Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы . . 10
1.1 Ленгмюровские пленки . . . . . . . 10
1.1.1. Получение монослоев амфифильных молекул на границе
раздела фаз вода-воздух . . . . . . 11
1.1.2. Перенос монослоев на твердые подложки и формирование ЛБ-плёнок 15
1.1.3. Полимеризуемые и полимерные ленгмюровские пленки . . 19
1.1.4. Ленгмюровские монослои смесей различных веществ . . 22
1.1.5. Практическое использование ЛБ-плёнок . 23
1.1.6. Другие способы получения моно- и мультислойных пленок . 24
1.2. Основные принципы сканирующей зондовой микроскопии . . 27
1.2.1. Сканирующая туннельная микроскопия . 28
1.2.2. Атомно-силовая микроскопия ... 29
1.2.3. Артефакты зондовой микроскопии и способы их учёта . . 31
1.2.4. Применение АСМ для исследования нуклеиновых кислот . 33
1.3. Липид-нуклеиновые взаимодействия . 34
1.3.1. Комплексы нуклеиновых кислот с фосфолипидами . . 34
1.3.2. Комплексы нуклеиновых кислот с катионными липидами . 37
1.3.3. Комплексы нуклеиновых кислот с анионными липидами . 39
1.3.4. Взаимодействие нуклеиновых кислот с нуклеолипидами . 41
Глава 2. Материалы и методы . 48
Глава 3. Ленгмюровские пленки нуклеолипидов и дииновои кислоты: смешиваемость и фотополимеризация . 53
3.1. Изотермы сжатия индивидуальных веществ . 53
3.2. АСМ исследование монослоев индивидуальных веществ . . 58
3.3. Изотермы сжатия монослоев смесей нуклеолипидов с генейкозодииновой кислотой . 65
3.4. АСМ исследование монослоев смесей
нуклеолипидов с дииновой кислотой . 70
3.5. Выводы по главе 3 ... 72
Глава 4. Изучение взаимодействия ленгмюровских пленок, содержащих нуклеолипиды, с полирибонуклеотидами . 73
4.1. Изотермы сжатия монослоев нуклеолипидов в присутствии полирибонуклеотидов . 73
4.2. АСМ исследование комплексов полирибонуклеотидов с монослоями нуклеолипидов . . . . . . 78
4.3. АСМ исследование комплексов полирибонуклеотидов с монослоями смесей ГДК и ОТ . 84
4.4. Выводы по главе 4 . . . . . . . 91
Глава 5. Комплексы нуклеиновых кислот с монослоями производных стеариновой кислоты . 92
5.1. Комплексы нуклеиновых кислот с монослоями стеариновой кислоты 92
5.2. Комплексы нуклеиновых кислот с монослоями стеаринового спирта 100
5.3. Комплексы нуклеиновых кислот с монослоями октадециламина . 102
5.4. Выводы по главе 5 . . . . . . . 107
Заключение . 108
Результаты и выводы . . . . . . . . 109
Благодарности . . . . . . . . . 110
Литература
- Перенос монослоев на твердые подложки и формирование ЛБ-плёнок
- АСМ исследование монослоев индивидуальных веществ
- АСМ исследование комплексов полирибонуклеотидов с монослоями нуклеолипидов
- Комплексы нуклеиновых кислот с монослоями стеаринового спирта
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Настоящая работа, посвященная комплементарному связыванию нуклеиновых кислот с фотополимеризуемыми ленгмюровскими монослоями амфифильных производных азотистых оснований (нуклеолипидов) и жирных кислот, направлена на изучение и решение актуальных проблем биофизики планарных структур, молекулярной биологии, медицины и прикладных задач: создание биосенсоров и биомимикрических поверхностей, разработку новых методов формирования наноструктур с заданными свойствами.
Интерес со стороны молекулярной биологии и медицины в этой области, в частности, обусловлен тем, что природные и синтетические нуклеиновые кислоты, образовавшие комплекс с амфифильными молекулами, приобретают особые свойства, позволяющие им проходить через клеточные мембраны.
