Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Литературный обзор 9
1.1. Комплементарно адресованная модификация, перспективы биологических приложений подхода 9
1.2. Конструкции и основные свойства реагентов для комплементарно адресованной модификации нуклеиновых кислот ю
1.2.1. Реакционноспособные терминальные производные олиго- и полинуклеотидов 11
1.2.2. Полимодифицирующие реагенты 18
1.3. Комплементарно адресованное алкилирование 2 ,3 -0-[4-(и-2-хлорэтил-и-метиламино)бензилиден]олигонуклеотидами 30
1.3.1. Комплементация 2',з'-0-[4-(ш-2-хлорэтил-н-метиламино)бензилиден]олигонуклеотидов ... 31
1.3.2. Механизмы алкилирования в комплементарных комплексах ........ 34
1.4. Влияние олигонуклеотидов на биохимические и биологические процессы в культурах живых клеток 37
Глава 2. Результаты и обсуждение результатов . . 48
2.1. Обоснование методов анализа и фракционирования биополимеров клеток асцитной карциномы Кребс-2 49
2.2. Сорбция бензилиденовых производных олиго-нуклеотидов клетками асцитной карциномы Кребс-2 61
2.3. Алкилирование биополимеров в клетках асцитной карциномы Кребс-2 г С]-производными нонатимидилилуридина 69
2.4. Анализ специфичности внутриклеточного ал-килирования нуклеиновых кислот 73
2.5. Химическая направленность внутриклеточного алкилирования нуклеиновых кислот
2.6. Сохранность адреса реагентов, ковалентно связанных комплементарными нуклеиновыми кислотами в клетках асцитной карциномы Кребс-2 81
2.7. Кинетика и механизм внутриклеточного алкилирования 84
2.8. Жизнеспособность клеток асцитной карциномы Кребс-2, экспонированных с реагентами .91
Глава 3. Экспериментальная часть 95
3.1. Вспомогательные материалы и методики ... .95
3.2. Реагенты и их оксианалоги .97
3.3. Культура клеток 99
3.4. Выделение ядер
3.5. Исследования сорбции реагентов и их окси-аналогов Ю1
3.6. Исследование алкилирования биополимеров в клетках 102
3.7. Выделение суммарной РНК клеток 104
3.8. Выделение ДНК клеток 105
3.9. Выделение poly(А)-трактов мРНК 107
ЗЛО. Микроколоночная гель-хроматография poly (А)+- мРНК 108
3.11. Идентификация алкилированных в клетках оснований нуклеиновых кислот 108
3.12. Определение цитотоксичности реагентов и их оксианалогов Ю9
Выводы 113
Цитированная литература 115
- Комплементарно адресованная модификация, перспективы биологических приложений подхода
- Обоснование методов анализа и фракционирования биополимеров клеток асцитной карциномы Кребс-2
- Вспомогательные материалы и методики
Введение к работе
Актуальность проблемы. Поиск и разработка подходов селективного воздействия на структуры и функции нуклеиновых кислот живых клеток и многоклеточных организмов принадлежит к важнейшим задачам молекулярной биологии. В основу подхода, развиваемого в настоящей работе, положен принцип комплементарно адресованной модификации нуклеиновых кислот.
Комплементарно адресованная модификация представляет разновидность аффинной модификации биополимеров в приложении к нуклеиновым кислотам и характеризуется использованием реагентов, специфичность которых программируется комплементарными нуклеиновой кислоте-мишени олиго- и полинуклеотидами, а реакционноспособность - присоединенными функциональными группами обычно алкилирущего типа.
Специфичность и эффективность комплементарно адресованной модификации, неоднократно демонстрировавшиеся в бесклеточных системах, служат необходимым основанием для исследований возможностей этого способа воздействия на нуклеиновые кислоты в живых клетках.
Цель работы. Основная цель состояла в получении доказательств комплементарно адресованного характера внутриклеточной модификации нуклеиновых кислот алкилирувдими терминальными производными олигонуклеотидов, внесенными в культураль-ную среду.
Научная новизна. Впервые осуществлена внутриклеточная комплементарно адресованная модификация нуклеиновых кислот.
Обнаружены зависимости процессов сорбции реагентов клетками и внутриклеточного алкилирования от суммарного заряда и размера олигонуклеотидных фрагментов реагентов. Показано, что специфичность в отношении нуклеиновых кислот выше у неионных реагентов. Отмечено, что внутриклеточное алкилирование протекает со скоростями, существенно превосходящими допустимую механизмом s^i в бесклеточных системах.
Практическая ценность. Результаты исследований утверждают перспективность применения комплементарно адресованных реагентов в целях направленного воздействия на нуклеиновые кислоты в живых клетках и создают основания для расширения фронта и интенсификации работ в этом направлении. Ближайшим выходом таких работ может стать выяснение функциональной значимости отдельных участков нуклеиновых кислот посредством их блокирования в клетках комплементарно адресованными реагентами.
