Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Классификация рецепторов ГАМК в ЦНС млекопитающих 11
1.2. Структурная гетерогенность ГАМКд рецепторов в ЦНС млекопитающих. 15
1.2.1. Репертуар субъединиц, входящих в состав ГАМКд рецепторов 15
1.2.2. Количество субъединиц, входящих в состав одного ГАМКд рецептора 20
1.2.3. Субъединичная композиция нативных рецепторов 22
1.3. Функциональная гетерогенность нативных ГАМКд рецепторов 25
1.3.1. Функциональные свойства нативных рецепторов 26
1.3.2. Влияние аллостерических модуляторов на ГАМКд рецепторы 31
1.3.3. Структурные детерминанты эффекторных сайтов модуляторов 35
1.4. Функциональная роль гетерогенности ГАМКд рецепторов 37
2. Материалы и методы 41
2.1. Приготовление срезов 41
2.2. Конструкция инкубационной камеры 43
2.3. Конструкция регистрационной камеры 44
2.4. Выделение клеток методом вибродиссоциации 44
2.5. Изготовление микроэлектродов 46
2.6. Идентификация клеток 47
2.7. Рабочая установка для регистрации токов от изолированных нейронов 48
2.8. Порядок проведения опытов 50
2.9. Система быстрой аппликации растворов 51
2.10. Обработка данных и математическое моделирование 54
2.11. Приготовление растворов веществ 57
3 Результаты
3.1. Исследование эффектов, вызываемых ГАМК в клетках Пуркинье (КП) и гигантских интернейронах стриатума (ГИС) 59
3.1.1. Общая характеристика токов вызываемых ГАМК в КП и ГИС 59
3.1.2. Концентрационная зависимость эффектов, вызываемых ГАМК в КП и ГИС. 61
3.1.3. Сравнение абсолютных амплитуд ответов, вызываемых концентрациями ГАМК ЕС20 в КП и ГИС 63
3.1.4. Измерение относительной амплитуды ответов, вызываемых: 2мкМ ГАМК для КП и 15мкМ для ГИС 65
3.1.5. Сопоставление временных характеристик ответов КП и ГИС, вызванных аппликацией ГАМК ЕСго 67
3.2. Исследование действия фуросемида на токи, вызываемые ГАМК 69
3.2.1. Влияние фуросемида на токи, вызванные ГАМК в КП и ГИС 69
3.2.2. Изменения ответов на ГАМК при совместной аппликации с фуросемидом. 69
3.2.3. Влияние фуросемида на скорость активации ответа в КП и ГИС 71
3.2.4. Влияние фуросемида на амплитуду стационрного ответа вызванного ГАМК в КПиГИС 72
3.2.4.1. Концентрационная зависимость эффектов фуросемида 72
3.2.4.2. Зависимость эффектов фуросемида проявляемых от мембранного потенциала 74
3.2.5. Эффекты фуросемида на стадии деактивации ответа в КП и ГИС. 77
3.2.6. Влияние постоянного присутвия фуросемида на токи, вызываемые совместной аппликацией ГАМК и фуросеимда 81
3.2.7. Влияние фуросемида на чувствительность ГАМКд рецепторов к ГАМК в КП 82
3.2.8. Моделирование 84
3.3. Изучение модулирующего воздействия зольпидема на токи вызываемые ГАМК в КПиГИС 93
3.4. Изучение модулирующего действия лореклезола на токи, вызываемые ГАМК в КП и ГИС 96
3.5. Модуляция LaCb токов вызываемых ГАМК 100
3.5.1. Общие замечания относительно действия LaCb 100
3.5.2. Исследование концентрационной зависимости эффектов LaCb в КП и ГИСЛОО
3.5.3. Зависимость эффектов LaCb от коапплицируемой концентрации ГАМК 102
3.5.4. Влияние преаппликации ЬаСІз на токи вызываемые совместной аппликацией. 102
3.5.5. Влияние лантана на чувствительность ГАМКдрецеторов к ГАМК в КП и ГИС. 104
3.5.5.1. Влияние ЬаСІз на чувствительность КПк ГАМК 105
3.5.5.2. Влияние LaCb на чувствительность ГИС к ГАМК 105
3.5.6. Влияние мембранного потенциала клеток на эффекты вызываемые LaCb 108
4. Обсуждение 111
4.1. Выбор объектов и методики исследования 111
4.1.1. Выбор объектов исследования 111
4.1.2. Использование селективных модуляторов для изучения функциональных свойств ГАМКд рецепторов 112
4.1.3. Идентификация токов, вызываемых активацией ГАМКд рецепторов 114
4.1.4. Идентификация выделенных нейронов 116
4.2. Эффекты, вызываемые ГАМК в КП и ГИС 117
4.2.1. Концентрационная зависимость эффектов ГАМК 117
4.2.2. Сравнение относительных амплитуд ответов, вызванных аппликацией ГАМК ЕС20 120
4.2.3. Сравнение абсолютных величин ответов, вызываемых аппликацией ГАМК ЕС20 121
4.2.4. Сравнение временных характеристик ответов на ГАМК ЕС20 122
4.3.Модулирующее действие фуросемида 123
4.3.1. Характерные черты модуляции фуросемидом токов, вызванных ГАМК в КП и ГИС 123
4.3.2. Моделирование 129
4.3.2.1. Обсуждение модели блокирующего действия фуросемида 129
4.3.2.2. Выбор модели активации ГАМКд рецепторов КП 132
4.3.2.3. Сопоставление результатов моделирования с экспериментальными данными 133
4.4. Модулирующее действие зольпидема, LaCI3, и лореклезола на токи, вызываемые ГАМК 135
4.4.1. Общая характеристика 135
4.4.2. Модулирующее действие зольпидема на токи, вызываемые ГАМК 135
4.4.3. Модуляция ГАМК вызванных токов лореклезолом 137
4.4.4. Модулирующее действие лантана 140
4.5. Сопоставление функциональных свойств рецепторов с данными о распределении субъединиц 142
Выводы 146
- Структурная гетерогенность ГАМКд рецепторов в ЦНС млекопитающих.
- Конструкция инкубационной камеры
- Исследование действия фуросемида на токи, вызываемые ГАМК
- Эффекты, вызываемые ГАМК в КП и ГИС
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Изучение функциональной роли гетерогенности ГАМКд рецепторов имеет довольно длительную историю. Исследования в этой области стимулированы во многом благодаря тому, что ГАМК является основным тормозным нейромедиатором в ЦНС млекопитающих. Главной мишенью для ГАМК на постсинаптической мембране являются ГАМКд рецепторы, которые являются также местом воздействия широкого ряда нейротропных препаратов. Центральное место в передаче торможения обуславливает ведущую роль ГАМКА рецепторов в регуляции активности нейронов и определяет актуальность исследования функциональных особенностей ГАМКА рецепторов в разных типах нейронов.