Для формирования ленгмюровских монослоев в данной работе использовали два класса липидов: жирные кислоты и нуклеолипиды. Жирные кислоты широко распространены в живой природе, являются одним из компонентов биомембран, и на долю жирных кислот приходится примерно 20% от общего количества липидов, «жестко» связанных с нативной ДНК. Тем не менее, в большинстве работ, посвященных липид-нуклеиновым взаимодействиям, исследуется взаимодействие нуклеиновых кислот (НК) с цвиттерионными или катионными липидами, а анионные липиды (в т.ч. и жирные кислоты) оказались практически забытыми. Например, имеется много литературных данных о строении комплексов нуклеиновых кислот с октадециламином, но отсутствует информация о комплексах со стеариновой кислотой, отличающейся от октадециламина зарядом гидрофильной части молекулы (октадециламин - производное стеариновой кислоты, в котором карбоксильная группа заменена на аминогруппу).
Второй класс веществ, использовавшийся для формирования ленгмюровских пленок, нуклеолипиды, представляют собой алкил-замещенные производные природных азотистых оснований (аденин, тимин, гуанин,
цитозин). Благодаря остатку жирной кислоты, молекулы нуклеолипидов нерастворимы в воде и могут формировать стабильные монослои. При этом синтез нуклеолипидов проводился таким образом, что группы атомов, отвечающих за образование уотсон-криковских связей между азотистыми основаниями, остаются нетронутыми, вследствие чего нуклеолипиды приобретают присущую азотистым основаниям способность к избирательному связыванию по принципу комплементарности: аденин-тимин (урацил) и гуанин-цитозин. При изучении взаимодействия ДНК с катионными амфифилами (например, с алифатическими аминами или поликатионами) или при работе с тройными комплексами (фосфатидилхолин - 2-х валентный катион - нуклеиновая кислота), исследователь имеет дело, по сути, с взаимодействием заряженных молекул. Нуклеолипиды дают возможность перейти от рассмотрения проблемы на уровне зарядовых взаимодействий к следующему уровню детализации: учесть, что молекула нуклеиновой кислоты представляет собой не просто полимерную «нить», обладающую неким электрическим зарядом, а как «генетическая» молекула характеризуются детерминированной последовательностью азотистых оснований, входящих в её состав. Нуклеолипиды будут связываться, формируя липидное окружение, только с определенными участками молекулы нуклеиновой кислоты, что открывает подходы к созданию новых типов лекарственных средств и способов их доставки.
Нуклеолипиды как молекулярные компоненты, способные к избирательному связыванию, могут быть использованы для конструирования самоорганизующихся супрамолекулярных комплексов (концепция «снизу-вверх» - создание сложных молекулярных комплексов на основе более простых по строению исходных компонентов), что представляет большой интерес с практической точки зрения, например, для создания дешевых и высокоспецифичных биосенсоров. Нуклеолипиды, связывающиеся с комплементарными им азотистым основаниям в цепочке нуклеиновой кислоты, могут формировать «слепок» с добавленных под монослой молекул
нуклеиновых кислот. Для фиксации последовательности нуклеолипидов, заданной молекулой-матрицей, в данной работе используются двухкомпонентные ленгмюровские пленки нуклеолипидов (функциональный компонент) и дииновой кислоты (полимеризуемый амфифил).
Объект исследования: объектом исследования являются
фотополимеризуемые ленгмюровские монослои генейкозодииновой кислоты и амфифильных производных азотистых оснований, а также ленгмюровские монослои производных стеариновой кислоты, различающихся зарядом гидрофильной части молекулы.
Предмет исследования: предметом исследования является комплементарное связывание нуклеиновых кислот с фотополимеризуемыми ленгмюровскими монослоями, содержащими нуклеолипиды, а также липид-нуклеиновые взаимодействия между нуклеиновым кислотами и модельными мембранными структурами, сформированными из жирных кислот.
Целью диссертационной работы является разработка и экспериментальное обоснование методики формирования ультратонких ориентированных полимерных пленок, содержащих нуклеолипиды и фиксирующих их в последовательности, заданной молекулами ДНК.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
Исследовать возможность избирательного связывания нуклеиновых кислот, растворенных в субфазе, с нуклеолипидами, формирующими монослой на границе раздела фаз вода-воздух.