Объем работы. Диссертация состоит из введения,3-х глав, выводов и списка цитированной литературы. В главе I представлены сведения о конструкциях и свойствах реагентов, применяемых и предназначенных для комплементарно адресованной модификации; освещена специфика комплементарно адресованного алкилирования в простых системах in vitro с применением однотипных использованным в работе реагентов; обсуждены исследования биохимических и биологических эффектов олигонуклео-тидов и их аналогов на живые клетки в культуре. Глава 2 представляет собственные исследования и их обсуждение. Экспериментальная часть описана в главе 3. Вся работа изложена на 136 страницах машинописного текста, включая 19 таблиц и 7 рисунков. Список литературы содержит 157 названий.
Объект исследования. Исследования выполнены на клетках асцитной карциномы Кребс-2 с применением 2'f3'-0-[4-(N-2--хлорэтил-и-метиламино)бензилиден]овых производных смешанных дезоксирибо(рибо)олигонуклеотидов как этилированных, так и неэтилированных по межнуклеозидным фосфатным группам.
Комплементарно адресованная модификация, перспективы биологических приложений подхода
Принцип комплементарно адресованной модификации, предоставляющий уникальную возможность химической модификации любых произвольно выбранных последовательностей нуклеиновых кислот, впервые был сформулирован в работах [I, 2]. Реализация этого принципа осуществлена на целом ряде объектов -тРНК, рРНК, денатурированных ДНК и их фрагментах - в простых системах in vitro с применением олиго- и полинуклеотидов с терминально присоединенными остатками ароматических 2-хлор-этиламинов (см. [3] и обзоры [4-6]). Высокие эффективность и селективность комплементарно адресованной модификации (ал-килирования) позволили включить в круг практических выходов метода химическое фрагментирование нуклеиновых кислот, маркирование и изучение их функционально значимых участков, ограничение действия ферментов и др. [6]. Кроме того, достижения подхода стимулировали поиск его новых приложений, а также работы по синтезу комплементарно адресованных реагентов разнообразных конструкций. Так, например, недавно осуществлена in vitro направленная модификация ДНК фага Т7 полиал-килирующими РНК - транскриптами генов фага [7, 8].
К настоящему времени созданы достаточные основания для биологических приложений комплементарно адресованных реагентов на основе олигонуклеотидов [9, 10].Разработаны и применяются эффективные и, в том числе, автоматизированные методы препаративного получения олигодезоксирибонуклеотидов и их неионных (триэфирных) производных [II]. Дополнительные и альтернативные возможности увеличения масштабов производства олигодезоксирибонуклеотидов желаемой первичной структуры предоставляются техникой клонирования плазмид [12]. Прогресс в области синтеза реакционноспособных производных олиго- и полинуклеотидов также существенен [13]. Как следствие, уже сейчас обсуждаются такие, ориентированные на применение комплементарно адресованных реагентов, программы, как направленный мутагенез in vivo, лечение вирусных заболеваний, подавление вирусного онкогенеза внутриклеточным блокированием генетического материала вирусов и др. [7-Ю, 14]. Ясно, однако, что обращение к столь сложно организованным функционирующим системам, какими являются многоклеточные организмы, было бы преждевременным в отсутствии доказательств комплементарно адресованного характера внутриклеточной модификации нуклеиновых кислот и исследований ее специфики на более простых биологических объектах - эукариотических клетках, живущих вне организма. Именно в этом направлении и выполнена представляемая работа.
Обоснование методов анализа и фракционирования биополимеров клеток асцитной карциномы Кребс-2
В первых работах [ЮЗ, 104] по внутриклеточному алкилиро-ванию г4С]-бензилиденовыми производными олигонуклеотидов исследовалось распределение радиоактивной метки по трем основным классам биополимеров - РНК, ДНК и белкам. Для определения содержания метки в биополимерах была использована классическая методика количественного определения РНК и ДНК Шмидта и Тангаузера в модификации [108]. Следуя методике, отмытые клетки разрушали кислотой и отделяли кислотораство-римуго фракцию; РНК и связанную с ней метку переводили в кис-лоторастворимое состояние щелочным гидролизом; далее такая же цель в отношении ДНК достигалась кислотным гидролизом; наконец, метку в оставшемся кислотонерастворимом материале относили на счет алкилированных белков. Спектрофотометрия и измерение радиоактивности соответствующих кислотораствори-мых фракций позволяют рассчитать степень модификации нуклеиновых кислот и оценить эффективность их внутриклеточного алкилирования [103, 104].
При использовании описанной методики нами для оценки эффективности алкилирования биополимеров в клетках АКК реагентами II и III было обнаружено, что распределение метки по биополимерам, тестированное непосредственно после смешения клеток с реагентами и спустя сутки практически одинаково. Учитывая сравнительно большой размер адресующей части реагентов, было сделано предположение о соосаждении их в условиях кислотной дезинтеграции клеток и отмывки кислото-растворимой фракции, что полностью подтвердилось экспериментами с нереакционноспособными аналогами На и 111а.
Поскольку отмывка соосажденных производных олигонуклео-тидов кислотой оказалась неэффективной, вскрытие клеток кислотной обработкой заменили осмотическим шоком с последу-щим трехкратным "замораживанием-оттаиванием". В этом случае количественное отделение сорбированных На и Ша достигается (см. данные табл. I) обработкой гомогенатов 70 -ным этанолом в присутствии 0,3 М ацетата натрия или 0,14 М NaCi, рН 7,5. