Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 5
2.1. Классификация и свойства флокулянтов 5
2.2. Физико-химические свойства гуанидинов 7
2.3. Биоцидные свойства ПГМГ и его производных 11
2.4. Биоцидные свойства ПГМГ-гидрохлорида и ПГМГ-фосфата 17
2.5. Диэлектрические свойства биологических объектов (общие положения) 23
2.6. Электроспектроскопия 31
2.7. Изучение функционального состояния клеток водорослей по флуоресценции хлорофилла 34
3. Объекты и методы исследования 42
3.1. Объект исследования 42
3.2. Методы исследования 42
4. Результаты и обсуждение 48
4.1. Первичное изучение взаимодействия клеток водоросли Chlorella pyrenoidosa и ПГМГ-препаратов 48
4.1.1. Изменения кривой роста культуры Chlorella pyrenoidosa при действии ПГМГ-фосфата и ПГМГ-гидрохлорида 48
4.1.2. Деградация ПГМГ-фосфата и ПГМГ-гидрохлорида в присутствии водоросли 50
4.2. Особенности электроспектроскопии водоросли Chlorella pyrenoidosa 51
4.2.1. Электриские свойства клеток водоросли Chlorella pyrenoidosa 51
4.2.2. Изучение диэлектрических характеристик микроводоросли Chlorella pyrenoidosa S-39 в процессе развития культуры 56
4.2.3. Использование импедансных диаграмм для анализа состояния клеток культуры Chlorella pyrenoidosa S-39 при действии высокотоксичных веществ 67
4.2.4. Влияние полигексаметиленгуанидинов (ПГМГ-фосфата и ПГМГ-гидрохлорида) на функциональное состояние клеток Chlorella по диэлектрическим параметрам 72
4.2.5. Измерения электрических свойств клеток Chlorella на фиксированной частоте в низкочастотной области (для практических целей) 81
4.3. Влияние ПГМГ на фотосинтетические характеристики культуры водоросли Chlorella pyrenoidosa 87
5. Заключение 97
6. Основные выводы 102
7. Список литературы 105
- Физико-химические свойства гуанидинов
- Особенности электроспектроскопии водоросли Chlorella pyrenoidosa
- Использование импедансных диаграмм для анализа состояния клеток культуры Chlorella pyrenoidosa S-39 при действии высокотоксичных веществ
- Измерения электрических свойств клеток Chlorella на фиксированной частоте в низкочастотной области (для практических целей)
Введение к работе
Рост антропогенных загрязнений в окружающей среде может прямо или косвенно сопровождаться либо адаптацией экологических систем к новым условиям существования, либо их деградацией.
Своевременное обнаружение деградации водных экосистем, обусловленной воздействием антропогенных факторов, а также химический и биологический мониторинг, возможно, позволит своевременно предсказать и избежать как первичных нарушений в трансформации вещества и энергии, так и отдаленные последствия действия загрязнений.
В настоящее время создается и производится много флокулянтов. Наиболее распространенными являются полиакриламиды. К другому классу относятся соединения группы гуанидинов. Наши знания о влиянии этих веществ на водоемы ограничены. Гуанидины и их производные, в частности полигексаметиленгуанидины (ПГМГ), разрешены для использования Минздравом РФ в качестве дезинфицирующих средств в быту, медицинских, фармацевтических, пищевых, сельскохозяйственных и кожевенных учреждениях, при чрезвычайных ситуациях, а также в качестве дезинфицирующих добавок в питьевую воду вместо хлора. Как правило, ПГМГ используются в качестве водорастворимых солей - ПГМГ-гидрохлорида (ПГМГ-хлорида) и ПГМГ-фосфата и композиционным составам, включающим ПГМГ в качестве действующего вещества (Кузнецов, 2002).
В настоящее время освоен промышленный выпуск ПГМГ и его производных (Федорова, 2004; Кошелева, 2005; Гембицкий, 1998; Скворцова, 1975; Дез средства, Справочник 1998; гигиенический
сертификат №19.ФЦ.03.940.П254781Д7 от 27.06.97; Усатенко, Суржик, 1999). Гуанидины обладают высокой физиологической активностью (фунгицидной, бактерицидной, гербицидной) (Кузнецов, 2002). Такой широкий спектр свойств гуанидинов и доступность их в настоящее время, в связи с возможностями отечественного производства, обуславливает интерес к ним, как к возможному фактору загрязнения окружающей среды, в частности водной.
Токсичность ПГМГ-гидрохлорида не привлекает должного внимания ввиду отсутствия ее для теплокровных животных, а также отсутствия цвета и запаха, (санитарно-эпидемиологическое заключение № 77.01.03.249. П.07289.03.1 от 13.03.01; , 2004; Хашироеа, 2002), нелетучести, хорошей растворимости в воде, устойчивости при хранении. К тому же, ПГМГ не вызывают аллергию у людей, обесцвечивание тканей и коррозию оборудования (Данилина, 1993).
При борьбе с патогенной микрофлорой, ПГМГ одновременно подавляет микрофлору экосистем. Уже в небольших концентрациях ПГМГ может быть опсен для микроорганизмов, в частности для микроводорослей. Водоросли являются первым звеном трофической цепи водных экосистем, основным источником вновь синтезированного органического вещества. (Усатенко, Суржик, 1999) К тому же, планктонные водоросли, в частности хлорококковые, играют большую роль в биологической очистке стоков (Афанасьева, Телитченко, 1980; Костяев, 1972).
Биоцидные свойства ПГМГ и расширяющиеся масштабы его использования заставляют оценивать возможные последствия его попадания в стоки и, следовательно, в водоемы. Возможные пути действия ПГМГ на бактерии рассматриваются как физико-химический процесс
адсорбции на поверхности клеток, диффузии через мембрану и нарушение проницаемости (Кузнецов, 1990).
В литературе достаточно широко представлены результаты влияния ПТМГ на гидробионтов, в частности, рыб, рачков, простейших, а также бактерий, вирусов (Баркова, 1991; Гембщкий, 1998; Пантелеева, 1999; Скворърва, 1975; Ефимов, Гембщкий, 2000; Кузнецов, 1990; Воинцева, Поликарпов, 2006) При этом, исследования воздействия полигексаметиленгуанидинов на развитие и функциональное состояние водорослей практически отсутствуют.
Перспективным направлением изучения функционального состояния одноклеточных водорослей является поведение клеток при прохождении через нее переменного электрического тока в зависимости от его частоты. При этом регистрируются и анализируются диэлектрические свойства в широком диапазоне частот. В общем случае диэлектрические свойства определяются двумя основными параметрами клеток - сопротивлением R (проводимостью а), и емкостью С (диэлектрической проницаемостью є), величины которых зависят от частоты электрического поля и состояния внешних мембран (Шван, 1963; Grimmes, Martinsen, 2005; Pethig, Kell, 1987). В отличие от микроэлектроднх методов, измерение электрических параметров не повреждает клетки, что позволяет изучать целые клетки без нарушения их структуры. Зависимость электрических свойств от частоты позволяет путем выбора соответствующих диапазонов измерений и исследуемых параметров провести детальный анализ функциональных характеристик клеток водорослей и их внешних мембран.
В связи с этим, в настоящей работе представлены результаты изучения электрических свойств одноклеточной водоросли Chlorella pyrenoidosa при воздействии на нее ПГМГ-гидрохлорида и ПГМГ-фосфата.
Исследование направлено на объективную оценку функционального состояния клеток и последствий действия ПГМГ-гидрохлорида и ПГМГ-фосфата на главный барьер проницаемости и определения возможных механизмов воздействия на водоросли, которые являются основой функционирования водных экосистем. Проницаемость клеток растений связана с энергообеспечением клетки, а АТФ является связующим звеном между фотосинтетическими реакциями и транспортными процессами в мембранной системе (Альварес, 1982; Spanswick, 1972). В работе представлены также результаты воздействий ПГМГ-гидрохлорида и ПГМГ-фосфата на фотосинтетические характеристики водоросли Chlorella pyrenoidosa, в частности, на активность фотосистемы II (ФС II), которая в значительной степени определяет первичную продукцию (Baker et al, 1989; Oquistetal, 1982; Krall, Gerald, 1992; Маторин, 1993).
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Физико-химические свойства гуанидинов
Гуанидиновые соединения широко распространены в природе. Гуанидиновая группировка служит активным началом многих лекарственных веществ (сульгин, исмелин, фарингосепт и антибиотиков -стрептомицин, бластицидин, мильдомицин). Биоцидный эффект гуанидиновых соединений физиологичен и в живом организме имеются ферментные системы, способные вызывать деградацию этих соединений. Мономеры и полимеры гуанидинов из-за присутствия функциональных групп способны к различным модификациям (Кузнецов, 2002; Хаширова, 2002; Кошелева, 2005). Благодаря полимерной природе, они обладают катионными поверхностно-активными свойствами и в процессах подготовки воды служат одновременно катионным флокулянтом и биоцидом. В гуанидиновом ядре, представляющем собой сильное однокислотное основание, имеются полностью равноценные три аминогруппы, связанные с центральным атомом углерода. Двойная связь, которая схематически приписывается одному из них, равномерно разделена между всеми C-N-связями. Такому разделению соответствует симметричная структура катиона с зарядом, равномерно распределенным между тремя атомами азота:
Благодаря наличию трех аминогрупп гуанидин является весьма реакционноспособным соединением: легко алкилируется, ацилируется, конденсируется с различными органическими соединениями (формальдегидом, эфирами, кетонами, аминами, и др.) (Кузнецов, 2002).
К производным гуанидина относятся алкилендигуанидины и алкиленаминодигуанидины. Они широко используются в качестве фунгицидов (дигидрохлорид 1,6-дигуанидиногексана, соли 1,8 дигуанидинооктана - гидрохлорид, сульфат, ацетат и карбонат) и микробиоцидов. Они эффективны для защиты растений от патогенных грибов. Алкиленаминодигуанидины используются для антисептирования моющих средств и для подавления сульфатредуцирующих бактерий при вторичной разработке месторождений нефти (Кузнецов, 2002). Полиалкиленгуанидины (ПАТ), содержащие в открытой цепи множество отдельных изолированных гуанидиновых группировок были синтезированы впервые в 1943 году в США. Метод синтеза был сложный и состоял из четырех стадий {Усатенко, Суржик, 1999)
В 1975 году в Москве Гембицким П. А. был разработан двухстадийный синтез ПГМГ плавлением гидрохлорида гуанидина (ГГХ) с ГМДА (Гембицкий и др., 1975; Усатенко, Суржик Л, 1999):
Соли ПГМГ это твердые вещества без цвета и запаха, стабильные в отношении окислительной и термической деструкции, старения (сохраняют биоцидную активность свыше 15 лет). Полимеры хорошо растворимы в воде; 20%-ые водные растворы сохраняют биоцидную активность свыше 5 лет (Воинцева, Поликарпов, 2006)
Полигексаметиленгуанидин относится к классу катионных полиэлектролитов. Однако, в связи с тем, что в его химической формуле гуанидиновые группировки чередуются с шестью метиленовыми, он имеет свойство дифильности. Это проявляется в значительной поверхностной активности на границе раздела фаз воздух — вода. Водные растворы ПГМГ имеют полиэлектролитный эффект в области концентраций ниже 5% (Нижник, Астрелин, 2006). Благодаря высокой основности содержащихся в ПГМГ гуанидиновых группировок, с двумя замещенными и одной протонированной аминогруппой, его свойства во многом повторяют свойства полиаминов и некоторые свойства азотосодержащих соединений. Пространственное расположение атомов в гуанидиновой группировке приводит к образованию многоцентровых водородных связей, поэтому соли ПГМГ, содержащие к тому же гидрофобную полиметиленовую цепочку, обладают поверхностно-активными свойствами: поверхностное натяжение о ПГМГ-гидрохлорида 49 нМ/м (Кузнецов, 2002; Кошелева, 2002). Токсические свойства гуанидиновых соединений зависят от степени делокализации положительного заряда вмолекуле. Влияние аниона обусловлено его донорно-акцепторными свойствами. Анионы-акцепторы (например, С Г, ОН") оттягивают на себя электроны, увеличивая положительный заряд на катионе. Перераспределение электронной плотности в гуанидиновой группировке создает напряжение во всей макромолекуле: она принимает вытянутую конформацию, в которой все гуанидиновые группы легко доступны и реализуют свою реакционную способность при взаимодействии, в том числе с биологической клеткой (Воинцева И.И., Поликарпов Н.А., 2006).
Анионы органических кислот, напротив, отдают электронную плотность на гуанидиновую группировку, уменьшая ее положительный заряд. В связи с этим усиливается внутримолекулярные взаимодействия удаленных по цепи функциональных групп. В результате макромолекула принимает конформацию спирали, которая стабилизируется водородными связями и ван-дер-ваальсовым взаимодействием гексаметиленовых фрагментов (анион определяет шаг внутримолекулярной спирали). При этом, часть гуанидиновых группировок оказывается блокированной и теряет свою реакционную способность (Воинцева, Поликарпов, 2006).
Таким образом, макромолекула ПГМГ представляет собой сбалансированную систему, в которой гуанидиновая группировка несет положительный заряд и обеспечивает бактерицидные свойства; анион оказывает влияние на степень делокализации положительного заряда и тем самым контролирует токсичность; гексаметиленовая цепочка способствует перераспределению электронной плотности в макромолекуле и, кроме того, регулирует гидрофильно-гидрофобный баланс молекулы. Благодаря высокой реакционной способности гуанидиновой группировки ПГМГ способен вступать в химические реакции с различными бифункциональными и полифункциональными соединениями, в том числе,
Особенности электроспектроскопии водоросли Chlorella pyrenoidosa
Полученные результаты показали (рис.8), что наибольшая эффективность функционирования фотосинтетического аппарата клеток водоросли наблюдалась на 3-й сутки развития культуры. Этот периодхарактеризуется высокими значениями эффективности работы фотосистемы 2 в клетках водоросли и совпадает с фазой экспоненциального роста по численности клеток, что соответствует ранее полученным результатам (Кажлаева, Плеханов и др., 1991). роста. 1 - относительный выход переменной флуоресценции; 2 -скорость фотоиндуцированного выделения кислорода; 3 - мертвые клетки.
Это явилось дополнительным основанием для определения электрических свойств суспензии клеток водоросли в диапазоне частот 1 кГц -10 МГц на 3-й сутки культивирования. Измерения проводились по параллельной схеме замещения. При этом регистрировались сопротивление Rs и емкость Cs суспензии клеток водоросли, из которых затем рассчитывались величины tg6, коэффициенты поляризации Кп (отношение і?и на частоте 10 кГц к RB на частоте 10 МГц) и дисперсии Кд (отношение Rs на частоте 1 МГц к Rs на частоте 5 МГц). Далее путем перевода из параллельной в последовательную схему замещения, из измеренных величин Rs и Cs рассчитывали численные значения поляризационного сопротивления Rp и определяли зависимости Хр от Rp, представляемые в виде импедансной диаграммы (Cole, 1968). Для Rs, Cs и tgS определяли частотные зависимости этих параметров.