Исследовать возможность встраивания молекул АПАО в фотополимеризующуюся матрицу (представляющую собой ленгмюровский монослой диацетиленовых кислот), т.е. возможность получения истинных растворов смесей нуклеолипидов и дииновой кислоты в ленгмюровских монослоях.
Исследовать закономерности фотополимеризации смешанных монослоев дииновой кислоты и нуклеолипидов; исследовать свойства получаемых при этом полимерных пленок (таких как стабильность структуры и механическая прочность).
Разработать методику переноса ленгмюровских монослоев, содержащих нуклеолипиды, на твердые подложки с сохранением способности нуклеолипидов к избирательному связыванию нуклеиновых кислот.
Изучить морфологию комплексов (методами АСМ) нуклеиновых кислот с ленгмюровскими монослоями нуклеолипидов, жирных кислот и их смесей.
Научная новизна диссертации
1. Реализовано комплементарное связывание полирибонуклеотидов с
искусственными полимеризующимися молекулярными структурами. Показано
избирательное связывание нуклеолипидов, формирующих монослой на границе
раздела фаз вода-воздух с растворенными в воде комплементарными
полинуклеотидами большой длины (1000-3000 оснований).
Разработан способ формирования на твердых подложках стабильных, моделирующих биомембраны молекулярных структур, содержащих нуклеолипиды. Особенностью полученных нами структур является то, что функциональные группы молекул, формирующих внешний по отношению к подложке монослой, обращены наружу и способны взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами.
Впервые обнаружено влияние структуры подложки на ориентацию молекул нуклеиновых кислот, адсорбированных на ленгмюровских монослоях стеариновой кислоты. Молекулы нуклеиновых кислот, перенесенные вместе с монослоем стеариновой кислоты на свежесколотую слюду, формируют домены, внутри которых цепочки нуклеиновых кислот ориентируются параллельно друг другу.
Положения, выносимые на защиту
1. Амфифильные производные азотистых оснований способны
формировать стабильные ленгмюровские монослои на поверхности воды,
избирательно связывающие полирибонуклеиновые кислоты.
2. Амфифильные производные азотистых оснований могут быть встроены
в фотополимеризуемые монослои дииновых кислот и перенесены на твердые
подложки с сохранением своей функциональной активности - способности к
избирательному связыванию с комплементарными азотистыми основаниями.
3. Структура подложки влияет на ориентацию молекул нуклеиновых
кислот, адсорбированных на ленгмюровских монослоях стеариновой кислоты.
Молекулы НК, перенесенные вместе с монослоем стеариновой кислоты на
свежесколотую слюду, формируют домены, внутри которых цепочки
нуклеиновых кислот ориентируются параллельно друг другу.
Достоверность полученных результатов
Достоверность результатов диссертационной работы обеспечивается комплексным использованием широко известных и применяемых экспериментальных методов исследований. Выводы, полученные при использовании различных методов исследования, не противоречат друг другу и согласуются с результатами работ других авторов.
Практическая значимость работы
Реализованное нами специфическое связывание нуклеиновых кислот на искусственных молекулярных структурах, сформированных на основе фотополимеризующихся легмюровских монослоев, содержащих нуклеолипиды, формирует новые подходы к созданию биосенсоров на видоспецифичные фрагменты ДНК. Причем для создания таких биосенсоров ДНК нет необходимости знать последовательности оснований ДНК, а достаточно иметь образец ДНК, который будет использоваться в качестве матрицы для создания «распознающего» элемента биосенсора - монослоя смеси нуклеолипидов с
липидами, формирующими полимеризующуюся сетку, в которой фиксируется относительное расположение молекул нуклеолипидов, заданное молекулами
ДНК.
Обнаруженный эффект формирования упорядоченных структур молекулами нуклеиновых кислот, адсорбированных на монослое стеариновой кислоты (при переносе на твердые подложки), может быть использован при создании биочипов, отличающихся высокой плотностью упаковки и степенью упорядоченности молекул ДНК.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих научных конференциях и школах:
Международный биофизический конгресс - 2005 (15 IUPAB & 51 EBSA International Biophysics congress), Монпелье, Франция.
II Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии "МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА - 2005", Москва, Россия, 2005.