Отличительной особенностью ГАМКА рецепторов является высокая степень их структурной гетерогенности. Такая гетерогенность не характерна для глициновых и ацетилхолиновых рецепторов, структурно близких к ГАМКА рецепторам и часто объединяемых в одно суперсемейство наряду ГАМКс рецепторами (Barnard et al. 1998). Различные структурные варианты ГАМКА рецепторов распределены определенным образом в ЦНС. Это обстоятельство вызывает интерес к исследованию структурно-функциональных связей, а также роли функциональной гетерогенности этого типа рецепторов (Doble et al. 1992; Mohler et al. 1995; Nutt et al. 2001; Pirker et al. 2000). Кроме этого, существует еще целый ряд причин, по которым изучение функциональной роли гетерогенности ГАМКА рецепторов является крайне актуальной задачей.
Во-первых, воздействие на ГАМКА рецепторы с помощью некоторых препаратов вызывает на уровне целого организма широкий спектр поведенческих эффектов. Согласно современным представлениям, широкий спектр действия фармакологических препаратов, воздействующих на ГАМКА рецепторы, связан, прежде всего, с функциональной гетерогенностью этих рецепторов, субстратом для которой является их структурная гетерогенность.
Во-вторых, развитие некоторых неврологических и психических заболеваний и расстройств, по-видимому, объясняется изменениями в количественном и качественном составе ГАМКА рецепторов на различных типах нейронов (Nutt et al. 2001).
Таким образом, изучение функциональной роли гетерогенности ГАМКА рецепторов является основой для понимания процессов регуляции возбудимости и эмоционального статуса ЦНС в норме и патологии.
Использование современных методов работы с генетическим материалом, применение различных модельных систем позволило достичь определенных успехов в этом направлении. Так, недавние исследования подтверждают предположение о том, что процессы сборки функциональных рецепторов, по-видимому, подчиняются определенным закономерностям (Klausberger et al. 2001b; Klausberger et al. 2001a; Sarto et al. 2002). Сочетание субъединиц в функциональном ГАМКд рецепторе не является произвольным, а детерминировано структурными особенностями каждой субъединицы (Klausberger et al. 2001а; Sarto et al. 2002), при этом каждой субъединице в составе рецептора, по-видимому, отведена своя роль (взаимодействие с агонистом, субклеточная локализация и взаимодействие с «заякоривающими» белками и т.п.) (Chebib et al. 2000). Таким образом, первоначальные оценки структурной гетерогенности ГАМКА рецепторов, сделанные на основе предположения о случайном характере сочетания субъединиц, были явно завышены (Barnard et al. 1998).
Изучение принципов структурной организации ГАМКА рецепторов очень важно для понимания роли гетерогенности этих рецепторов, однако, результаты этих исследований не дают ответа на вопрос, насколько различаются функциональные свойства исследуемых рецепторов. Определенную информацию о свойствах рецепторов можно получить, используя рекомбинантные рецепторы, экспрессированные в гетерологичных системах. Однако на сегодняшний день отсутствуют методики определения субъединичной композиции ГАМКд рецепторов, экспрессирующихся на определенном типе нейронов, что делает невозможным корректное сопоставление структур рекомбинантных и нативных рецепторов. Кроме того, свойства рекомбинантных рецепторов зависят от использованной системы экспрессии и, по-видимому, отличаются от свойств нативных ГАМКА рецепторов (Hevers et al. 1998).
С другой стороны, при исследовании свойств рекомбинантных рецепторов был выделен целый класс веществ, характер действия которых определяется структурой ГАМКд рецепторов (Barnard et al. 1998; Sieghart 1995). Предполагается (с различной степенью обоснованности), что свое воздействие эти селективные модуляторы оказывают, связываясь с неперекрывающимися местами узнавания, расположенными на ГАМКд рецепторах. Таким образом, действие того или иного селективного модулятора определяется различным набором структурных детерминант рецептора (Mehta et al. 1999).
Использование набора таких веществ при исследовании функциональных свойств рецепторов позволяет наиболее полным и независимым образом оценить их функциональную и, как следствие, структурную гетерогенность. Изучение воздействия того или иного вещества на определенный тип клеток позволяет связать результаты
исследований на отдельных нейронах с результатами поведенческих экспериментов (in vivo) и исследований на срезах ткани.
Помимо обозначенной выше теоретической значимости, результаты таких исследований имеют и прикладное значение. Так как некоторые из применяемых селективных модуляторов являются лекарственными препаратами, то данные эксперименты позволяют глубже понять механизмы действия этих веществ (Nutt et al. 2001).
Таким образом, использование набора веществ, способных проявлять селективность к субъединичному составу, позволяет связать функциональные свойства (или, как говорят «фармакологический профиль» данного типа рецепторов) со структурой исследуемых рецепторов. При таком подходе охватывается сразу несколько несовпадающих структурных элементов - мест связывания рецептора, следовательно, полученное описание дает наиболее полное описание функциональных свойств рецепторов. Поэтому в данной работе в рамках проведения сравнительного исследования функциональных свойств нативных ГАМКд рецепторов был использован набор модуляторов селективных к их субъединичному составу. Цель работы.
Целью данной работы являлось сравнительное исследование функциональных свойств ГАМКд рецепторов, эксперессируемых на поверхности различных типов центральных нейронов - клеток Пуркинье мозжечка и гигантских холинергических интернейронов из головки хвостатого ядра мозга крысы. Задачи.
Были поставлены следующие задачи:
1) Используя метод фиксации потенциала на изолированной клетке и систему быстрой аппликации веществ, исследовать биофизические свойства токов, вызываемых ГАМК в клетках Пуркинье мозжечка и гигантских интернейронах стриатума, выделенных из срезов мозга крысы. Дать количественную оценку свойств ответов, вызываемых ГАМК в исследованных типах нейронов.
2) Провести сравнительное исследование в разных типах нейронов модуляции ГАМК-активируемых токов веществами, которые избирательно взаимодействуют с ГАМКд рецепторами, имеющими различный субъединичный состав (фуросемид, зольпидем, хлорид лантана, лореклезол). Выявить особенности модуляции ответов на ГАМК этими препаратами и дать количественную оценку их эффектов для исследуемых типов клеток.
