Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы
1.1 Гетерогенность опухолевых клеток in vitro и in vivo, определяемая методом SP 23
1.2 Характерные особенности клеток SP при культивировании в разных условиях и их связь со свойствами опухолевых стволовых клеток 26
1.3 Чувствительность клеток SP к редко- и плотноионизирующему излучению 31
1.4 Химиорезистентность клеток SP 37
1.5 Механизмы радио- и химиорезистентности клеток SP 42
ГЛАВА 2 Материалы и методы
2.1 Культивирование клеток меланомы В16 и рака молочной железы MCF-7 in vitro 52
2.2 Идентификация и определение количества клеток SP в изучаемых культурах с помощью проточной цитофлуориметрии 52
2.3 Сортировка клеток по способности исключать флуоресцентный краситель Но342 56
2-4 Методы сравнительного исследования клеток SP и NSP 57
2 д і Определение клоногенной способности клеток изучаемых популяций з
2.4.2 Анализ клеточного цикла в отсортированных популяциях 58
2.4.3 Определение внутриклеточного содержания оксида азота в изучаемых популяциях опухолевых клеток 59
2.4.4 Исследование экспрессии поверхностных маркеров в клетках SP и NSP аденокарциномы молочной железы линии MCF-7 60
2.4.5 Определение двунитевых повреждений ДНК в клетках изучаемых популяций меланомы линии В16 62
2.4.6 Анализ содержания БТШ27 и БТШ70 в клетках SP и NSP линии MCF-7 63
Облучение клеток, источники ионизирующих излучений 65
Обработка клеточных культур противоопухолевыми препаратами 69
Статистический анализ полученных результатов 70
Результаты исследования
Количественная оценка и характеристика клеток SP в контроле по экспрессии поверхностных маркеров CD44 и
CD24 в сравнении с остальной массой клеток 71
Изменение количества клеток SP меланомы В16 и рака молочной железы MCF-7 под действием у-излучения в разных дозах 73
Сравнительный анализ чувствительности клеток изучаемых популяций к действию редко- и плотноионизирующего излучений на примере меланомы В16 76
Влияние гамма- и нейтронного излучения на репродуктивную выживаемость клеток SP и NSP линии MCF-7 77
Влияние противоопухолевых препаратов на субпопуляционный состав клеточных культур 79
3.5.1 Изменение количества клеток SP меланомы В16 и аденокарциномы молочной железы MCF-7 под действием метотрексата 79
3.5.2 Изменение относительного и абсолютного количества клеток SP линии MCF-7 после инкубации с цисплатином и салиномицином 82
Механизмы высокой резистентности клеток SP к действию редкоионизирующего излучения по сравнению с остальной массой клеток 86
3.6.1 Распределение клеток изучаемых популяций по фазам клеточного цикла 86
3.6.2 Сравнительная оценка спонтанных и радиационно-индуцированных двунитевых повреждений ДНК по количеству фокусов уН2АХ в клетках SPHNSP 89
3.6.3 Содержание оксида азота (II) в клетках сравниваемых популяций 91
3.6.4 Конститутивный и радиационно-индуцированный уровень БТШ27 и БТШ70 в изучаемых популяциях клеток 93
ГЛАВА 4 Обсуждение результатов
4.1 Метод SP и возможность идентификации с его помощью фракции, обогащенной опухолевыми стволовыми клетками 96
4.2 Закономерности действия ионизирующего излучения разного качества на клетки SP 97
4.3 Молекулярно-клеточные механизмы резистентности SP и других популяций, экспрессирующих маркеры опухолевых стволовых клеток, к действию редкоионизирующего излучения 100
4-4 Высокая химиорезистентность клеток SP и других популяций, выявляемых по экспрессии маркеров опухолевых
стволовых клеток 104
Заключение 106
Выводы
Список сокращений и условных обозначений 112
Список литературы
- Чувствительность клеток SP к редко- и плотноионизирующему излучению
- Определение клоногенной способности клеток изучаемых популяций
- Влияние гамма- и нейтронного излучения на репродуктивную выживаемость клеток SP и NSP линии MCF-7
- Молекулярно-клеточные механизмы резистентности SP и других популяций, экспрессирующих маркеры опухолевых стволовых клеток, к действию редкоионизирующего излучения
Чувствительность клеток SP к редко- и плотноионизирующему излучению
Известно, что любое злокачественное новообразование гетерогенно по клеточному составу и состоит из популяций опухолевых клеток, отличающихся по чувствительности к противоопухолевым воздействиям. Исследование различных проявлений и причин такой гетерогенности, влияющей на эффективность противоопухолевой терапии, представляет значительный интерес для радиационной биологии и онкологии. Существуют разные виды гетерогенности, но в данном разделе работы будут проанализированы некоторые аспекты внутриопухолевой гетерогенности, отражающей тот факт, что каждая отдельная опухоль или культура опухолевых клеток состоит из функционально и фенотипически неоднородных опухолевых клеток [7].
Внутриопухолевая гетерогенность наблюдается на морфологическом, биохимическом, молекулярно-генетическом и других уровнях, тесно связанных между собой [3, 80]. В частности, опухолевые клетки одного и того же новообразования in vivo или клеточной культуры in vitro могут отличаться по способности к обратной транспортировке из цитоплазмы ряда соединений, в том числе липофильного красителя Но342. Поэтому при проточноцитометрическом исследовании можно выявить две популяции опухолевых клеток: слабо окрашенные клетки, которые интенсивно откачивают Но342 и формируют так называемую боковую популяцию (side population - SP), и остальные клетки, которые сильно окрашиваются Но342. В отношении последних в мировой литературе часто применяется термин «поп side population - NSP» (не боковая популяция). В данной работе используются оба термина (SP и NSP), которые являются общепринятыми в мировой литературе.
Существование клеток SP впервые было обнаружено Маргарет Гуделл и соавторами в 1996 г. [66]. Первоначальный замысел исследователей состоял в изучении влияния гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) на восстановление кроветворения в организме летально облученных реципиентов (мышей) в зависимости от пролиферативной активности этих клеток. Клетки предполагалось разделить с помощью флуоресцентного красителя Но342, который применялся как индикатор различных фаз клеточного цикла. Результаты проведенных экспериментов оказались неожиданными. При исследовании костного мозга мышей, инкубированного с красителем Но342, была обнаружена группа клеток, которые слабо окрашивались этим красителем. На графике распределения клеток по интенсивности флуоресценции в двух диапазонах длины волны (450 и 675 нм) эта группа формировала небольшую (-0,1 %), но четко обозначенную популяцию, расположенную в стороне (сбоку) от основной массы клеток. Термин «боковая популяция» (SP) возник из-за расположения таких слабоокрашенных клеток на указанном графике. Существенно, что количество клеток SP многократно уменьшалось после инкубации с верапамилом -известным ингибитором АТФ-связывающих транспортеров. Эта особенность клеток SP используется и по сей день для их выявления с помощью проточной питометр ИИ.
Гуделл и соавторами было показано, что эти клетки обладают свойствами ГСК, а именно: - клетки SP при трансплантации облученным мышам дают начало большинству клеток крови, т.е. являются полипотентными; - клетки SP способны к длительному поддержанию кроветворения, т.е. обладают свойством самообновления; - большинство клеток SP находятся в состоянии покоя (Go / Gi), лишь 1-3 % относятся к S - G2 фазам клеточного цикла; - большинство клеток SP ( 75 %) имеют иммунофенотип Sca-1 lin neg ow, который является маркером стволовых клеток [196], в то время как во всем костном мозге содержание Sca-1 lin neg ow клеток не превышает 1 %.
Таким образом, впервые метод SP стал использоваться для изучения свойств стволовых клеток гемопоэтической ткани млекопитающих. Позднее клетки SP были обнаружены во множестве других нормальных тканей и органов -молочной железе [16, 48], легких [132], скелетных мышцах [139], почках [94], сердце [136], печени [177], головном мозге [103, 195] и коже [114, 229] человека и животных. Как и в костном мозге, в других нормальных тканях клетки SP являются редкими событиями, составляя, например, в молочной железе 0,2-5,0 % по данным разных авторов [180], в легких - менее 1 % [132], в сердце - около 2 % [136], в почках - 0,03-0,1 % [94] и т.д.