14ая Международная конференция аспирантов и молодых ученых (14th Annual Conference of Doctoral Students "Week of Doctoral Sradents 2005"), Прага, Чехия, 2005.
Международная школа-конференция «Молодые ученые - новой России. Фундаментальнее исследования в области химии и инновационная деятельность», Иваново, Россия, 2005.
III съезд биофизиков России, Воронеж, Россия, 2004.
Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005», «Ломоносов-2004», «Ломоносов-2002», Москва, Россия, 2005, 2004, 2002.
Научная конференция «Ломоносовские чтения 2002», Москва, Россия, 2002.
XVI международная конференция молодых ученых по химии и химической технологии "МКХТ-2002", Москва, Россия, 2002.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, заключения и выводов, списка литературы. Работа изложена на 121 странице, содержит 60 рисунков и 2 таблицы, список литературы содержит 137 библиографических ссылок.
Перенос монослоев на твердые подложки и формирование ЛБ-плёнок
Существует 2 основных способа получения ЛБ-пленок (переноса ленгмюровских плёнок с поверхности субфазы на твердую подложку): метод вертикального лифта метод горизонтального лифта. Метод вертикального лифта
После нанесения ПАВ на поверхность воды и формирования сплошной ленгмюровскои плёнки при заданной величине поверхностного давления п, приступают к последовательному переносу на твердую подложку одного монослоя за другим. Для этого твердая положка медленно опускается и поднимается сквозь поверхность монослоя, рис. 1.3, при этом поверхностное давление монослоя поддерживается постоянным путем сокращения площади плёнки на водной поверхности с помощью подвижного барьера.
Значения я, при которых возможен перенос, обычно лежат в диапазонах, соответствующих фазовым состояниям монослоя "жидкость" - "твердое тело". Давление меняется из-за того, что часть вещества переносится на твердую подложку, соответственно, для оставшихся на поверхности воды молекул, средняя приходящаяся на одну молекулу площадь А увеличивается; в некоторых специальных случаях возможна обратная ситуация - перенос вещества на поверхность субфазы с твердой положки при ее движении сквозь границу раздела фаз. Когда подложка погружается в воду, то искривленная поверхность жидкости в области её контакта с твердой поверхностью набегает на поверхность подложки - образуется «набегающий» контактный угол. В случае гидрофобной подложки, контактный угол при погружении тупой и поверхность воды загибается вниз к твердой поверхности таким образом, что, при нанесении на нее молекул, обращенные «вверх» метальные группы поворачиваются к твердой поверхности. Если набегающий угол острый, то молекулы в монослое будут ориентированы метальными группами в сторону от твердой поверхности, поэтому при погружении подложки в воду монослой наноситься не будет. Таким образом, монослой на пластину при погружении в воду можно нанести только тогда, когда поверхности приданы достаточно высокие гидрофильные свойства, обеспечивающие большой контактный угол. Поэтому и не происходит нанесения монослоя при первом погружении обычной стеклянной пластинки (стеклянные пластинки в качестве подложек использовали и Блоджетт и Ленгмюр [15]), которая смачивается водой (из-за этого Блоджетт в своих опытах получала пленки с нечетным количеством слоев). В настоящее время в качестве подложек часто используют кремний, причем возможна обработка поверхности различными химическими агентами, а также слюду и графит, так как на этих материалах возможно получение атомарно гладких поверхностей. Когда пластина извлекается из воды, точно так же образуется «отступающий» контактный угол. Для смачиваемой подложки отступающий угол будет острым, то есть мениск загибается вверх к подложке. При этом расположенные внизу монослоя полярные группы поворачиваются к твердой поверхности, и молекулы переносятся на твердое тело. Если при подъеме подложки отступающий угол тупой, то монослой переноситься не будет.
В зависимости от ориентации молекул на подложке различают 3 типа ЛБ-пленок. При движении подложки вниз на её гидрофобной поверхности формируется монослой с ориентацией гидрофобных «хвостов» молекул к положки - ЛБ-пленки Х-типа, рис. 1.4. При движении гидрофильной подложки сквозь монослой вверх, молекулы переносимого монослоя ориентируются полярными группами к подложке (Z-типа). В обоих случаях получаются нецентросимметричные ЛБ-пленки. Поочередное прохождение подложки сквозь монослой вниз-вверх приводит к образованию центросимметричного монослоя Y-типа, при этом условие гидрофильности или гидрофобное для каждого последующего монослоя выполняется автоматически.
Монослой переносится на подложку за счет адгезии, при этом в мениске субфазы происходит сложный кристаллизационный процесс, который не позволяет осуществлять нанесение с очень высокой скоростью (при вытаскивании подложки, например, иногда говорят о «выдавливании» молекул воды, находящихся между монослоем и твердой поверхностью). Характерная скорость движения подложки в различных работах составляет от 3 до 10 мм/мин [16-17], наверно лишь такие «классические» вещества как жирные кислоты с не очень длинной углеводородной цепочкой можно удачно переносить со скоростями 5-10 см/мин [18]. В некоторых случаях для удачного переноса используют разные скорости при движении подложки вверх и вниз [17, 19].
Метод горизонтального лифта Монослои могут быть перенесены на твердую подложку также методом Лэнгмюра-Шефера - так называемым методом «горизонтального лифта». Сущность этого метода состоит в том, что подложку опускают на монослой параллельно поверхности последнего, рис. 1.5. Подложка (которая должна обладать гидрофобными свойствами) горизонтально касается монослоя (при этом гидрофобные хвосты «прилипают» к поверхности положки), а затем отрывается. Существуют различные разновидности этого метода, при которых подложку подводят к монослою снизу, или, меняя уровень жидкости в ленгмюровской ванне, опускают монослой на подложку.
АСМ исследование монослоев индивидуальных веществ
При облучении УФ характер получаемой изотермы менялся кардинально. Различие изотерм сжатия при облучении УФ светом и без облучения является доказательством того, что ленгмюровский слой полимеризуется. Так как взаимная ориентация мономеров оказывает большое влияние на полимеризацию, то облучение УВ проводилось на протяжении всего времени сжатия монослоя. При облучении в течении 30 минут монослоя, находящегося в «газовой» фазе (средняя площадь на молекулу «100 А2) и его последующем поджатии уже без воздействия УФ, никаких изменений в изотерме по сравнению со случаем, когда вообще никакого воздействия УФ не было, не наблюдалось. Это доказывает, что при одновременном поджатии и облучении УФ происходит именно полимеризация, а не, например, фоторазложение ГДК. Действительно, фотополимеризация требует сближения полимеризуемых мономеров, так что, если бы при УФ облучении происходила не фотополимеризация, а некий мономолекулярный процесс, например фоторазложение ГДК, то УФ-воздействие уже в «газовой» фазе монослоя сказывалось бы на изотерме, чего в эксперименте не наблюдается. Отметим, что в литературе не удалось найти работ, в которых бы одновременно проводили полимеризацию монослоя и регистрацию его изотермы сжатия. Обычно монослой облучают ультрафилолетом либо при постоянной площади, соответствующей «жидкому» состоянию монослоя, и после этого проводят его сжатие [34], либо, облучая монослой ультрафиолетом, поддерживают постоянным поверхностное давление, регистрируя необходимое для этого изменение площади ленгмюровской пленки [133,134].
Полимеризованные монослои ГДК проявили типичные свойства полимерных монослоев, описанные в литературе [8, 24]: они более стабильны (выдерживали сжатие до большего поверхностного давления 24 мН/м) и более конденсированные (площадь коллапса монослоя сдвинулась с 24 до 17 А2/молекулу).
УФ-облучение монослоев эруциладенина или олеилтимина как до начала движения барьера, так и во время сжатия монослоя не приводило к каким-либо изменениям в изотермах сжатия, что подтверждает (по крайней мере, в условиях проведения данных опытов) 1) фоторезистентность нуклеолипидов, 2) невозможность полимеризации нуклеолипидов между собой по ненасыщенным связям в остатках жирной кислоты, эруковой или олеиновой 3) отсутствие фотополимеризации остатков тимина между собой. 3.2. АСМ исследование монослоев индивидуальных веществ
Атомно силовая микроскопия является универсальным и очень удобным методом изучения морфологии поверхностей практически любой природы, в т.ч. числе и ЛБ-пленок. На рис. 3.4 представлено АСМ изображение свежесколотой слюды - материала, использовавшегося в качестве подложек, на которых формировались пленки исследуемых веществ.
