Введение к работе
Актуальность проблемы.
В плазматических и внутриклеточных мембранах клеток животных и растений имеется широкий набор различных ионных каналов, которые обеспечивают пассивный транспорт неорганических ионов. Кальций - активируемые хлорные каналы являются одними из основных компонент системы, участвующих в процессах функционирования эпителиальной секреции, сенсорной транедук-ции, регулирования нейронной и сердечной возбудимости, регулирования сосудистого тона клеток животных. В клетках растений кальций - активируемые хлорные каналы ответственны, по крайней мере, за состояние тургора клетки, однако полное функциональное назначение этих каналов в жизнедеятельности растений до сих пор не ясно. Известно, что ионные каналы клеток растений и клеток животных по своим основным свойствам и характеристикам во многом похожи (Hedrich R., & JerominA. 1992) Поэтому выяснение механизмов работы Са2+- зависимых хлорных каналов растительных клеток и точное описание режимов их функционирования является одной из фундаментальных проблем электрофизиологии.
Актуальность выбранной темы обусловлена тем, что недостаточно исследованы функциональные свойства и режимы работы хлорных каналов плазма-леммы клеток растений. Одна из основных трудностей состоит в том, что растительная клетка имеет две электровозбудимые мембраны - плазмалемму и то-нопласт, каждая из которых дает свой вклад в регистрируемый интегральный ток, что затрудняет интерпретацию экспериментальных данных.
Практическая актуальность темы обусловлена тем, что первой мишенью при воздействии внешних факторов (лекарственные препараты, токсины, химические вещества, физические агенты) является клеточная мембрана и её ионные каналы. Поэтому изменения в клеточной мембране и режиме работы ионных каналов, вызванные этими факторами, приводят к изменению функционального состояния клетки. Исследования влияния внешних факторов на изменения функционирования ион - транспортирующих систем экспериментально достаточно просто и удобно проводить на клетках харовых водорослей. Геометрия и гигантские размеры клеток позволяют проводить оригинальные исследования мембранотропных эффектов различных веществ. Поэтому, можно организовать на этих клетках легкий и обширный скрининг для тестирования и отбора различных лекарственных и биологически активных веществ.
2 Цель и задачи исследования.
Для изучения свойств и роли Са~ -зависимых хлорных каналов плазматической мембраны клеток харовых водорослей на уровне целой и перфузируемой изнутри клетки с удаленным тонопласгом поставлены следующие задачи:
-
Выяснить природу процесса активации и инактивации хлорных каналов плазмалеммы клеток харовых водорослей. Найти экспериментальные доказательства того, что хлорные каналы непосредственно активируются ионами Са2+, и определить параметры переходного тока, вызываемого увеличением концентрации Са2+ в клетке
-
Исследовать процесс инактивации хлорных каналов - привести доказательст-
ва, что этот процесс стимулируется Са +, и он необратим.
-
Исследовать функциональную зависимость хлорного тока плазматической мембраны от внутриклеточной концентрации Са2+ и рН раствора.
-
Определить ионную специфичность (ряда двухвалентных катионов) системы
активации хлорного канала и их влияние на процесс необратимой инактивации каналов.
5. Изучить влияние ряда ингибиторов и активаторов хлорного тока на Са2^ - за
висимые хлорные каналы, находящиеся в разных режимах работы.
Научная новизна.
Впервые установлено, что CI -каналы плазмалеммы активируются за счет увеличения концентрации ионов Са в цитоплазме, а не напряжением, как считалось ранее. Получены интегральные характеристики СГ канала плазмалеммы такие, как зависимость амплитуды тока от концентрации ионов свободного Са2+ в цитоплазме клетки и значением рН внутриклеточной среды. Показано, что ионы Са" , активирующие хлорные каналы плазмалеммы, являются причиной их необратимой инактивации. Впервые показано, что ряд нетитрируемых аналогов местных анестетиков, амфифильные катионы, такие как: QX314, QX222, G88 и целый ряд других (конкурентов Са2+) способны задерживать наступление необратимой инактивации хлорных каналов и в зависимости от соотношения концентрации амфифильного катиона и ионов Са2+ выводить каналы из состояния необратимой инактивации. Показано, что клетки харовых водорослей можно использовать в качестве тест объекта - мониторинга существующих и скрининга потенциально новых лекарственных препаратов. Показано, что такие известные диуретики, как фуросемид и этакриновая кислота способны эффективно блокировать хлорный канал, находящийся в открытом состоянии, как изнут-
ри клетки, так и снаружи. Установлено, что некоторые представители семейства авермектинов (используемые для борьбы с паразитами животных и растений) являются эффективными ингибиторами хлорных каналов не только клеток животных, но и водорослей, и возможно высших растений. Результаты работы расширяют существующее представление о механизмах регуляции ионной проницаемостью биологических мембран растительных и животных клеток
Практическая значимость работы.
На основе клеток харовыч водорослей разработана новая система скрининга лекарственных и биологически активных веществ, влияющих на ионную проницаемость биологических мембран. Эта система позволяет проводить первичный отбор лекарственных веществ и регистрировать их мембранотропные эффекты. Она дает возможность облегчить трудоемкий и дорогостоящий скрининг этих веществ на клетках животных.
Апробация работы.
Основные результаты данного исследования были доложены на Всесоюзном симпозиуме "Одиночный ионный канал в биологических мембранах" (Пущине, 1986г.). На симпозиуме по биофизике в Югославии (Сараево, 1988г.). На 10-ом Биофизическом конгрессе (Ванкувер, Канада, 1990г.). На международной конференции "Biophysics of membrane processes", (Опатия, Ююславия, 1990г.). На конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, 2002г.). На конференции «Проблемы биологической и медицинской физики» (Украина, Киев, 2004г.). На международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2005г.).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, включая 7 статей в рецензируемых журналах, 2 в сборниках и 1 авторское свидетельство, зарегистрированное в Государственном реестре изобретений.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения собственных экспериментальных результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 117 стр., содержит 34 рисунка. Список цитированной литературы содержит 233 ссылки.