Клетки SP с разной частотой (0,01-20 %) [221], а по некоторым данным, до 37 % [83], были обнаружены в первичных культурах опухолевых клеток или ряде опухолей in vivo: нейробластоме [83], меланоме [70, 131, 219, 237], раке легкого [85], раке головы и шеи [190], раке яичника [86, 87, 189], раке простаты [23] и множестве мезенхимальных новообразований [222]. При этом следует отметить, что в ряде случаев (т.е. у части пациентов) клетки SP не удается идентифицировать. Так, например, при нейробластоме SP была выявлена у 15 из 23 пациентов [83], при раке яичника - у 4 из 6 больных [189]. Однако при исследовании 38 образцов меланомы клетки SP были обнаружены во всех случаях, а их доля составила 0,1-2,2 % от общего числа опухолевых клеток [219].
Многочисленные данные литературы свидетельствуют о существовании SP также в стабильных линиях опухолевых клеток in vitro: JF нейробластомы, D54, U87, U251, U373 глиомы [83], WERI-Rb27 ретинобластомы [175], В16 меланомы [49], SAS, SASV03, HSC4, SCC25 рака головы-шеи [31, 186, 223, 227], NPA, WRO, SW1736, С643, HTh74 рака щитовидной железы [62], Н460, Н23, НТВ-58, А549, Н441, Н2170 рака легкого [85], MCF-7, MDA-MB-231 рака молочной железы [82, 158], КМН2, L428 лимфомы Ходжкина [142], RC-58T рака простаты [250], А2780, MOVCAR7 и 4306 рака яичника [50, 189], HeLa, SiHa рака шейки матки [127, 165, 178], ЕС9706 and ЕС109 рака пищевода [89], MKN-45, BGC-823 рака желудка [239] и многих других линиях опухолевых клеток желудочно-кишечного тракта человека [78, 118]. При этом следует отметить, что наличие SP характерно не для всех линий опухолевых клеток, например, эта популяция не обнаружена в клеточных линиях, происходящих из опухоли Вильямса (SK-NEP 26 1), рабдомиосаркомы (А 204) [83], рака яичника (MOVCAR8) [189], рака печени (HepG2) [78], и некоторых других линиях [158]. В отношении остеосаркомы существуют противоречивые данные. Так в работе Yang и соавторов [228], клетки SP были выявлены во всех исследованных операционных образцах первичной остеосаркомы и в то же время не были обнаружены в стабильных линиях остеосаркомы SaOS-2, U20S [83]. Таким образом, существование SP доказано в большинстве изученных объектов (образцах опухолевой ткани, первичных или стабильных линиях опухолевых клеток), включая использованные в данной диссертационной работе.
Определение клоногенной способности клеток изучаемых популяций
Большинство авторов, занимающихся проблемой гетерогенности опухолевых клеток с позиции концепции ОСК, приходят к заключению о более высокой радиорезистентности ОСК по сравнению с остальной массой опухолевых клеток [46, 52, 106, 150, 171, 218]. Следует отметить, что это заключение базируется на многочисленных результатах исследования ОСК, идентифицированных по иммунофенотипу. Данных о радиочувствительности клеток SP и NSP значительно меньше и они носят фрагментарный характер. В первую очередь это связано с малой продолжительностью разработки проблематики, а также с рядом методических трудностей при проведении подобных экспериментов [181], включая подбор оптимальных условий окрашивания и анализа клеток с помощью Но342, которые могут различаться для разных линий опухолевых клеток, необходимость очень точной сортировки клеток SP и NSP, соблюдение строгой стерильности при сортировке в опытах с длительным культивированием этих популяций.
Радиочувствительность SP и NSP изучалась преимущественно в условиях in vitro. Основная часть работ посвящена исследованию эффектов действия редкоионизирующего, главным образом, рентгеновского излучения на указанные популяции. Одним из первых исследований стало изучение в 2007 г. чувствительности клеток SP и NSP культуры рака носоглотки линии CNE-2 к действию рентгеновского излучения в дозе 2,0 Гр [205]. Для оценки репродуктивной гибели был использован классический тест на колониеобразование (подсчет колоний из 50 и более клеток производился через 7 суток после воздействия). Было выявлено, что клетки SP формируют примерно в 4 раза больше колоний после облучения, чем клетки NSP; эта разница была статистически значима. Интересным также представляется то, что для SP не было обнаружено различий по числу колоний до и после облучения, в то время как в случае NSP число колоний после облучения существенно уменьшалось. Эта информация свидетельствует о высокой радиорезистентности SP указанной линии опухолевых клеток по сравнению с NSP; резистентность клеток SP была так высока, что после облучения в стандартной терапевтической дозе гибель клеток отсутствовала. Для определения максимально эффективной дозы, согласно этим данным, необходимо изучение радиочувствительности клеток в широком диапазоне доз, однако, как будет изложено далее, подобных исследований довольно мало.