При нарушении проницаемости мембран величина сопротивления клетки R начинает снижаться и в меньшей степени зависеть от частоты. При полной гибели клетка по ее электрическим параметрам, не отличается от окружающей ее проводящей среды. Эти свойства были использованы Б.Н. Тарусовым (Тарусов, 1938) в качестве основы способа определения функционального состояния или жизнеспособности клеток. Предложенный метод состоит в измерении электрического сопротивления клеток Rs на двух частотах: на низкой, в качестве которой взята частота 10 Гц и на самой высокой для проводимых измерений частотах. Отношение величин Rs на частоте 104 Гц и на частоте порядка 106-107Гц носит название коэффициента поляризации Кп, причем, чем ниже уровень функционального состояния клетки, тем меньше значение величины этого коэффициента. В зависимости от уровня метаболизма для большинства клеток и тканей величина Ка колеблется в диапазоне от 2 до 15, а при гибели или начале необратимых повреждений значение стремится к единице. По изменению величины коэффициента поляризации можно судить о степени нарушения проницаемости и уровне жизнеспособности исследуемых клеток. Возможно также осуществлять оценку в линейной области дисперсионной кривой при помощи крутизны или коэффициента дисперсии КА, представляющего собой отношение сопротивлений в её низко- и высокочастотных участках. Другой характеристикой уровня функционирования при анализе электрических свойств клеточных суспензий и тканей может служить тангенс угла потерь tg8, который для параллельной эквивалентной схемы определяется формулой: tg8 = l/27ufCsi?s, где f - частота, на которой проводилось измерение. Преимущества применения как коэффициентов поляризации Кп и дисперсии Кд, так и tg6 заключается в том, что для определения этихпоказателей не требуется знать абсолютные величины и молено пользоваться измеренными значениями, хотя с другой стороны они не позволяют судить о поляризационных процессах на мембране, связанные с её проницаемостью. Для этих целей служит зависимость емкостного сопротивления Хр от поляризационного сопротивления Rp импеданса в последовательной эквивалентной схеме на всех частотах, на которых проводились измерения (Cole, 1968). График этой зависимости представляет собой полуокружность с центром, смещенным в направлении ниже оси абсцисс. Угол, образованный линией, соединяющей центр полуокружности с точкой её пересечения с осью поляризационного сопротивления Rp и вертикальной линией, проведенной из центра, носит название фазового угла. Для всех биологических объектов его величина всегда меньше 90 и является характеристикой транспортных функций мембраны для проникающих и непроникающих через нее заряженных молекул и ионов.
Характерные кривые частотной зависимости электрической проводимости Gs, емкости Cs и tg5 суспензии клеток водоросли на 3-й сутки культивирования приведены рис.9. Анализ кривых зависимости Gs и Cs на низких и высоких частотах показал, что для суспензии клеток водоросли область дисперсии находится в диапазоне частот от 10 кГц до 10 МГц, с максимумом в области 500 кГц - 1 МГц, что соответствует положению (3-дисперсии. Частотные зависимости величины tg5 демонстрируют наличие низкочастотного минимума на кривой в области 500 кГц, тогда как экстраполяция положения максимума свидетельствует о его положении в области более высоких частот - 20-40 МГц (рис.9). Величины коэффициенты поляризации Кп и дисперсии Кд на 3 сутки роста накопительной культуры водоросли составляли 5,1 и 1,7 соответственно, что свидетельствует о высоком уровне фотосинтетической активности и жизнеспособности клеток на 3 сутки культивирования. Зависимость емкостного сопротивления Хр от поляризационного сопротивления Rp в виде импедансной диаграммы имеет вид полуокружности со смещенным центром, что свидетельствует о наличиипроцессов избирательной проницаемости наружной мембраны клетки {рис.10). Фазовый угол составляет величину 78, которая наиболее характерная для большинства интактных клеток {Cole, 1968).Полученные результаты дают основания для применения метода
Использование импедансных диаграмм для анализа состояния клеток культуры Chlorella pyrenoidosa S-39 при действии высокотоксичных веществ
При анализе электрических параметров биологических объектов принято использовать эквивалентные электрические схемы различной степени сложности, отражащие характер частотных зависимостей электрических свойств в широком диапазоне частот. При этом предполагается, что окружающая среда и внутреннее содержимое клетки обладают электрической проводимостью и емкостью.
В связи с этим здесь использовали эквивалентную электрическую схему, которая более полно соответствует электрическим параметрам суспензии клеток, состоящая из комбинации последовательного и параллельного соединений активных сопротивлений и емкости (рис.11). В этой эквивалентной схеме клеточная мембрана представлена параллельным соединением активного сопротивления RM и емкости См, а сопротивлениями межклеточной среды и внутреннего содержимого клетки соответственно являются R0 и R; (Шван, 1963). Наличие в эквивалентной схеме активного сопротивления RM, включенного параллельно емкости клеточной мембраны См, изначально предполагает, что мембрана помимо емкости обладает и электрической проводимостью.
Анализ частотной зависимости эквивалентной схемы показывает, что часть переменного тока проходит по межклеточной среде, тогда как другая часть - через мембрану и внутреннюю среду клетки. Отношение величин этих токов проявляет значительную зависимость от частоты, благодаря наличию у клеточной мембраны емкости См.
Общее сопротивление на переменном токе (импеданс) представленной яз.рис. 7 7 эквивалентной схемы Z3K может быть выражено в следующем виде:где ZM - импеданс клеточной мембраны равный:
В выражении (14) Хм - реактивное сопротивление мембраны; Хи = ,где m = 2я/; f - частота на которой проводится измерение электрических свойств.
Величина емкости См не зависит от частоты и для мембран различных биологических объектов имеет стабильную величину -1,0 мкФ/см , тогда как реактивное сопротивление мембраны Хм проявляет частотную зависимость. Активные сопротивления R0 и Rj не зависят от частоты, однако их значения отражают функциональное состояние как самой клетки с ее внутренним содержимым, так и внешней мембраны. Так величина сопротивления RM зависит от уровня проницаемости мембраны клетки и в первую очередь для ионов, тогда как R0 определяется концентрацией ионов в межклеточной среде.
При экстраполяции импеданса эквивалентной электрической схемы {рис. 17) в область крайне низких частот (со — 0) реактивное сопротивление клеточной мембраны Хм очень велико (Хм — со) и им можно пренебречь. Поскольку величина активного сопротивления мембраны RM в низкочастотной области значительно выше чем сопротивления межклеточной среды RMK и внутреннего содержимого клетки RBH, то измеренное на этих частотах сопротивление R0 будет определяться преимущественно RMK, т.е. R0 = RMK. В случае высоких частот (со — со) реактивное сопротивление клеточной мембраны Хм стремится к своему минимальному значению (Хм — 0) и оно шунтирует активное сопротивление клеточной мембраны RM, в результате чего величина сопротивления R будет определяться соотношением сопротивлений RMK и RBH. В отсутствии шунтирования, т.е. при низкой электрической проводимости межклеточной среды (большое значение сопротивления RMK), величина Ro, будет равна сопротивлению внутреннего содержимого клетки RBH.
Для графического представления зависимости активного сопротивления R от реактивного X в широком диапазоне частот используется предложенный К. Cole способ построения в комплексной плоскости, или импедансной диаграммы, в которой параметром является частота {рис.17) {Cole, 1968).
В суспензиях нативных клеток, мембраны которых обладают избирательной проницаемостью в результате функционирования механизмов активного и пассивного транспорта, перенос через мембрану ионов отражается в понижении центра полуокружности относительно оси абсцисс (рис. 17). Построение импедансной диаграммы на основе экспериментальных данных осуществляется следующим образом. Значения сопротивления Rs и емкости Cs суспензии клеток, полученные при измерениях на переменном токе в параллельной эквивалентной схеме, пересчитываются в последовательную схему по формулам:
Измерения электрических свойств клеток Chlorella на фиксированной частоте в низкочастотной области (для практических целей)
Механизмы формирования и развития токсического эффекта, его качественные и количественные характеристики, прежде всего, определяются токсическими свойствами вещества, его концентрацией изависят от вида биологического объекта, его свойств. Установление количественных характеристик и причинно-следственных связей между фактом воздействия вещества и развитием различных форм токсического биологического эффекта является предметом токсикометрии (Куценко, 2004).
Изучение электрических свойств микроводорослей в целях биотестирования токсикантов окружающей среды требует различных и эффективных методических подходов к анализу полученных результатов. Выполненные исследования показали, что наиболее плодотворным следует считать измерение частотной зависимости электрических параметров. Вместе с тем остаются нерешёнными весьма серьёзные вопросы анализа электрических свойств суспензии микроводорослей, препятствующие их эффективному использованию при изучении зависимостей «доза-эффект» и «доза-время» для различных токсикантов, присутствующих в окружающей среде. Однако, при исследовании закономерностей, связывающих электрические свойства микроводорослей с их физиологическим состоянием при действии токсикантов, следует искать более упрощенные методы измерения и анализа полученных результатов, отличающиеся меньшей сложностью, временными затратами и отличающиеся большей технической доступностью.
К таким методическим приёмам следует отнести измерения электрических свойств на фиксированной частоте проходящего через биологический объект электрического тока, позволяющие однозначно провести оценку действия различных токсикантов на клетки микроводоросли. Помимо этого, такой методический поход даст возможность на основании экспериментальных данных определить кинетические параметры действия токсического вещества с клеткой и оценить характер этого взаимодействия во времени.
Измерения электрических свойств на фиксированной частоте в низкочастотной области (порядка 1 кГц) нашло своё применение приопределении объёмной концентрации клеток в суспензии. Впервые такой метод был использован H.Fricke, который применил его для определения объёмной концентрации суспензий клеток имеющих сферическую и сфероидальную форму {Fricke, 1925). При этом H.Fricke, используя экстраполяцию величины Rs для нулевой частоты, исходил из предположения, что клетки в суспензии не проводят электрический ток на этой частоте. Впоследствии метод измерения на фиксированной низкой частоте стал широко применяется для определения гематокритной величины крови (объёмной концентрации эритроцитов) {Okada, Schwan, I960), при изучении роста и развития бактериальных культур {Firstenberg-Eden, Eden, 1984), в различных видов дисперсионного анализа в биотехнологических процессах {Мирошников и др., 1986). В своих исследованиях F. Pliquett, используя метод измерения электрических свойств на фиксированной частоте, изучал характер действия токсических веществ на животных объектах {Pliquett, 1969; Пликет, 1973), в том числе и на эритроцитах {Wiese et. al, 1977).
Однако, использованию для измерения электрических свойств суспензий клеток на фиксированной низкой частоте свойственны неконтролируемые ошибки, связанные с перемешиванием суспензии, поверхностной проводимостью клеток, их деформацией при высоких и спонтанной седиментацией при низких концентрациях {Кертис, 1956). Электрохимические процессы, протекающие на электродах измерительных ячейки, на низких частотах приводят также к электродной поляризации, влияющим существенным образом на результаты измерений (Onoral et. al, 1982). В дополнении к этому, внутреннее сопротивление клетки RB„ при определенном соотношении с сопротивлением межклеточной среды RMK, также ограничивает точность и достоверность измерений. Последнее было показано в исследованиях Ю.А.Буевича и Н.В.Лысогорова, выполненных на суспензии дрожжей Saccaromyces vini, когда поглощение клетками ионов из межклеточной среды приводило к искажению истинных величинэлектрической проводимости суспензии (Буевич, Лысогорое, 1965). Все эти погрешности в значительной степени ограничивают использование измерений электрических свойств на фиксированной низкой частоте, снижая тем самым точность и целевую направленность метода.
Вместе с тем, несомненная перспективность метода измерения электрических свойств суспензий клеток на фиксированной частоте заставляет искать новые подходы к исследованиям и анализу полученных результатов. Обращают на себя внимание работы Б.И.Полиеоды, в которых совершенствование методики измерений на фиксированной частоте 100