Как выяснилось в ходе экспериментов, монослои нуклеолипидов не переносятся на свежесколотую слюду: коэффициент переноса нуклеолипидов на слюду был менее 0.1 при движении подложки и вверх и вниз, слюда после цикла движения через монослой не меняла своих гидрофильных свойств, образцы при АСМ исследовании выглядели так же как на рис. 3.4. Но оказалось, что монослои, содержащие нуклеолипиды (в т.ч. смеси нуклеолипидов и генейкозодииновой кислоты), переносятся методом вертикального лифта на слюду с предварительно перенесенным на неё по Z-типу («голова» - к подложке, гидрофильный «хвост» - от подложки) монослоем стеариновой кислоты. Аналогичный способ при переносе АПАО (только с использованием бромида диоктадецилдиметиламмония вместо стеариновой кислоты) использовался в [125].
АСМ-изображение (полученное в контактном режиме работы микроскопа) слюды с перенесенным на неё монослоем стеариновой кислоты представлено на рис. 3.5. Как правило, пленки стеариновой кислоты получались очень качественными, с малым количеством каких-либо дефектов («дыр» в монослое), по которым можно судить о толщине пленки. В центре рис. 3.5. хорошо заметен искусственный дефект, полученный путем многократного сканирования (в контактном режиме работы микроскопа) данного участка монослоя. Видимая глубина «поры» 1.2-1.4 нм. Она отличается в меньшую сторону как от теоретически рассчитанной (длина молекулы в развернутой конформации), так и полученной методом малоуглового рентгеновского рассеивания 2.4 нм. Возможная причина такого занижения заключается во взаимодействии иглы атомно-силового микроскопа с поверхностью образца. Игла прижимается к поверхности, искажая геометрию находящегося на ней молекулярного образа, «придавливая его». В дальнейшем это замечание везде подразумевается.
Дополнительным критерием успешного переноса стеариновой кислоты служит факт, что поверхность слюды после макания через монослой стеариновой кислоты приобретала гидрофобные свойства. Специальных измерений контактного угла смачивания не производилось, но капля воды, нанесенная на поверхность "гидрофобизированной" монослоем стеариновой кислоты слюды, не растекалась по её поверхности (как было бы в случае свежесколотой слюды), а сохраняла свою форму.
АСМ исследование комплексов полирибонуклеотидов с монослоями нуклеолипидов
После того, как было обнаружен факт формирования нематически упорядоченных структур нуклеиновыми кислотами, адсорбированными на монослоях стеариновой кислоты при высоких значениях ионной силы субфазы, было решено провести несколько опытов по формированию при тех же условиях ЛБ пленок октадециламина. В литературе вопрос о комплексах нуклеиновых кислот с монослоями катионных амфифилов описан только для случаев низкой ионной силы субфазы (на которой формируется ленгмюровская пленка); нам не удалось найти работ, в которых бы формировали комплексы нуклеиновых кислот с ленгмюровскими пленками октадециламина при высоких ионных силах субфазы.
Вид изотермы сжатия октадециламина на чистой воде совпадает с описанным в литературе [106, 137]. Добавление в субфазу (воду) нуклеиновых кислот приводит к явным изменениям в изотермах сжатия. В присутствии НК поверхностное давление начинает меняться при больших, чем в её отсутствие, значениях площади, приходящейся на одну молекулу ОДА. Это обусловлено взаимодействием между положительно заряженными группами молекул ОДА и отрицательно заряженными нитями полиадениловой кислоты. Связывание с молекулами НК увеличивая эффективную площадь, занимаемую одной молекулой ОДА. Подобный сдвиг вправо я-А изотермы ОДА описан в работах [106, 137]. Данное изменение в изотерме указывает лишь на сам факт связывания молекул НК с монослоем ОДА, не давая никакой информации о структуре этого комплекса.
На рис. 5.11 представлено АСМ изображение монослоя ОДА, перенесенного на слюду с поверхости чистой воды. В отличии от монослоев стеариновой кислоты, монослои стеаринового амина (ОДА) более рыхлые, средняя шероховатость монослоя 0.3 нм, а видимая толщина, судя по глубине пор - 1.2-1.5 нм, что совпадает с видимой толщиной монослоя стеариновой кислоты (длина молекул ОДА и СК практически совпадает).