Приблизительно в то же время были опубликованы первые данные о чувствительности SP и NSP культуры рака молочной железы MCF-7 к действию редкоионизирующего излучения [217]. Авторы работы, как и большая часть исследователей в последующем, для оценки радиочувствительности использовали не классический тест на колониеобразование, а измерение процента SP в общей популяции через сутки и более после облучения. Такой метод дает достаточно информации об относительной радиочувствительности SP и NSP, но имеет некоторые недостатки, например, не позволяет сделать вывод о причине увеличения доли клеток SP после облучения, которая может изменяться как благодаря большей гибели клеток NSP в ранние сроки после воздействия, так и благодаря усиленной пролиферации клеток SP в последующее время. Кроме того, нельзя исключить также возможность перехода клеток NSP в SP вследствие дедифференцировки, которая происходит достаточно редко в интактных культурах, но может усиливаться под влиянием различных факторов как показано в отношении ОСК, выявляемых методом иммунофенотипирования [29, 47, 90, 120]. Группой исследователей во главе с Woodward в 2007 году было показано, что клетки линии MCF-7 в целом являются достаточно радиочувствительными, и статистически значимое увеличение доли клеток SP наблюдается уже при воздействии в дозе 2,0 Гр [217]. Максимальное значение этого показателя наблюдалось при облучении в дозе 4,0 Гр (процент клеток SP увеличивался приблизительно в 5,5 раз по сравнению с контролем), после чего происходило его уменьшение.
Другой подход к сравнительному исследованию радиочувствительности клеток SP и NSP представлен в работе [203]. Авторы облучали в дозе 2,0 Гр отсортированные клетки SP и NSP линии Нер-2 рака гортани и через 2 суток после радиационного воздействия оценивали количество живых клеток. Подавление количества клеток SP под действием радиации составило всего 6,7 %, в то время как количество клеток NSP уменьшалось на 29,9 % (р 0,0001), что позволило авторам сделать вывод о более высокой радиорезистентности первых.
Изучение относительной радиочувствительности клеток SP в различных модельных системах и с помощью различных методов продолжается довольно успешно и сегодня [ПО]. Хотя большинство авторов отмечают меньшую чувствительность клеток SP (чем NSP) к действию редкоионизирующего излучения, в ряде клеточных линий не удается обнаружить это различие. Так, например, в работе Wilson и соавторов в 2013 г. была изучена выживаемость клеток SP и NSP пяти линий рака орофарингеальной зоны с применением классического метода оценки колониеобразования в контроле и после воздействия рентгеновским излучением в дозах до 4,0 Гр [212]. В данном случае объектом исследования служили клетки из ранних пассажей первичных культур, полученных из образцов опухолей до лечения или рецидивных очагов. Ни в одной из изученных клеточных линий авторы не обнаружили значимых различий между клетками SP и NSP по клоногенной выживаемости после облучения. В качестве следующего примера можно привести исследование радиочувствительности 4-х клеточных культур рака поджелудочной железы, только часть из которых продемонстрировала различия в радиочувствительности между SP и NSP к действию редкоионизирующего излучения в однократной дозе 4,0 Гр [96]. Противоречивость полученных результатов может быть объяснена как действительным отсутствием различий радиочувствительности SP и NSP в некоторых клеточных культурах, так и недостаточно широким диапазоном выбранных доз.
Влияние гамма- и нейтронного излучения на репродуктивную выживаемость клеток SP и NSP линии MCF-7
Исследовали клоногенную способность клеток изучаемых линий в контроле и после облучения. В частности: - сравнивали клоногенную способность (репродуктивную выживаемость) клеток SP и NSP линии В16 после действия редкоионизирующего излучения в разных дозах по параметрам дозовой зависимости D0 и Dq; - сравнивали репродуктивную выживаемость клеток SP и NSP линии В16 после действия плотноионизирующего излучения в разных дозах (по величине Do соответствующих дозовых зависимостей); - сравнивали репродуктивную выживаемость клеток SP и NSP двух изучаемых линий после действия плотноионизирующего излучения (по величине Do соответствующих дозовых зависимостей).
Как описано в разделе 2.5, отсортированные клетки SP и NSP подвергали радиационному воздействию в разных дозах. После облучения клетки линии В16 культивировали в стандартных условиях в течение 9 суток, клетки линии MCF-7 - в течение 12 суток. Затем фиксировали колонии в 96 % этаноле в течение 15 мин и окрашивали трипановым синим, после чего производили подсчет колоний численностью не менее 40 клеток под инвертированным микроскопом Leica DM IL Led (Leica Microsystems GmbH, Германия). В каждом эксперименте использовали по 4-6 чашек Петри в контроле и по 3-4 чашки Петри на каждую дозу облучения. Построение кривых доза-эффект осуществляли с помощью программы "Origin 6.0" (Microcal Software, Inc., CIIIA) в полулогарифмическом масштабе, принимая количество выросших колоний в контроле в каждой из популяций за 1. На линейном участке дозовых зависимостей вычисляли величину Do с помощью указанной программы. 2.4.2 Анализ клеточного цикла в отсортированных популяциях
Сортировку клеток SP и NSP выполняли до радиационного воздействия или обработки противоопухолевыми химиопрепаратами. Для сортировки клеток указанных популяций использовали культуры линий В16 и MCF-7 в логарифмической стадии роста. С каждой из изучаемых линий клеток проведено не менее 3-х независимых экспериментов.
К отсортированным образцам (количество клеток в каждом не менее 5x10 ) приливали холодный (+4 С) 0,01 М фосфатный буферный раствор с добавлением 0,9 % NaCl, рН 7,2 (phosphate buffered saline - PBS), доводя концентрацию клеток до (1-2)х10 кл/мл. Затем медленно, при постоянном помешивании, в полученную суспензию клеток вливали холодный 96 % этанол в объёмном соотношении 2:1 (этанол : суспензия клеток в PBS). Зафиксированные клетки хранили при +4 С и анализировали в течение 2 мес.
Фиксированные клетки собирали центрифугированием при 200g в течение 15 мин. К осадку добавляли 150 мкл окрашивающего раствора (PBS с добавлением PI до конечной концентрации 0,1 мг/мл, 0,1 % Тритона-ХЮО и 3,9 % ЭДТА) и 150 мкл раствора РНКазы (2 мг/мл, Gibco, США) в PBS в соотношении 1:1. Получившуюся смесь инкубировали в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего фильтровали через 40-мкм нейлоновый фильтр и немедленно анализировали.
Для анализа окрашенных образцов использовали проточный цитофлуориметр FACS Calibur (BDIS, США), с помощью которого определяли интенсивность прямого и бокового светорассеяния клеток, а также характеризовали флуоресценцию PI по критериям продолжительности (ширины) сигнала и интегральной интенсивности (зоны) сигнала, отражающей содержание ДНК. Для возбуждения флуоресценции PI использовали лазер с длиной волны 488 нм, для регистрации флуоресценции - стандартный фильтр, входящий в базовую комплектацию (585±42нм). Данные записывали в файл, для обработки которого использовали стандартный алгоритм, рекомендованный производителем прибора для выявления клеток в разных фазах клеточного цикла. С помощью программы ModFit 3.1 (BDIS, США) выделяли регион клеток по интенсивности прямого и бокового светорассеяния, затем из анализа исключали дебрис и конгломераты клеток по критерию продолжительности сигнала флуоресценции. Далее строили гистограммы распределения выделенных одиночных клеток по интегральной интенсивности флуоресценции PI и определяли распределение клеток по фазам клеточного цикла.
Определение внутриклеточного содержания оксида азота в изучаемых популяциях опухолевых клеток Внутриклеточное содержание N0 исследовали в клетках SP и NSP изучаемых линий до радиационного или химического воздействий.
Для определения внутриклеточного содержания N0 использован метод, предложенный в 1998 г. Kojima и соавторами [107]. Метод основан на применении 4,5-диаминофлуоресцеин-2-диацетата (ДАФ-ДА), легко проникающего через плазматическую мембрану, а затем подвергающегося в клетке воздействию эстераз. Продукт этой реакции теряет способность проникать через плазмалемму, поэтому остается в клетке и взаимодействует с N0. В результате этой реакции в присутствии кислорода образуется диаминофлуоресцеин-триазол (ДАФ-ТР), который обладает флуоресценцией с высоким квантовым выходом в диапазоне 500-520 нм при возбуждении светом с длиной волны 488 нм. С помощью проточной цитометрии в указанном диапазоне длин волн измеряют интенсивность флуоресценции каждой клетки, которая пропорциональна содержанию N0 при концентрации последнего более 2-5 нмоль/л [144].
Клетки снимали с подложки, считали их концентрацию в камере Горяева и готовили аликвоты по 5x10 клеток. Затем образцы центрифугировали 5 мин при 200g, к осадку добавляли 0,5 мл среды DMEM без сыворотки, 1 мкл ДАФ-ДА (5 мМ в DMSO, Sigma-Aldrich, США) и краситель Но342 в конечной концентрации 5 мкг/мл. Для контроля флуоресценции ДАФ-ТР к части клеток добавляли нитропруссид натрия, являющийся донором N0, в конечной концентрации 10 мМ. К части проб за 15 мин до внесения ДАФ-ДА и Но342 добавляли верапамил до конечной концентрации 25,0 или 12,5 мкг/мл для контроля определения SP в культурах В 16 и MCF-7, соответственно. Все указанные препараты инкубировали с клетками в течение 60 мин при 37 С и периодическом перемешивании. Для исключения из анализа мертвых и погибающих клеток добавляли PI в конечной концентрации 2 мкг/мл. Каждый образец фильтровали с помощью нейлонового фильтра с диаметром пор 40 мкм. Клетки хранили при температуре +4 С не более 30 мин и анализировали с помощью проточного цитофлуориметра FACS Vantage. Флуоресценцию Но342 измеряли в красной (675 ± 20 нм) и синей (424 ±20 нм) областях спектра, возбуждая светом 364 нм, как описано ранее. Флуоресценцию ДАФ-ТР регистрировали при длине волны 525 ± 30 нм, возбуждая лазером с длиной волны 488 нм. В каждой пробе анализировали не менее 200 тыс. клеток. Полученные данные обрабатывали с помощью программы CellQuestPro: выделяли регионы клеток SP и NSP, как описано выше, и анализировали интенсивность флуоресценции ДАФ-ТР, по которой судили о внутриклеточном содержании NO в выделенных клетках.
Молекулярно-клеточные механизмы резистентности SP и других популяций, экспрессирующих маркеры опухолевых стволовых клеток, к действию редкоионизирующего излучения
Результаты определения доли клеток SP в интактных культурах линий В16 и MCF-7 подтверждают данные литературы [49, 191]. При этом следует отметить довольно сильное расхождение данных разных авторов по поводу размера этой популяции в интактной культуре линии MCF-7. Так, например, в работе Tanaka и соавторов [191] доля клеток SP составляла в среднем 1,8 %, как и в нашем исследовании, в работе Gong и соавторов - 0,1 % [65], в работе Achuthan и соавторов - около 1 % [9], в работе Zhang и соавторов - 3,6 % [245]. Вероятные причины столь высокой вариабельности данных разных авторов по этому вопросу могут быть связаны как с особенностями культивирования этих клеток в разных лабораториях или использованием разных подлиний этой культуры, так и с отсутствием стандартизированного протокола идентификации SP. В частности, Цынкаловский и соавторы отмечают высокую чувствительность метода SP к условиям его выполнения [6]. Поскольку выведение Но342 представляет собой динамичный процесс, даже небольшие изменения концентрации клеток или красителя, времени или температуры инкубации клеток могут приводить к изменению формирования SP. Однако соблюдение условий окрашивания, тщательное предварительное тестирование метода на надежной системе и выполнение необходимого контроля (с верапамилом, резерпином или другими ингибиторами АТФ-связывающих транспортеров) помогают стабильно получать воспроизводимые результаты.