3) Проанализировать полученные результаты о различии свойств нативных рецепторов в свете литературных данных по фармакологии рекомбинантных рецепторов. Сопоставить
полученные результаты с литературными данными о распределении различных подтипов субъединиц ГАМКд рецепторов в мозге крысы с целью выявления наиболее вероятной субъединичной композиции этих рецепторов в исследованных нейронах. Научная новизна полученных результатов.
Методом локальной фиксации потенциала впервые проведено систематическое исследование функциональных свойств ГАМКд рецепторов в двух типах центральных нейронов - клетках Пуркинье (КП) мозжечка и гигантских ацетилхолинергических интернейронах стриатума (ГИС). Сравнительная оценка абсолютных амплитуд ответов на ГАМК в КП и ГИС позволяет утверждать, что количество рецепторов на обоих типах нейронов примерно одинаково.
Впервые проанализирован механизм действия фуросемида на ГАМКА рецепторы КП и ГИС и установлено, что он отличен от такового, описанного в литературе для фуросемид-чувствительных, 0.6-, а4-содержащих рецепторов. Впервые показано, что фуросемид блокирует токи, вызываемые ГАМК, взаимодействуя с порой канала этого типа рецепторов, и что угнетение токов происходит по механизму последовательного блока. Впервые изучена зависимость блокирующего действия фуросемида от мембранного потенциала. В рамках модели Woodhull различия, полученные для КП и ГИС, были связаны с различиями в строении канала ГАМКА рецепторов в обоих типах клеток. Предложена математическая модель, описывающая действие фуросемида на ГАМКА рецепторы КП.
Впервые исследовано модулирующее действие ЬаСІз в КП и в ГИС. Совместная аппликация ГАМК и лантана приводила к потенциации ответа. Показано, что ГАМКА рецепторы КП более чувствительны к действию ЬаОз, чем рецепторы ГИС (ЕС 50 для КП меньше чем для ГИС, а максимальный эффект больше).
Впервые исследовано модулирующее действие лореклезола на токи, вызываемые ГАМК в КП и ГИС. Показано, что в обоих типах клеток лореклезол потенциирует ответы, вызываемые ГАМК ЕСго, при этом, максимальный потенциирующий эффект лореклезола для КП значительно выше, чем для ГИС. Научно-практическая значимость.
Полученные результаты позволяют сравнить роль ГАМКергических входов в регулировании активности клеток Пуркинье мозжечка и гигантских холинергических нейронов стриатума крысы. Использование набора селективных модуляторов при исследовании функциональных свойств ГАМКА рецепторов позволило провести систематическое исследование их функциональной гетерогенности. Подобный подход может быть распространен и на другие типы нейронов. Изложенные результаты важны
для понимания и оценки роли гетерогенности ГАМКд рецепторов в ЦНС и будут полезны при интерпретации экспериментов, проводимых на срезах или на уровне целого организма. Кроме того, потенциально интересным направлением для изучения строения ГАМКд рецепторов является исследование действия канальных блокаторов - структурных гомологов фуросемида. Подобный подход с использованием соответствующих блокаторов позволит ответить на ряд принципиальных вопросов, касающихся механизмов работы каналов этих рецепторов. Предлагаемая модель действия фуросемида является удобным инструментом для проверки и выдвижения новых гипотез, в том числе и о механизмах работы ГАМКд рецептора как такового.
Структурная гетерогенность ГАМКд рецепторов в ЦНС млекопитающих.
Гипотеза о структурной и функциональной гетерогенности ГАМКд рецепторов была впервые выдвинута на основании результатов экспериментов по связыванию и замещению радиоактивного лиганда на BZ сайтах ГАМКд рецепторов (Doble et al. 1992). При этом было показано существование, как минимум, двух различных типов ГАМКд рецепторов (иногда обозначаемых как BZ I и BZ II), обладающих различной аффинностью к лигандам BZ сайта и распределенных различным образом в ЦНС (Doble et al. 1992). 1.2.1, Репертуар субъединиц, входящих в состав ГАМКд рецепторов. Систематическое изучение структурной гетерогенности ГАМКд рецепторов началось с того момента, когда были выделены и секвенировны первые субъединицы ГАМКд рецепторов: аь Pi (Barnard et al. 1988). Выделение первых субъединиц проводили на основе изученных функциональных свойств ГАМКд рецепторов (способность специфически взаимодействовать с мусцимолом (2) и бензодиазепинами). Так, в работе (Barnard et al. 1988) для выделения ГАМКд рецепторов из экстракта мозга свиньи использовали аффинную хроматографию на матрице, модифицированной флунитрозепамом. Секвенирование фрагментов выделенных полипептидных цепей позволило синтезировать специфические олигонуклеотидные зонды и провести поиск кодирующих последовательностей в библиотеках кДНК. Первичная структура субъединиц была установлена благодаря секвенированию соответствующих последовательностей кДНК. На основании анализа первичной структуры (сопоставление аминокислотных последовательностей, анализ распределения гидрофобных аминокислот, наличие дисульфидных связей и т.п.) были выделены общие структурные мотивы для этих субъединиц и показана аналогия в строении этих белков с ранее изученными субъединицами никотинового ацетилхолинового рецептора (АХР) (Barnard et al. 1988). Выявленная структурная аналогия позволила выдвинуть гипотезу, согласно которой отдельные субъедиыицы ГАМКд рецепторов обладают такой же топологией полипептидных цепей, как субъединицы АХР. При этом предполагалось, что пространственная организация субъединиц в ГАМКд рецепторе схожа с таковой для АХР. На сегодняшний день выделены целые семейства субъединиц ГАМКд рецепторов из мозга различных видов животных (Stephenson 1995). Данное обстоятельство позволяет выделить общие черты химического строения этих полипептидов. Каждая из субъединиц имеет молекулярную массу около 50 кДа (от 48 кДа у у - субъединиц до 64 кДа у сц), у каждой из них по 4 трансмембранных домена (ТМ1-4, см. Рис. 1 Б), при этом и N-, и С-концы полипептидной цепи находятся на внеклеточной поверхности (Рис. 1 А). На N- терминальном участке имеются консенсусные последовательности для N-гликозилирования, дисульфидный «мостик» (характерный структурный мотив для всех членов этого суперсемейства, который был даже выделен в (Humphrey et al. 1998) как отдельный идентификационный признак) (Barnard et al. 1998).
По аналогия с АХР, предполагается, что домен ТМ2 участвует в формировании канала (Рис. 1 В). (Barnard et al. 1987). Между ТМЗ и ТМ4 доменами находится большой внутриклеточный фрагмент, на котором сосредоточены сайты фосфорилирования протеинкиназами и с которым связаны основные отличия в первичной структуре между различными субъединицами (Barnard et al. 1998; Stephenson 1995). Сразу после выделения первых субъединиц и анализа их первичных последовательностей были выделены структурные фрагменты, предположительно, характерные для всех субъединиц ГАМКд рецепторов (Barnard et al. 1987; Barnard et al. 1988). В дальнейшем поиск и секвенирование новых субъединиц в библиотеках кДНК вели с использованием олигонуклеотидных зондов, синтезированных на основе выделенных характерных пептидных последовательностей (Davies et al. 1997; Draguhn et al. 1990; Herb et al. 1992; Whiting et al. 1997b). Пик этих исследований приходился на конец 80-х начало 90-х годов прошлого столетия. Выделенные в процессе гибридизации последовательности кДНК затем амплифицировали и секвенировали. Определенную роль в интенсификации поисков и выделения новых субъединиц ГАМКА рецепторов сыграло применение новых методик при работе с генетическим материалом (методики RT-PCR, анализ геномной ДНК и т.д.). Примеры применения таких методик можно найти в работах (Bonnert et al. 1999; Hedblom et al. 1997; Whitmg et al. 1997a). Следует подчеркнуть, что критерием выделения последовательностей при таком подходе является их структурная схожесть с ранее выделенными и секвенированными аминокислотными последовательностями субъединиц ГАМКд рецепторов. Для подтверждения того, что вновь выделенные субъединицы имеют отношение К ГАМКд рецепторам, проводили их совместную экспрессию с ранее выделенными субъединицами в системах гетерологичной экспрессии и изучали свойства полученных ГАМКд рецепторов (Davies et al 1997; Draguhn et al. 1990; Herb et al. 1992; Whiting et al. 1997b). Наличие вновь выделенных субъединиц в ЦНС подтверждали, используя гибридизацию in situ с меченными олигонуклеотидами и специфические антитела (Bonnert et al. 1999; Whitmg etal. 1997b). Выделенные субъединицы ГАМКд рецепторов принято объединять в семейства на основании схожести их первичной аминокислотной последовательности (Sieghart 1995; Stephenson 1995). Стоит отметить отсутствие четкой терминологии при обозначении этих семейств белков. Иногда в одном и том же обзоре для обозначения такой группы субъединиц используются термины семейство, подсемейство, класс и подтип (Chebib et al. 2000). При этом каждое новое семейство (подтип) обозначается буквой греческого алфавита а, р, у и т.д. Степень структурной гомологии внутри одного подтипа не ниже 60%, степень сходства между различными подтипами не ниже 30%. Для того, чтобы отличать индивидуальные полипептидные последовательности внутри одного подтипа, наряду с греческими буквами вводят численные обозначения, при этом говорят об отдельных подтипах или изоформах субъединиц. Четкая терминология здесь также отсутствует, и иногда, говоря об определенном подтипе субъединиц, подразумевают конкретную изоформу данного подтипа (семейства) (Mehta et al. 1999; Sieghart 1995) (термин «изофорома» рекомендован комитетом IUPHAR для употребления в этом качестве (Barnard et al. 1998)). На сегодняшний день из мозга млекопитающих было выделено 6аэ 4р, Зу, 18, 1є, 1л, Зр и 19 изоформ (Barnard et ah 1998; Bonnert et al. 1999; Whiting et al. 1997b). Наличие изоформы - y4 было показано для птиц (Harvey et al. 1993), но не обнаружено пока у млекопитающих. Изоформа р4, обнаруженная ранее у птиц (Lasham et al. 1991), была также обнаружена и у человека (Levin et al. 1996), но в последнем случае была опубликована лишь частичная аминокислотная последовательность (Levin et al 1996). Субъединицы є и 0 были обнаружены только у человека, однако, структурно сходные с ними субъединицы были обнаружены также в мозге обезьян и крыс (Bonnert et al. 1999; Whiting et al. 1997b) (см. ниже в данном разделе). Распределение ж субъединиц довольно специфическое (в основном в органах репродуктивной системы), наличие этой субъединиы в мозге млекопитающих пока не было показано (Hedblom et al. 1997).
Для отображения структурной гомологии субъединиц совокупность субъединиц ГАМКд рецепторов принято представлять в виде дендрограмм (Barnard et al. 1998; Stephenson 1995). На Рис. 2 представлена дендрограмма для аминокислотных последовательностей субъединиц из мозга крысы, кроме 04 (из мозга курицы) и є (из мозга человека). Соответствующие субъединицы в мозге крысы пока не обнаружены (Barnard et al. 1998). Аналогичные схемы были составлены для других видов животных и человека и приведены в работах (Bonnert et al. 1999; Stephenson 1995; Whiting et al. 1997b). Межвидовые отличия одних и тех же изоформ ГАМКд рецепторов, согласно (Stephenson 1995) незначительны (во всяком случае, для млекопитающих). Это обстоятельство позволило авторам (Bonnert et al. 1999; Whiting et al. 1997b) использовать олигонуклеотиды, комплиментарные к кДНК субъединиц человека (е-субъединица), для гибридизации in situ в мозге обезьян (для крыс были выращены соответствующие антитела, которые затем были использованы для иммунопреципитации). Следует отметить, что для одной изоформы также могут существовать несколько отличных друг от друга белковых цепей, получаемых в результате альтернативного сплайсинга пре-мРНК. Так, для уг субъединицы было обнаружено два варианта (Kofuji et al. 1991; Whiting et al. 1990), отличающиеся по длине внутриклеточного участка межу ТМЗ и ТМ4 фрагментами и которые, видимо, по-разному распределены в ЦНС. Аналогичные различия известны и для 02, р4 субъединиц, для которых также было показано наличие двух вариантов (Bateson et al. 1991; Harvey et al. 1994). Каждая из таких последовательностей (уг, (Зг и (34) имеет в своем обозначении дополнительную букву L или S (соответственно, длинная и короткая) (Barnard et al. 1998). Два различных варианта было найдено и для (33 субъединицы (Kirkness et al. 1993). По-видимому, существует три варианта для а5 субъединицы (Kimetal. 1997). Продуктом альтернативного сплайсинга являются и схб субъединица, укороченная с N- конца (Korpi et al. 1994), хотя в данном случае коэкспрессия с другими субъединицами не выявила наличия функционального рецептора (Barnard et al. 1998).
Конструкция инкубационной камеры
Инкубационная камера (Рис. 6), использованная в работе, аналогична камере описанной ранее в работе (Vorobjev 1991). Камера представляет собой стеклянный стакан (1, ссылки в этом разделе приведены в соответствии с Рис. 6) емкостью 100-150 мл, внутри которого находится пластиковый цилиндр (2), открытый с верхнего торца, а на нижний торец цилиндра натянута нейлоновая сетка (3). Цилиндр был расположен в камере таким образом, что между дном стакана и сеткой оставался зазор (примерно 1 см). Положение цилиндра фиксировалось при помощи полиэтиленовой трубки (6) подходящего диаметра, которая вставлялась между стенкой цилиндра и стенкой инкубационной камеры. Все процедуры по приготовлению срезов, а также их инкубация проводились в растворе следующего состава (в мМ): NaCl 125, КС1 5, СаСЬ 1.5, MgCl2 1.5, NaH2P04 1.25, NaHC03 25, глюкоза 10. 2.3. Конструкция регистрационной камеры. Камера для регистрации (Рис. 8) представляла собой пластину из плексигласа {1 ссылки в этом разделе приведены в соответствии с Рис. 8) толщиной 5 мм, в которой было сделано два отверстия: сквозное диаметром 2 см (2) и глухое диаметром - 2 мм (3). Дно сквозного отверстия (3) закрывалась покровным стеклом (6), которое крепилось к пластине при помощи нагретого воска. Оба отверстия соединялись, друг с другом при помощи горизонтального канала (4), проделанного в толще пластины, образуя сообщающиеся сосуды (А и Б, см. Рис. 8). В рабочем состоянии камера заполнялась раствором для регистрации. В отделении А помещался индифферентный электрод, а в отделении Б производилась обработка срезов и регистрация ответов. Данная конструкция позволяла минимизировать диффузию между двумя сосудами и обеспечивала надежный электрический контакт между ними. Раствор, которым заполнялась камера, имел следующий состав (мМ): NaCl 145, КС1 5, СаСЬ 2.7, MgCl2 2, HEPES 5, HEPES-Na 5. Значение pH находилось в пределах 7.4-7.5. 2.4. Выделение клеток методом вибродиссоциации. Рис.7 Обработка срезов методом вибродиссоциации. Полученные в ходе вышеописанной процедуры срезы стриатума и мозжечка инкубировались минимум 1 час перед их использованием. После чего срезы по одному переносились при помощи полиэтиленовой пипетки с широким оплавленным концом, из инкубационной камеры в регистрационную камеру, где они помещались в раствор для регистрации. Регистрационная камера крепилась на предметном столике инвертированного микроскопа. Обработку срезов проводили при помощи установки для вибродиссоциации (Рис. 9), под визуальным контролем, с использованием бинокулярной, операционной лупы. Метод вибродиссоциации был разработан сотрудником нашей лаборатории -Воробьевым B.C.
Этот метод, подробно описанный в (Vorobjev 1991), был снезначительными изменениями применен и в данной работе. Суть метода заключается в том, что воздействие механических колебаний, возбуждаемых в водной среде, на срез ткани дает возможность извлекать жизнеспособные нейроны. Апплицируя эти колебания локально, возможно выделять нейроны преимущественно из той области среза, на которую оказывается механическое воздействие (Vorobjev 1991). Рабочим элементом установки для вибродиссоциации служит стеклянная Г-образно изогнутая трубка (1 нумерация ссылок соответствует нумерации на Рис. 9). Изогнутый конец трубки был оплавлен в виде шарика (1а) (диаметр шарика 0.4-0.7мм). Другой конец трубки крепился к бипьезоэлектрической пластинке (2). Под действием переменного тока пластина изгибалась и обеспечивала колебательные движения закрепленной на ней трубки и шарика. Шарик совершал колебательные движения (вверх-вниз, как показано на Рис. 9) с амплитудой не более 0.1-0.3 мм, что обеспечивало оптимальные условия для выделения клеток. Во время обработки шарик находился на некотором расстоянии от поверхности среза. Позиционирование шарика над срезом осуществлялось с помощью микровинта (5). Питание установки осуществляли от сети переменного тока 220 вольт, через разделительный трансформатор с выходным напряжением 190 вольт, подача напряжения производилась нажатием педали ножного переключателя. Фиксацию среза осуществляли при помощи стальной, инъекционной иглы, заточенной наподобие вилки. По мере обработки срез перемещался под шариком таким образом, что в результате обрабатывалась целая область. В целом, срезы мозжечка и стриатума обрабатывались по краям, как это показано на Рис. 7 (обрабатываемые области обозначены штриховкой). Обработка срезов продолжалась обычно 5-10 секунд. Об эффективности процедуры выделения судили по количеству выделенных, жизнеспособных нейронов в поле зрения микроскопа. При необходимости обработку повторяли. После обработки установку для вибродиссоциации отводили от регистрационной камеры с тем, чтобы не мешать дальнейшим действиям. 2.5- Изготовление микроэлектродов. Изготовление микропипеток проводили в два этапа. На первом этапе производили заготовки для микропипеток. Заготовки вытягивали из стеклянных (твердое, боросиликатное стекло) трубок длиной 0.8 м внешним диаметром 10 мм и внутренним диаметром 6 мм при помощи большой вертикальной кузницы PY-6 (Narshige, Japan). Внутри трубок помещали стеклянный капилляр (внешний диаметр которого был примерно 0.3 мм), сделанный из того же стекла что и трубка. В результате этой процедуры получали заготовки с внутренним диаметром 1.4-1.5 мм и внешним диаметром 1.6-1.7 мм. Для удобства, полученные заготовки обрезали до нужной длины ( -70мм) и хранили в, защищенном от пыли, контейнере. На втором этапе из заготовок изготавливали микропипетки. Микропипетки вытягивали из заготовок в две стадии на горизонтальной микрокузнице PD-5 (Narishige, Japan). Из каждой заготовки получалось по две идентичных микропипетки. Температуру нагревательного элемента регулировали, оценивая грубо, с помощью микроскопа, диаметр получаемых микропипеток (внешний диаметр пипеток составлял -1 мкм) и измеряя сопротивление заполненных пипеток (микроэлектродов). Сопротивление микроэлектродов, использованных в данной работе, после заполнения соответствующим раствором (см. ниже) составляло 2-3 мОм. После изготовления пипетки заполнялись раствором при помощи 1мл шприца с насаженным 0.2 мкм фильтром и тонкой (диаметром 0.2 мм) полиэтиленовой иглой. Оплавления пипеток не проводилось. Раствор для заполнения пипеток (внутриклеточный раствор) имел следующий состав (в мМ): CsCl 140, СаС12 1, MgCl2 4, HEPES 10, EGTA 5, ATP-Na 4. 2.6. Идентификация клеток. После выделения из срезов, клетки оседали на дно регистрационной камеры (в течении 10 секунд), что делало возможным их поиск и идентификацию.
Выделенные клетки Пуркинье (КП) имели характерную грушевидную форму. На рисунке представлены записи ответов на аппликацию 2 мМ глутамата характерные для проекционных нейронов и ГИС (прямоугольником обозначен интервал, в течении которого проводилась аппликация глутамата): А) запись ответа ГИС Б) запись ответа проекционного нейрона. Размер сомы у этого типа нейронов составлял 15-25 мкм. После диссоциации срезов мозжечка, в поле зрения микроскопа, кроме КП попадалось значительное количество мелких клеток (предположительно, клеток-зерен и глиальных клеток), размер сомы которых не превышал 10 мкм, а также эритроциты, которые отличались как по форме, так и по размерам от КП. После обработки срезов стриатума, в поле зрения микроскопа попадались в основном клетки имеющие округлую форму сомы и небольшой размер (не более 20 мкм). Согласно (Kawaguchi 1993; Vorobjev et al. 2000), большая часть из них это проекционные нейроны стриатума. Клетки имеющие полигональную форму, а также большой размер сомы (25-35 мкм) были идентифицированы как гигантские, ацетилхолинергические интернейроны стриатума (ГИС) (авторами Itier et al. 1996; Vorobjev et al. 2000 были использованы аналогичные критерии). Эти клетки встречались относительно редко и, в лучшем случае, их число не превышало 2-3 на обрабатываемый срез. Кроме того, согласно (Vorobjev et al. 2000), этот тип клеток эксперессирует глутаматные рецепторы (АМПА-типа), обладающие специфическими свойствами. Поэтому в данной работе для подтверждения принадлежности визуально идентифицированных клеток к ГИС, использовали в качестве критерия ответ на 2 мМ глутамата. На Рис. 10 приведены записи токов от клетки идентифицированной как ГИС (Рис. 10 А) и, предположительно, от проекционного нейрона (Рис. 10 Б), сделанные при аппликации 2мМ глутамата. Согласно (Vorobjev et al. 2000) ответ ГИС не имеет стационарного компонента и, достигая пикового значения, очень быстро десенситизируст. 2.7. Рабочая установка для регистрации токов от изолированных нейронов. Схема рабочей установки приведена на Рис. 11 (нумерация ссылок приведена в соответствии с Рис. 11).
Исследование действия фуросемида на токи, вызываемые ГАМК
Исследование действия фуросемида на токи, активируемые аппликацией ГАМК (используемые концентрации ГАМК: 2-50 мкМ для КП и 5-500 мкМ для ГИС), проводили в диапазоне концентраций 1-5 мМ. Использование концентраций фуросемида менее 1мМ не приводило к сколько-нибудь заметным изменениям ГАМК-активируемых токов. При этом верхняя граница концентрационного диапазона определялась пределом растворимости фуросемида в физиологическом растворе. Аппликация фуросемида во всем исследуемом диапазоне концентраций, в отсутствии ГАМК, не вызывала каких-либо изменений проводимости мембраны (длительность аппликации варьировалась от 1 с до 30 с). Однако в присутствии фуросемида вызываемые ГАМК ответы претерпевали изменения довольно сложного характера. Результаты совместных аппликаций ГАМК (ЕС20) и различных концентраций фуросемида представлены на Рис, 19 А, в виде записей токов вместе с наложенными на них записями контрольных ответов. Как видно на этих рисунках, действие фуросемида не сводится только к уменьшению амплитуды ответа, но также затрагивает и временной ход ответа. Следует, однако, отметить, что и ответы на аппликацию ГАМК, и ответы, вызываемые совместной аппликацией, полностью подавлялись в присутствии 20 мкМ бикукуллина. 3.2.2. Изменения ответов на ГАМК при совместной аппликации с фуросемидом. Серии опытов, в которых исследовались изменения ГАМК-вызываемых ответов под действием различных концентраций фуросемида, а также влияние мембранного потенциала на эффекты, вызываемые фуросемидом, проводилась с использованием фиксированных концентраций ГАМК - ЕСго- В силу ряда особенностей, ответы КП и ГИС на аппликацию ГАМК ЕС20 являются удобным объектом для исследования временных характеристик работы рецепторов. Так, в частности, зависимость амплитуды тока от времени в данном случае имеет довольно простой характер и позволяет выделить три фазы формирования ответа: фаза активации, плавно переходящая в фазу стационарного ответа, и фаза деактивации, вызванная прекращением аппликации ГАМК (см. Раздел 3-1.5.).
При этом, поскольку нет четкой временной границы между фазой активации и фазой стационарного ответа, все измерения, связанные с фазой стационарного ответа проводились в конце аппликации непосредственно перед стадией деактивации, как показано на Рис. 19А. Сравнивая записи контрольных экспериментов с записями токов, полученных при совместной аппликации ГАМК и фуросемида (Рис. 19 А), можно видеть, что действие фуросемида сказывается на всех выделенных стадиях ответа. Рассмотрим действие фуросемида на каждую фазу ответа более подробно. 3.2.3. Влияние фуросемида на скорость активации ответа в КП и ГИС В целом, присутствие фуросемида приводит к замедлению скорости активации в обоих типах клеток (Рис. 19 А). Для оценки влияния фуросемида на скорость активации экспериментальные данные, полученные при аппликации различных концентраций фуросемида совместно с ГАМК, а также данные, полученные в контрольных экспериментах, аппроксимировались одноэкспоненциальной функцией (4а) (Рис. 19 А). Полученные в результате такой аппроксимации значения такт([фуросемид]) для каждого нейрона относились к такт(0), полученному в контрольном эксперименте: т0ти([фуросемид]) = Такт([фуросемид])/та/ т(0), и затем усреднялись для группы нейронов. Результаты такой обработки приведены на Рис. 19 Б как зависимость тотн от концентрации фуросемида. В обоих типах клеток под действием фуросемида происходило концентрационно зависимое увеличение относительных времен активации ответа. Эта зависимость для обоих типов клеток носила монотонный характер (см. Рис. 19 Б). Значение параметра такт(0) для исследуемых групп нейронов составило: 100+4.6 мс(п=12) для КП и 92+6.1 мс(п=9) для ГИС. Полученные значения такт(0) являются характерными для данных типов нейронов, т.к. сравнение данных выборок с более обширными (см. Раздел 3.1.5.) не выявило существенных различий (рн=0.49 для КП Рн=0.57 для ГИС и рп=0.88 для КП рп=0.41 для ГИС). Значение параметра такт(5мМ) для исследуемых групп нейронов составило: 195+23 мс (п=б) для КП и 196±12 мс (п—7) для ГИС. Отличия Хакт(5мМ) и гакт(0) приняты значимыми (рн 0.03 для Ш\рн=0.0002 для ГИС ирп=0.004 для Шрл=0.0002 для ГИС). 