Результаты АСМ исследований ленгмюровских пленок ОДА, сформированных на растворах полиаденина в чистой воде, рис. 5.12, совпадают с результатами, описанными в работах Г.Б Хомутова для комплексов ОДА с ДНК, сформированных на 1 мМ растворе хлорида натрия. Катионные молекулы ОДА «обвалакивают» противоположно заряженные молекулы нуклеиновых кислот, в результате чего НК адсорбируются на поверхости монослоя в виде глобул.
АСМ изображение ленгмюровских пленок ОДА, перенесенных с раствора поли А (1 мкг/мл) в чистой воде. Нижний рисунок (б) - увеличенный фрагмент верхнего (а). На поверхности выделяются структуры 3 типов: 1. большая часть поверхности представляет собой аморфную шероховатую поверхность на большей части поверхности образца. Высота - 1,1 - 1,5 нм. Средняя шероховатость слоя - 0,3 нм (верхнее сечение на рис. 5.12а). Точно так же выглядят монослои ОДА, перенесенные с чистой воды на слюду. 2. Глобулярные структуры, образующие плоские «островки». Высота относительно монослоя ОДА - 2,5 - 2,9 нм (среднее сечение на рис. 5.12а). Скорее всего молекулы нуклеиновых кислот, связанные с монослоем. 3. Крупные глобулы - высота 5 нм и более (нижнее сечение на рис. 5.12а).
Когда ленгмюровские пленки формировались на субфазах высокой ионной силы (500 мМ NaCl), то вид перенесенных пленок очень сильно отличался от вида пленок, полученных с чистой воды. На рис 5.13 представлено контрольное изображение пленок ОДА, перенесенных с 500 мМ раствора NaCl. Подложка, на которую переносилась ленгмюровская пленка, погружалась через монослой на поверхности раствора один раз. Пленка на поверхности подложки занимает примерно 50% площади, при этом толщина пленки составляет примерно 5 нм. Толщина пленки в 5 нм превышает возможную толщину монослоя, но хорошо согласуется с толщиной бислоя. 400 800 1200 1600 nm
Когда комплексы полинуклеотидов с ленгмюровскими пленками формировались на субфазах высокой ионной силы (500 мМ NaCl), то вид получаемых комплексов менялся кардинально. Вместо глобул (малая концентрация хлорида натрия в субфазе или полное его отсутствие) на АСМ изображении, рис. 5.14, наблюдается «сеть» из нитей различной ширины (от 20 до 40 мн) и высоты (2-5 нм). Отчетливо видны «толстые» и «тонкие» нити, как будто они переплетаются между собой. «Тонкие» нити - толщиной 20-25 нм, высотой - 2 нм, «толстые» в ширину 35-40 ни, высотой 5 нм (иногда до 7 нм).
В литературе не удалось обнаружить каких-либо сведений о комплексообразовании между ОДА и нуклеиновыми кислотами при высоких значениях ионных силы, однако похожие «сетки» были обнаружены в работе [107] для комплексов НК с катионными полимерами, сформированными на растворах низкой ионной силы (1 мМ NaCl). Значительные размеры «толстых» нитей, наблюдаемых на рис. 5.12, можно объяснить тем, что мы наблюдаем нити нуклеиновых кислот, «облепленные» слоем аминов.
Комплексы нуклеиновых кислот с монослоями стеаринового спирта
В опытах с монослоями смесей нуклеолипидов и дииновой кислоты обнаружено, что пленки генейкозодииновой кислоты связывают нуклеиновые кислоты из субфазы с высокой ионной силой. Поскольку такое «паразитное» связывание является препятствием к реализации предложенного нами подхода к созданию биосенсоров нуклеиновых кислот, то был проведен ряд опытов, направленный на более глубокое изучении этого явления.. Для этих экспериментов в качестве ПАВ был выбран гомологический ряд производных стеариновой кислоты (стеариновая кислота, октадеканол, октадециламин) ввиду их распространенности и хорошей изученности.
Вид изотерм сжатия стеариновой кислоты на чистой воде и на растворах соли отличаются только формой коллапса; наличие полиаденина не сказывается на форме изотерм. Добавление полиаденина в субфазу под монослой стеариновой кислоты не изменяет среднюю площадь, приходящуюся на одну молекулу в точке коллапса монослоя, что говорит о том, что молекулы полиаденина, если и адсорбируются на монослой, но не встраиваются между молекулами монослоя, и не образуют стабильных при поджатии монослоя комплексов с молекулами СК. Фазовые состояния монослоя СК также не изменяются при добавлении полиаденина под монослой, что вытекает из совпадения положения точек перегиба на изотермах сжатия.
Для АСМ исследований комплексов нуклеиновых кислот с монослоями стеариновый кислоты ленгмюровские пленки переносились при поверхностном давлении 18 мН/м. Скорость движения подложки при этом задавали равной 2 мм/мин. При больших скоростях движения подложки на её поверхности после переноса в большом количестве обнаруживались кристаллы NaCl, сильно затруднявшие исследование образцов.
Результаты АСМ исследования монослоев стеариновой кислоты, перенесенных на свежесколотую слюду с субфазы, содержащей полиадениловую кислоту (1 мкг/мл), представлены на рис. 5.2. Если в субфазу с растворенным в ней полиА добавлялся NaCl в концентрации 1 мМ (или же не добавлялся вообще), то полученный монослой ничем не отличался от монослоя, перенесенного с чистой воды. Поверхность образца была однородной, гладкой, практически без дефектов. Однако тот факт, что подложка из гидрофильной слюды после прохождения через монослой становилась гидрофобной, служил надежным подтверждением успешного переноса ленгмюровской пленки.
При увеличении концентрации одновалентных ионов (10 мМ раствор NaCl, но, по прежнему, без специально добавленных солей 2-х валентных металлов) на поверхности образцов начинают обнаруживаться одиночные молекулы нуклеиновых кислот, рис. 5.2а. При концентрации хлорида натрия в 100 мМ, рис. 5.26, молекулы нуклеиновых кислот уже стремятся образовывать некие агрегаты на поверхности образца, но такие «скопления» расположены по поверхности образца хаотичным образом.
При концентрации NaCl в субфазе 500 или 1000 мМ на поверхности образца в больших количествах обнаруживаются молекулы нуклеиновых кислот, при этом поверхность образца (каждый образец исследовался не менее чем в Зх различных точках) однородна, т.е. схожие картины получались при сканировании различных участков образцов. Молекулы полиаденина находятся по подложке в вытянутом состоянии, и образуют на поверхности домены с поперечными размерами несколько сотен нанометров (т.е. размерами близкими к длине молекул использовавшихся НК), внутри одного домена нити НК расположены параллельно друг другу. б)
При увеличении в субфазе концентрации двухвалентных ионов (при постоянной концентрации одновалентных) количество нуклеиновой кислоты, связанной с монослоем увеличивается, сравнить рис. 5.2в и рис. 5.3. Добавление 10"5 М ионов Mg не приводит к заметному росту количества НК, связанной с монослоем, а вот уже при наличии в субфазе 10"4 М ионов Mg с монослоем связывается гораздо большее количество полиадениловой кислоты, при этом молекулы полиаденина лежат на поверхности не в один, а в 2 слоя. Отметим, что согласно спецификации использовавшегося хлорида натрия, суммарное количество примесей щелочноземельных и тяжелых металлов не более 5 мг на килограмм хлорида натрия (что дает примерно 10"5 М двух или более валентных примесей катионов в 1М растворе хлорида натрия, т.е. содержание двухвалентных примесей не более 0.001%). При постоянной концентрации в субфазе 2-х валентных ионов (1 мМ MgC ) и варьировании концентрации хлорида натрия, рис. 5.4, было выявлены следующие закономерности: при концентрации хлорида натрия 0-100 нм количество НК, связанных с монослоем не зависит от концентрации NaCl, при увеличениии концентрации NaCl со 100 до 500 нм количество НК, связанных с монослоем резко увеличивает, но никаких нематически подобных структур, как это было в отсутствие ионов Mg при тех же концентрациях хлорида натрия, не обнаруживается.
