот, ионов, в то время как фосфотрансферазная транспортная система не обнаружена (Norris, Weinstock, 2000).
Т. pallidum - микроаэрофил. Единственным ферментом, отвечающим за утилизацию кислорода бледной трепонемой, считается NADH-оксидаза. В качестве источников энергии микроорганизм использует глюкозу, галактозу, мальтозу и глицерин. Предполагают, что Т. pallidum не способна использовать аминокислоты как альтернативный источник энергии. Метаболический анализ показал, что все ферменты гликолиза и пентозофосфатного пути присутствуют у данной бактерии. У бледной трепонемы не идентифицированы гены, кодирующие цикл трикарбоновых кислот, отсутствует дыхательная электронная цепь. Производство АТФ достигается путем субстратного фосфорилирования (Fraser et al., 1998).
Одной из важнейших функций Т. pallidum является движение, обуславливающее высокую активность и инвазивность организма. Группа Fla белков, кодируемых 36 генами, входит в состав жгутиковых структур. Обнаружено также 2 копии флагелярного белка-«выключателя» (Fli G). Данная спирохета содержит 13 генов хемотаксиса с возможной аминокислотной и углеводной специфичностью (Fraser et al., 1998).
Т. pallidum содержит большое семейство генов-дубликатов (tpr A-L), кодирующих возможные мембранные белки с функцией поринов и адгезинов. Многочисленные копии tpr генов могут участвовать в механизме антигенной изменчивости Т. pallidum. Возбудитель сифилиса не продуцирует липополисахаридов или сильнодействующих экзотоксинов, хотя известна ее цитотоксическая активность в отношении нейробластов и других клеток. В состав трепонемного генома входит 5 генов, кодирующих протеины, которые, возможно, относятся к гемолизинам или цитотоксинам. G.M. Weinstock (1998) выделил группу из 67 генов, предположительно ответственных за вирулентные функции Т. pallidum.
Основными антигенными детерминантами бледной спирохеты являются протеины, имеющие в своем составе фракции, общие для патогенных и сапрофитных трепонем, против которых синтезируются групповые антитела. Протеиновые фракции антигенов бледной трепонемы являются в большинстве своем липопротеинами и обладают высокой иммуногенностью (Schouls et al., 1992).
Антифосфолипидные антитела в сыворотках больных сифилисом традиционно описывали как нетрепонемные, считая их антителами, образованными к липоидным антигенам человеческого организма. J.D. Radolf (1995) продемонстрировал, что Т. pallidum синтезирует кардиолипин -основной фосфолипидный антиген. В отличие от кардиолипина фосфолипиды и гликолипиды, обнаруженные в наружной мембране трепонемы, не реагируют с иммуноглобулинами в сыворотке больного сифилисом.
РПГА в серодиагностике сифилиса
Значительный уровень заболеваемости сифилисом в настоящее время обуславливает необходимость применения простых и дающих быстрый ответ методов серодиагностики. Преимуществом в этом отношении за счет высоких показателей чувствительности, специфичности и воспроизводимости, быстроты получения результатов и простоты постановки обладают тесты на основе реакции гемагглютинации.
Методы, основанные на феномене агглютинации сенсибилизированных эритроцитов, делятся на реакции прямой и непрямой или пассивной гемагглютинации. В РПГА связанный с эритроцитом антиген выполняет исключительно индикаторную роль в отличие от прямой агглютинации, когда антиген является структурным компонентом поверхности эритроцита. Суспензия СЭ разводится сывороткой больных. Если в сыворотке содержатся специфические антитела, то в планшете для микротитрования наблюдается агглютинация эритроцитов. Причиной агглютинации служит «сшивка» расположенных на поверхности эритроцитов антигенов молекулами иммуноглобулинов (теория решетки). При агглютинации образовавшиеся комплексы антиген-антитело препятствуют оседанию эритроцитов на дно лунки, и эритроциты располагаются на ее поверхности в виде «зонтика». При отрицательном результате эритроциты свободно соскальзывают вниз и образуют осадок в виде компактной точки (Дмитриев, Фриго, 2004).
Феномен пассивной гемагглютинации для диагностики сифилиса впервые был использован в 1932 году W. Bachman и G. Blumental (Балашов, 1981), которые применили в качестве антигена экстракт из печени больного сифилисом. Однако описанная реакция не получила распространения, т.к. имела большой процент как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов. Эти существенные недостатки был устранены значительно позже, после того, как в качестве антигена были использованы лизаты бледной трепонемы.
В 1965 году Т. Rathlev использовала в качестве антигенов, фиксированных на бараньих эритроцитах, лизаты сапрофитных трепонем штамма Рейтер и патогенных трепонем штамма Николе. Протестировав 300 образцов «положительных» и «отрицательных» сывороток, Т. Rathlev (1967) пришла к заключению, что новый тест не уступает по чувствительности РИБТ и близок к РИФ при диагностике сифилиса.
Исследования Т. Tomizawa и S. Kasamatsu в 1966 и 1969 гг. продолжили работы Т. Rathlev. По данным японских ученых, полученных при тестировании 231 образцов сывороток крови больных сифилисом, результаты РПГА несколько превосходили по чувствительности результаты РИФ, кроме первичного сифилиса, и РПГА была более чувствительной, чем VDRL тест. Т. Tomizawa и S. Kasamatsu (1969) считают, что РПГА достаточно специфична и с ее помощью можно дифференцировать положительные результаты РСК с кардиолипиновым антигеном и протеином Т. phagedenis штамм Рейтер на обусловленные сифилисом и неспецифические. Отмечено также, что специфичность РПГА сопоставима с РИФ. Причинами неспецифических реакций в РПГА являются: 1) спонтанная агглютинация из-за нестабильности клеточной суспензии; 2) агглютинация из-за антител, образуемых против бараньих эритроцитов; 3) перекрестные реакции из-за общих родоспецифических трепонемных антигенов. Японскими исследователями были подобраны компоненты реакционной смеси, позволяющие устранить причины неспецифических взаимодействий. Добавление детергентов Твина 80 и гуммиарабика стабилизировало клеточную суспензию, а адсорбция образца сыворотки с формализированными, танизированными эритроцитами и с лизатом трепонемы штамм Рейтер значительно уменьшала число неспецифических реакций. Эти эксперименты были завершены созданием технологии производства гемагглютинационных тест-систем. Японские реактивы для РПГА стали коммерческими, и большинство авторов за рубежом изучали данную реакцию с этими ингредиентами. Ввиду высокой стоимости лизатов трепонем снижение объема реагентов имело большое значение, поэтому широкое распространение получила микромодификация рассматриваемого метода, предложенная в 1969 году P.M. Сох. В диагностикуме МНА-ТР применялись японские коммерческие реагенты, но при постановке реакции использовалось только 20% эритроцитов от количества, предложенного Т. Tomizawa. Сыворотка крови пациента вначале разводилась в адсорбирующем растворе для удаления антител, направленных против родоспецифических трепонемных антигенов, содержащем эритроциты барана, мембраны коровьих эритроцитов, нормальный экстракт яичка кролика, лизат трепонем штамма Рейтер, нормальную кроличью сыворотку и стабилизатор. Затем сыворотка тестировалась с бараньими эритроцитами, сенсибилизированными лизатом патогенной Т. pallidum шт. Николе, и с контрольными эритроцитами. Рабочее разведение образца сыворотки крови составило 1:80. Уменьшение объема сыворотки и суспензии эритроцитов позволили использовать для постановки реакции полистироловые круглодонные микротитровальные пластины. P.M. Сох (1969) описал также автоматизированный вариант реакции микрогемагглютинации АМНА-ТР. С помощью автомата за 3 минуты происходило раскапывание в планшеты образцов сывороток, осуществлялось последовательное двукратное титрование сывороток и добавлялись сенсибилизированные и контрольные эритроциты. Учет результатов проводился визуально. Реактивность проверялась на образцах сывороток кроликов и шимпанзе, зараженных сифилисом, а также на образцах сывороток здоровых кроликов. Получены позитивные результаты АМНА-ТР у кроликов к 10 дню после заражения, что было раньше чем в FTA и VDRL. Позже от АМНА-ТР пришлось отказаться из-за недостаточной воспроизводимости результатов (Coffey et al., 1972).
Гемагглютинационные тесты на основе бараньих эритроцитов имели время постановки реакции 4 часа. Эритроциты птиц значительно крупнее эритроцитов млекопитающих, поэтому и скорость их оседания выше. Использование В.В. Wentworth (1978) формализированных эритроцитов индейки позволило сократить время реакции до 1 часа. Созданный новый гемагглютинационный тест получил название HAATS. Лизат патогенной Т. pallidum шт. Николе был фиксирован глутаровым альдегидом на формализированных эритроцитах индейки. Перед постановкой образцы сывороток прогревались в течение 30 минут при 56С, что существенно уменьшало число неспецифических реакций. Затем образцы разводились в адсорбирующем растворе, аналогичном раствору, используемом в FTA. Далее проводилась постановка реакции аналогично МНА-ТР. Рабочее разведение образцов сывороток составило 1:80. С образцами сывороток, показавшими неопределенный результат, проводилось повторное тестирование.
Рекомбинантные аналоги иммунодоминантных белков Т. pallidum
У 44 пациентов исследовалась динамика титров специфических антител в сыворотке крови в процессе проводимого лечения (23 больных с диагнозом сифилис вторичный, 13 - сифилис скрытый и 8 - сифилис поздний). Лечение больных сифилисом проводилось с использованием бензилпенициллина по рекомендованным МЗ РФ схемам. Титры проти вотрепонемных антител также определялись в парных образцах сывороток 4 больных с диагнозом серорезистентность, получающих дополнительное лечение. Первый образец сыворотки у каждого больного брался перед началом терапии, а второй - через 2-8 недель после начала лечения. Динамика титров специфических антител была изучена у 5 пациентов, находящихся на сероконтроле после проведенной противосифилитической терапии, с периодичностью взятия образца сыворотки крови через 1-5 месяцев.
Для оценки возможности использования гемагглютинационного теста на основе рекомбинантных антигенов для диагностики нейросифилиса были исследованы предоставленные Нижегородским НИКВИ 13 парных образцов (сыворотка ликвор) от больных сифилисом с поражением нервной системы, 9 парных образцов от больных сифилисом без поражения нервной системы и 2 парных образца от лиц, получивших лечение по поводу нейросифилиса и находящихся на сероконтроле. Кроме того, анализировались 3 образца ликвора от больных сифилисом с поражением нервной системы, 4 образца ликвора от больных сифилисом без поражения нервной системы и 1 образец ликвора от пациента, получившего лечение по поводу нейросифилиса. Диагноз нейросифилиса устанавливался на основе клинических данных и результатов серологических тестов РИФ, ИФА, РМП, РСК с кардиолипиновым и трепонемным антигенами.
Для оценки специфичности РПГА тестов использовались 2478 образцов сывороток крови от лиц, не страдающих сифилитической инфекцией, среди них: образцы сывороток 1918 здоровых доноров (предоставлены Нижегородской областной станцией переливания крови, зав. отделением Кощеева Н.А. и Дзержинской станцией переливания крови, Нижегородская обл., зав. отдела заготовки крови Окатышева Н.А.), 96 больных ВИЧ-инфекцией, 54 больных острым гепатитом А, 47 больных гепатитом В, 143 больных гепатитом С (коллекция сывороток крови НПО «Диагностические системы»), 48 больных лейкозом детей (предоставлены Областной детской больницей, г. Н.Новгород, зав. кафедрой детских инфекций д.м.н. Краснов В.В.), 8 больных клещевым боррелиозом (предоставлены Алтайским краевым центром СПИД, г. Барнаул, зав. лабораторией Белых СИ.), 52 беременных (предоставлены Семеновской районной больницей, Нижегородская обл., зав. лабораторией Комарова О.А.), образцы сывороток 54 лиц с неспецифическими результатами тестирования в КСР и ИФА тестах, 48 больных хламидиозом, 10 больных генитальным герпесом (предоставлены Сормовским КВД и Нижегородским НИКВИ). Все образцы сывороток здоровых доноров не содержали антител к Т. pallidum, к ВИЧ -1,2, к вирусу гепатита С и HBsAg.
Группу сывороток с ЛПР в КСР и ИФА составили 13 образцов (24%) от пациентов с соматическими патологиями (псориаз, злокачественные новообразования, полиартрит, ишемическая болезнь сердца), 5 образцов (9,3%) от больных с остро протекающим инфекционным процессом (грипп, цервицит, гепатит В), 11 образцов (20,4%) от лиц в возрасте старше 60 лет, 7 образцов (13%) от беременных. В 18 случаях (33,3%) причину ЛПР установить не удалось. Неспецифические результаты в РМП отмечены в 61,1% случаев, в РСК с кардиолипиновым антигеном у 38,9%, в РСК с трепонемным антигеном у 70,4% и в ИФА у 74,1% пациентов. Ложноположительный характер реакций в КСР и ИФА у этих обследованных был доказан отрицательными результатами анализа при исследовании их сывороток в РИФабс.
Изучение иммунохимических свойств рекомбинантных антигенов -аналогов иммунодоминантных белков Т. pallidum. Сравнительный анализ антигенных свойств рекомбинантных белков в РПГА и ИФА
Используя известные методики сенсибилизации эритроцитов белковыми сенситииами при изготовлении гемагглютинационных диагностикумов, были испытаны следующие коньюгирующие агенты: глутаровый альдегид, риванол и хлорный хром.
Формалинизированные куриные эритроциты были сенсибилизированы рекомбинантными аналогами ТптрА, 17 кДа и 47 кДа антигенов Т. pallidum в концентрациях от 0,1 до 8 мг/мл. Оценка эффективности сенсибилизации эритроцитов с помощью разных коньюгирующих агентов проводилась на восьми образцах сывороток крови, содержащих противотрепонемные антитела, и на восьми образцах сывороток здоровых доноров.
Результаты визуальной оценки степени агглютинации в РИГА с эритроцитами, сенсибилизированными разными методами, представлены в табл. 3 (положительная реакция, в зависимости от диаметра «зонтика» на поверхности лунки, обозначена по четырех крестовой шкале; отрицательная реакция - четкая точка на дне лунки).
Сенсибилизация формалинизированных куриных эритроцитов рекомбинантными антигенами в присутствии 0,33% раствора хлорного хрома была наиболее эффективной. Только с помощью эритроцитов, сенсибилизированных в присутствии хлорного хрома, результаты реакции можно было разделить на положительные и отрицательные в соответствии с поставленным диагнозом, спонтанной агглютинации при этом не наблюдалось. Для оптимизации процесса сенсибилизации использовался раствор хлорного хрома длительного срока хранения (от одного до шести месяцев), содержащий максимальное число основных изомерных форм (Faulk, Houba, 1973). Сенсибилизация проводилась при 42 С в течение 60 минут результаты РПГА, полученные с эритроцитами, сенсибилизированными рекомбинантным антигеном ТтрА в концентрации 0,25 мг/мл (с антигенами Тр17 и Тр47 в концентрации 0,25 мг/мл получены аналогичные результаты). Известно, что для успешной сенсибилизации эритроцитов животных соотношение антигена и хлорного хрома должны быть оптимальным (Каральник и др., 1982). Максимальная чувствительность гемагглютинационного теста получена при использовании раствора антигена с содержанием белка от 0,15 до 0,3 мг/мл. Уровень оптимальной концентрации антигена зависел от срока хранения формалинизированных эритроцитов, для более свежих эритроцитов требовались более низкие концентрации сенситина. С увеличением концентрации белка наблюдалась спонтанная агглютинация эритроцитов, вызванная, возможно, сшивками молекул протеина между собой. При редком расположении молекул антигена на поверхности красных кровяных клеток чувствительность РПГА уменьшалась. По-видимому, при взаимодействии таких эритроцитов с образцами сывороток крови с низким содержанием специфических антител точек связывания было недостаточно для образования гемагглютинационной «решетки».
Формалинизированые куриные эритроциты в присутствии хлорного хрома были сенсибилизированы отдельными рекомбинантными белками, воспроизводящими основные иммунодоминантные протеины ТтрА, 47,17 и 15 кДа Т. pallidum. Для определения оптимальной концентрации каждый рекомбинантный антиген исследовался в диапазоне концентраций от 0,1 до 1 мг/мл. В качестве оптимальной выбирали концентрацию белка, выше которой растет число неспецифических взаимодействий с СЭ и КЭ, ниже которой снижается уровень положительного сигнала. Были подобраны концентрации рекомбинантных белков: ТтрА - 0,25 мг/мл, Тр47 - 0,24 мг/мл, Тр17 - 0,29 мг/мл, Тр15 - 0,25 мг/мл.
Изучение иммунохимических свойств рекомбинантных белков методом РПГА проводилась с использованием сывороток крови больных сифилисом разными стадиями. Постановка реакции осуществлялась в оптимальном режиме для проведения РПГА на формалинизированных куриных эритроцитах: в качестве реакционной смеси выбран физиологический раствор, рабочее разведение образца сыворотки крови 1:80, температура реакции от 18 до 25 С, время проведения реакции 30-40 минут. Образец сыворотки тестировался параллельно в двух лунках планшета с СЭ и КЭ. Результаты исследования представлены в табл. 4 и 5.
Из приведенных результатов видно, что при тестировании образцов сывороток больных сифилисом максимальный показатель чувствительности был получен в РПГА-тесте, где в качестве сенситина использовался рекомбинантный ТтрА белок, причем в шести пробах обнаружены антитела только к данному антигену. Полученные результаты совпадают с данными других исследователей (Ijsselmuiden et al., 1989, Stienstra et al., 1992, Гражданцева, 2000, Иванов, 2000), показавших высокую антигенную активность ТтрА белка Т. pallidum,
В трех образцах с клинически и серологически подтвержденным диагнозом сифилис первичный в РПГА не было обнаружено противотрепонемных антител ни к одному антигену, и в одном образце присутствовали антитела только к Тр47 и Тр15. Если для сифилиса первичного чувствительность теста на основе ТтрА была значительно выше чувствительности остальных РПГА тестов (р 0,05), то для стадий вторичного, скрытого и позднего сифилиса уровень антител к данному антигену соотносился с высокими уровнями специфических иммуноглобулинов ко всем трепонемным антигенам (р 0,05). Тестирование образцов сывороток пациентов, находящихся на контроле в посттерапевтичии период, показало, что процент положительных результатов был минимальным в TmpA-РПГА, но достоверно не отличался от процента положительных результатов, полученных в Тр15-РПГА (р 0,05), уступая тестам Тр47-РПГА и Тр17-РПГА (р 0,05). Это может свидетельствовать о том, что антитела к белку ТтрА первыми исчезают в сыворотке крови больных после адекватно проведенной терапии, что согласуется с данными нескольких авторов (Ijsselmuiden et al., 1989, Schouls et al., 1989, Кочанова, 2002, Иванов и др., 2005). Учитывая, что помимо создания высокочувствительного диагностикума ставилась задача конструирования теста, пригодного для контроля за эффективностью лечения, был выбран белок ТтрА, показавший результаты, отвечающие заявленным требованиям.
Все РПГА тесты с использованием отдельных антигенов показали высокую специфичность (р 0,05).