На примере линии MCF-7 установлена статистически значимая ассоциация SP с иммунофенотипом ОСК молочной железы (CD44 CD24"). В то же время следует отметить, что только часть клеток SP имела этот иммунофенотип, что свидетельствует о гетерогенности изучаемой популяции по экспрессии поверхностных маркеров. Как известно, в последние годы предпринимались многочисленные попытки выделить популяцию ОСК молочной железы по различным критериям, включая высокую экспрессию CD133, CD29, высокую активность ALDH1, низкую экспрессию ряда микро РНК (miR-200c, miR-200b-200а, miR-183-96-182) и т.д. в дополнение к CD44, CD24 [92, 128]. Полученные авторами результаты указывают на гетерогенность популяции ОСК по экспрессии этих маркеров. Причем эта закономерность была характерна не только для рака молочной железы, но и злокачественных опухолей других локализаций [124, 151]. В отношении иммунофенотипической характеристики клеток SP линии MCF-7 данных значительно меньше, и они согласуются с нашими результатами [9,191,245].
Таким образом, иммунофенотипические маркеры ОСК линии MCF-7 экспрессируются чаще в клетках SP, чем в NSP. Кроме того, по данным литературы о свойствах SP обеих линий, использованных в данной работе, эта популяция обладает высокой туморогенной активностью in vivo, высокой клоногенной активностью in vitro, способностью формировать сфероиды при культивировании в соответствующих условиях, способностью восстанавливать гетерогенность исходной опухоли или клеточной культуры (в отличие от NSP) [49, 158, 226, 232]. В целом, данные литературы свидетельствуют о том, что SP представляет фракцию клеток, обогащенную ОСК, и результаты данной работы подтверждают это положение.
Исследования радиочувствительности SP в большинстве изученных линий опухолевых клеток, включая линию MCF-7 рака молочной железы, указывают на более высокую резистентность этой популяции к действию редкоионизирующего излучения по сравнению с остальными клетками [173, 203, 205, 217, 224]. Следует отметить, что в указанных работах эффект облучения регистрировали в основном по увеличению доли клеток SP в разные и , главным образом, ранние сроки после воздействия, что является лишь косвенным доказательством относительно высокой радиорезистентности этих клеток, поскольку не учитывает изменения их клоногенной способности. В нашей работе получены прямые доказательства относительно высокой резистентности клеток SP к действию у-излучения в классических радиобиологических экспериментах по определению DO в отсортированных популяциях меланомы линии В16. В доступной нам литературе отсутствуют данные о радиочувствительности клеток SP и NSP линии В16, судя по результатам поиска в базе биомедицинских публикаций Pubmed NCBI (США). При этом детальное изучение именно этой культуры опухолевых клеток представляет значительный интерес, поскольку она рекомендована в качестве обязательной модельной системы при проведении доклинических исследований противоопухолевых препаратов [5]. Возможность проспективного выделения радио- и химиорезистентной фракции меланомы В16 методом SP, как впервые установлено в данной диссертационной работе, составляет основу нового подхода к тестированию соединений с предполагаемой противоопухолевой активностью по реакции не только общей опухолевой массы, но и отдельно её резистентной части. Можно ожидать, что это повысит эффективность поиска и разработки новых противоопухолевых препаратов. В отношении линии MCF-7 получены данные о более высокой клоногенной способности SP после у-облучения в дозе 2,0 Гр (по сравнению с клетками NSP), что подтверждает цитированные выше данные литературы.
Показанное нами увеличение относительного количества клеток SP в ранние сроки после действия у-излучения на цельные (не фракционированные) культуры изучаемых линий также свидетельствуют об относительно высокой радиорезистентности этой популяции по сравнению с остальной массой опухолевых клеток, что также подтверждает результаты других авторов. Отдельный интерес представляют данные об увеличении абсолютного количества клеток SP после у-облучения в тех же экспериментальных условиях по сравнению с необлученным контролем. При этом, как и следовало ожидать, наблюдалось многократное уменьшение абсолютного количества клеток NSP. Увеличение абсолютного количества клеток SP через 48-72 ч после у-облучения свидетельствует не только о сохранении жизнеспособности облученных клеток SP, но и, возможном повышении их пролиферативной активности после радиационного воздействия, а также о возможном переходе части сохранившихся клеток NSP в пул SP, например, вследствие эпителиально-мезенхимальной трансзиции (ЭМТ) - процесса, который усиливается под действием ионизирующего излучения и является одним из механизмов поддержания клеток в стволовом состоянии, как показывают результаты последних исследований [28, 43, 146, 185]. Точный вклад этих процессов в зарегистрированное нами увеличение абсолютного количества клеток SP требует дальнейших исследований.
