Содержание к диссертации
Стр.
I. ВВЕДЕНИЕ 5
П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
Загрязнение экосистем фенольными соединениями и их взаимодействие с водорослями 9
Проблемы биотестирования и мониторинга фенольного загрязнения пресных вод 12
Электрические свойства клеток как способ оценки функционального состояния водорослей 16
Изученность вопросов оценки функционального состояния водорослей по их электрическим свойствам 29
Влияние фенольных соединений на фотосинтетическую активность зеленых водорослей 35
Цель и задачи исследования 40
III. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 41
Объект исследования 41
Методы исследования 41
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 44
4.1. Разработка метода определения электрических свойств клеток
культуры водоросли С. pyrenoidosa в широком диапазоне
частот 44
Выбор фазы развития культуры для использования водоросли в качестве тест-объекта 44
Частотная зависимость электрических параметров клеток и коэффициент поляризации 48
Импедансная диаграмма в комплексной плоскости 51
4.2. Электрические свойства клеток водоросли С. pyrenoidosa при
действии ингибиторов метаболизма 60
Электрические свойства клеток водоросли при действии 2,4-динитрофенола 60
Электрические свойства клеток водоросли при действии
диурона 62
4.3. Электрические свойства клеток водоросли С. pyrenoidosa при
действии пентахлорфенола 72
Частотная зависимость электрических параметров клеток водоросли и коэффициент поляризации в присутствии пентахлорфенола 72
Комплексная импедансная диаграмма суспензии клеток водоросли при действии пентахлорфенола 76
4.4. Влияние действия пентахлорфенола на фотосинтетическую
активность водоросли С. pyrenoidosa по характеристикам
флуоресценции 79
V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 87
VI. ВЫВОДЫ 93
VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 95
Введение к работе
В ближайшем будущем пресная вода станет не менее значимым лимитирующим развитие человечества фактором, чем энергетические ресурсы планеты. Сохранение или улучшения качества воды в естественных и искусственных водоемах при современном уровне антропогенного загрязнения водных экосистем крайне актуально для Российской Федерации, богатейшей в мире по запасам пресной воды (Рыбальский, 1993; Ваганов и др., 2002). Глобальное загрязнение особенно опасно для пресных вод, поскольку они составляют около 3% от общих запасов воды на планете и являются наиболее пригодными для использования в промышленных и бытовых целях (Израэль и др., 1991; Кожова, Бейм, 1993; Галазий и др., 1995).
Загрязнение пресных вод промышленными стоками, содержащие в зависимости от используемых технологий различные фенольные соединения (Ф), такие как фенол, бутилфенол, дифенилпропан, хлор- и нитрофенолы, а также и пестициды с фенольными ядрами, нитрофенолы, является наиболее распространенным (Pentachlorophenol, 1987; Корте и др., 1997; Фёдоров, Яблоков, 1999). Некоторые из хлорфенольных соединений, например, пентахлорфенол (ПХФ) обладают ярко выраженным бактерицидным, фунгицидным, гербицидным и альгицидным действием. Эти свойства определяет область практического применения ПХФ для защиты изделий из дерева, консервирования кожи и текстиля, средства борьбы с термитами, пестицида и дефолианта, а в качестве гербицида ПХФ до начала 1970-х г.г. использовался на рисовых полях в Японии (Pentachlorophenol, 1987; Корте и др., 1997). Следует также учитывать образование ряда хлорированных соединений, а также и ПХФ при широко
распространенном хлорировании питьевой воды и промышленных стоков на очистных сооружениях (Стом и др., 1990; Strobel, Deiter, 1990; Руководство... 1994).
В целях защиты поверхностных вод от отрицательного загрязнения необходима регламентация их состава и количества. Для этого используют приемы экспериментальной токсикометрии: подбор соответствующих тест-объектов и тест-функций оценки опасности вод, по данным которых разрабатываются и обосновываются величины предельно-допустимых концентраций (ПДК) (Рыбальский и др., 1993; Aunaas, Zachariassen, 1994; Булгаков, 2002).
Фотосинтез - основной процесс новообразования органического вещества в водоемах за счет энергии НАДФН и АТФ. Активность фотосистемы 2 (ФС 2) определяет первичную продукцию водорослей (Oquist et al., 1982; Baker et al., 1989; Маторин, Венедиктов, 1990; Krall, Gerald, 1992; Маторин, 1993). Известно, что проницаемость клеток растений находится в тесной связи с энергообеспеченностью клетки, а АТФ является посредником между фотосинтетическими реакциями и транспортными процессами в мембранной системы (Spanswick, 1972; Альварес и др., 1982).
Взаимодействие Ф как и гербицидов с клетками находятся в зависимости от процессов поглощения, связанных со спецификой проницаемости внешних мембран и отражаются в изменениях функциональных реакций водорослей, на чем и основано использование этих показателей состояния микроводорослей, в частности хлорококковых, для целей биологического мониторинга. Микроводоросли могут служить биомаркерами (или биоиндикаторами) при острых или долговременных
токсических воздействий (Repetto et al., 2001; Булгаков, 2002; Podola et al., 2004).
Вопросы влияния Ф или ФС 2 - гербицидов на водоросли - основу функционирования водных экосистем - исследованы недостаточно, что относится и к высокотоксичному ПХФ - компоненту стоков и пестициду. Работы проводили в основном с фенолом, не учитывая активности промежуточных продуктов окисления Ф, ФС 2 - гербицидов и рассматривали, как правило, их влияние на рост численности клеток и фотосинтез. Недостаточно изучены начальные процессы взаимодействия химического загрязнителя с клетками водорослей, в частности с внешним мембранным комплексом. В целях биотестирования применяется оценка функционирования клеточных мембран с помощью микроэлектродных методов (Юрин и др., 1979; Воробьёв, Мусаев, 1979; Воробьёв, 1980; Плеханов, Максимова 1997; Плеханов, 1999). Однако, крайне трудно выбрать те функциональные реакции водорослей, которые бы объективно и специфически отражали влияние Ф на водоросли, позволяли использовать их для токсикометрии Ф и совершенствования нормативных величин ПДК.
В настоящее время наблюдается стремление к использованию высокочувствительных откликов биосистем на клеточном и субклеточном уровнях вплоть до специфических мембранных структур и отдельных биохимических реакций (Aunaas, Zachariassen, 1994; Степанова и др., 1998). Это связано с ростом требований к нормированию содержания загрязняющих веществ в биологических объектах, а также с необходимостью определения механизмов их токсического действия (Юрин, 2002; Yen et al., 2002; Huang et al., 2003).
В числе наиболее перспективных методов исследования следует отметить пока слабо изученное поведение клеток водорослей при
прохождении через них переменного электрического тока в зависимости от его частоты, которое сводится к регистрации и анализу их электрических свойств в широком диапазоне частот. Электрические свойства в общем случае определяются двумя основными параметрами клеток сопротивлением R (проводимостью с) и ёмкостью С (диэлектрической проницаемостью є), величины, которых зависят от частоты электрического поля и состояния внешних мембран (Шван, 1963; Pethig, Kell, 1987; Келл, 1992; Markx, Davey, 1999; Grimnes, Martinsen, 2000). В отличие от микроэлектродных методов, измерение электрических параметров не повреждает клетки, в связи с чем, позволяет изучать клетки без нарушения их основных функций. Зависимость электрических свойств от частоты позволяет путем выбора соответствующих диапазонов измерений и исследуемых параметров провести детальный анализ функциональных характеристик клеток водорослей.
В настоящей работе представлены результаты разработки метода измерения электрических свойств и поиска тех чувствительных функциональных параметров зеленых водорослей, которые связаны с жизнеспособностью и состоянием главного барьера проницаемости клеток, при действии Ф, в частности ПХФ. Исследование направлено на объективную оценку физиологических эффектов и последствий влияния ПХФ на водоросли в целях совершенствования методов биотестирования и биологического мониторинга водных экосистем.