3.2.4. Влияние фуросемида на амплитуду стационарного ответа вызванного ГАМК в КП и ГИС 3.2.4Л. Концентрационная зависимость эффектов фуросемида. Для оценки влияния фуросемида на ГАМК активируемые токи на данной стадии ответа, измеряли амплитуду трансмембранного тока 1ст([фуросемид]) при коаппликации ГАМК (ЕС2о) и различных концентраций фуросемида, а также амплитуду тока в контрольном эксперименте при аппликации только ГАМК- 1ст(0). Полученные значения 1ст([фуросемид]) относили к IQI{0) ДЛЯ каждого нейрона. Результаты такой обработки представлены на Рис. 20 В, в виде зависимости относительной амплитуды ответа от / г ч,\ Іст ([ Фуросемид] ) концентрации фуросемида: к\[ Фуросемид]) = - . I ст (0) Влияние фуросемида на стадии стационарного ответа для обоих типов клеток сводилось к уменьшению амплитуды ответа 1Ст, что позволяет говорить о блокирующем действии фуросемида на данной стадии формирования ответа. Угнетение амплитуды ответа происходило концентрационно-зависимым образом (Рис. 20 А). При этом аппликация фуросемида в концентрации 1мМ не вызывала ощутимого эффекта на трансмембранные токи (R(1MM) составляло 0.96±0.0І для КП и 0.94±0.01 для ГИС). Поскольку построение кривой доза-зависимость во всем диапазоне концентраций невозможно (из-за ограниченной растворимости фуросемида), то для количественной оценки блокирующего действия фуросемида была выбрана фиксированная концентрация вещества - 5 мМ (максимальная использованная концентрация фуросемида в данной серии экспериментов). Для обоих типов клеток, оценивали действие 5мМ фуросемида на токи, вызываемые аппликацией ГАМК (ЕС20 - 2 мкМ для КП и 15 мкМ для ГИС). Для этого измеряли 1ст([фуросемид]) и 1ст(0), затем вычисляли процент блока, вызываемого аппликацией 5мМ фуросемида в обоих типах клеток по формуле: Результаты измерений для группы из 34 нейронов Пуркинье и 25 ГИС представлены на Рис. 20 Б. Среднее значение для данных выборок нейронов составило 33.5±1.3% для КП и 56.4±2.8% для ГИС.
Различия в блокирующем действии являлись значимыми (pH 0.000Upn 0.0OOl). Несмотря на то, что построение полной кривой доза-ответ в данных условиях невозможно, тем не менее, аппроксимация уравнением Хилла была использована для получения оценок верхних и нижних границ интервалов, в которых находятся истинные значения величин JC50 для КП и ГИС. Для получения верхних границ зависимости относительных амплитуд от концентрации фуросемида были аппроксимированы уравнением (3) в предположении, что при увеличении концентрации фуросемида относительная амплитуда ответа асимптотически стремится к нулю (Ь = /) (см. Рис. 20 В). Для получения нижних границ, предполагалось, что максимальный блокирующий эффект достигается при аппликации 5 мМ фуросемида (Ь=1-Я(5мМ)). По результатам этого анализа, значения величин ІС50 для КП находились в интервале 2.8 мМ 1С so 8.9 мМ, а для ГИС в интервале 2.6 мМ 1С so 4J мМ 3.2.4.2. Зависимость эффектов фуросемида проявляемых от мембранного потенциала. Записи токов, вызванных аппликацией ГАМК, а также записи токов, вызванных совместной аппликацией ГАМК и 5 мМ фуросемида, сделанные в обоих типах клеток, при разных значениях мембранного потенциала- Умем приведены на Рис. 21 А, Б. Эти данные иллюстрируют зависимость блокирующего действия фуросемида от мембранного потенциала клетки. Для количественной оценки действия фуросемида, а также для оценки потенциала реверсии токов стационарной стадии ответа измеряли значение трансмембранного тока при аппликации ГАМК и при совместной аппликации ГАМК и фуросемида (как указано выше), при фиксированных значениях мембранного потенциала (от -70 до +70 с шагом 20 мВ). Для каждого нейрона значение 1аМ(Умем) нормировалось на 1 тр(-70мВ), полученное при аппликации ГАМК при мембранном потенциале -70мВ.
Эффекты, вызываемые ГАМК в КП и ГИС
Исследование концентрационной зависимости эффектов ГАМК выявило существенные различия в чувствительности ГАМКд рецепторов, локализованных на поверхности КП и ГИС. Было обнаружено, что рецепторы, находящиеся на поверхности КП, более чувствительны к действию ГАМК, чем рецепторы ГИС. Для оценки чувствительности рецепторов использовали аппроксимацию уравнением Хилла зависимости относительных амплитуд ответов нейронов от концентрации ГАМК. При этом вариабельность абсолютных амплитуд ответов, величина которых зависит от множества факторов, в том числе и не имеющих прямого отношения к работе рецепторов (размер нейрона, плотность рецепторов на поверхности мембраны и т.п.), в данном случае дает минимальный вклад в оценку параметров ЕС50 и h -коэффициент Хилла. Использование значений Імакс позволяет избежать неоднозначности в вычислениях относительных амплитуд, что особенно важно при аппликации высоких концентраций ГАМК, когда абсолютная амплитуда ответа изменяется в течение аппликации более чем в два раза из-за десенситизации. Такая методика измерений применялась большинством авторов и является стандартной при исследовании чувствительности ГАМКд рецепторов к действию ГАМК и различных модуляторов. Использование относительных амплитуд ответов для аппроксимации уравнением Хилла является обычным способом обработки данных при исследовании концентрационной зависимости, а использование стандартных алгоритмов аппроксимации позволяет избежать субъективности в оценке таких величии как ЕС50 и h. Значения величин ЕС5о, полученные для отдельных нейронов, принадлежащих разным типам (КП и ГИС), находились в неперекрывающихся диапазонах концентраций. Значения средних арифметических для ЕС50 для данных типов нейронов, различались почти на порядок (3.2 мкМ для КП против 28.4 мкМ для ГИС). При этом, отдельные значения ЕС50 в каждой группе (в группе нейронов КП и в ГИС) были распределены более или менее равномерно около среднего арифметического значения (хотя в случае КП значения ECso сгруппированы более плотно). Такой характер распределения величин ЕС5о позволяет утверждать, что внутри каждой группы исследованные нейроны (а следовательно, и расположенные на них ГАМКА рецепторы) однородны по своей чувствительности к ГАМК.
Более того, характер зависимости доза-ответ, а именно отсутствие точек перегиба на этой кривой позволяет предположить, что в целом рецепторы на каждом отдельном нейроне либо слабо различаются по чувствительности к ГАМК, либо представлены в основном одним типом рецепторов (в отличие, например, от пирамидных нейронов СА1 гиппокампа (Tietz et al. 1999)). Следует отметить, что, обсуждая различие величин ЕС50 Для КП и ГИС (в отношении ГАМК и веществ-модуляторов), некорректно говорить о различной аффинности этих рецепторов к агонисту. Это связано с тем, что наблюдаемые величины ЕС5о не связаны непосредственно с аффинностью рецептора или эффективностью переходов в открытое состояние (Colquhoun 1998). В научной литературе имеется несколько работ, в которых также проводилось измерение величин ЕС50 для ГАМКд рецепторов КП и ГИС (Валеев и соавт. 1986; Колбаев и соавт. 1999; Itier et al. 1996; Vorobjev et al. 1995), Величины EC5o для КП довольно хорошо совпадают с измеренными в данной работе (3.2 мкМ): 2 мкМ (Валеев и соавт. 1986), 3.98 мкМ (Itier et al. 1996), 4.1 мкМ в (Vorobjev et al. 1995), 3.9 мкМ (Колбаев С.Н. и соавт 1999) (в двух последних работах использовалась одинаковая система аппликацией). Величины же ЕС5о, измеренные в данной работе для ГИС (28.4 мкМ), лишь по порядку величины совпадают с результатами других авторов: 8 мкМ (Itier et al. 1996), 11 мкМ в (Sergceva 1998) (в последней работе для построения кривой доза зависимость использовались абсолютные величины ответов). Сравнительные исследования чувствительности КП и ГИС к ГАМК представлены лишь работой (Itier et al. 1996). Так, авторами было отмечено, что чувствительность КП к ГАМК примерно в два раза выше, чем для ГИС. Качественно это совпадает с результатами данного исследования. Количественное расхождение в оценках значений ЕС50, может быть связано с тем, что авторами (Itier et al. 1996) использовалась система аппликации, отличная от той, что использовалась нашей работе. К сожалению, в цитируемой работе не было сделано никаких оценок скорости изменения растворов у поверхности клеток, что является существенным фактором в оценке величин ЕС.50- При медленной смене раствора на амплитуду ответа будут оказывать существенное влияние не только быстрые процессы активации/деактивации рецепторов, но и более медленные процессы десенситизации. В результате амплитуды ответов на аппликацию высоких концентраций ГАМК при использовании медленной системы аппликации будут занижены по сравнению с таковыми, полученными при использовании быстрой системы аппликации, что в конечном итоге приведет к заниженной оценке величины ЕС50 (Hevers et al. 1998; Verdoorn et al. 1990). При сопоставлении величин EC50 полученных в данной работе для КП и ГИС с таковыми для рекомбинантных рецепторов, следует учесть разнородность этих величин в последнем случае и сильную зависимость значений ЕС50 от используемой системы экспрессии (Hevers et al. 1998). Это связано, в частности и с тем, что система пострансляционного процессинга в линиях клеток НЕК 293 и L929 отлична от таковой в ооцитах (гликозилироваиие белков в последнем случае протекает несколько по иному (Hevers et al. 1998; Stuhmer et al. 1995)). Согласно (Costa 1998; Hevers et al. 1998) чувствительность рекомбинантных ГАМКд рецепторов к ГАМК зависит главным образом от природы а субъединицы, входящей в состав рецептора. Авторами (Ducic et al. 1995) ГАМКд рецепторы были разделены по своей чувствительности на высокочувствительные (ЕС50 1 мкМ) среднечувствительные (ЕС50 10 мкМ) и низкочувствительные (ЕС50 10 мкМ) (Costa 1998; Ducic et al. 1995; Hevers ct al. 1998). К первому типу относятся а6 содержащие рецепторы, ко второму широкий класс aj, «4 и а$, к третьему аз, данные о чувствительности а2 рецепторов отсутствуют (аб аі а5 а4«аз, причем чувствительность оцаз - содержащих рецепторов была близка к чувствительности аз - рецепторов (Ebert et al. 1994; Kleingoor et al. 1993)). Таким образом, по значениям величин ЕС50 для ГИС, их ГАМКА рецепторы близки к низкочувствительной группе (аз - содержащие рецепторы), а рецепторы КП близки к среднечувствительной группе (ои, ( 4 и (Х5 рецепторы).
В ходе изучения концентрационной зависимости эффектов ГАМК было установлено, что наиболее удобными для изучения действия модуляторов являются ответы на аппликацию ГАМК в концентрации ЕС20 (см. также (Vorobjev et al. 1995) и ниже). Во-первых, как отмечалось ранее, при увеличении концентрации апплицируемой ГАМК важным фактором в формировании ответа становятся явления, связанные с десенситизацией ГАМКд рецепторов. При этом стабильная регистрация ответов возможна лишь при достаточно низких концентрациях ГАМК. Нижний предел концентраций ограничивается возможностью надежного определения амплитуды ответа, вызванного данной концентрацией ГАМК (отношением сигнал/шум). Оптимальная величина ответа в данных условиях 1 нА (по порядку величины). Во-вторых, желательно, чтобы выбранная концентрация соответствовала линейному участку кривой доза-ответ, т.е. была вне пределов зоны насыщения ответа. Это позволяет наиболее корректно исследовать модулирующее действие различных веществ. В-третьих, именно эта эффективная концентрация была использована авторами (Neelands et al. 1999с; Neelands et al. 1999b; Neelands et al. 1999a) при исследовании модулирующего действия лореклезола, зольпидема. Целым рядом авторов сравнение модулирующего действия веществ на различных рецепторах проводилось именно при одинаковых эффективных концентрациях ГАМК (см выше). Строгого обоснования этому условию нет. Однако на рекомбинаитных рецепторах было показано, что значения величин ЕС50 и А(оо) различных модуляторов (в цитируемой работе - лореклезола) зависят, помимо прочего, от используемой эффективной концентрации агониста (Neelands et al. 1999b). Аналогичная зависимость была показана и в данной работе для LaCl3 (см. раздел Результаты: 3.5. и 3.5.5.). Так, при аппликации 50 мкМ ГАМК, что соответствует ЕС7з для ГИС и ЕС99ДЛЯ КП, потенциирующее действие LaCb (100 мкМ) составляло 20% для ГИС, а в КП видимого эффекта не наблюдалось,
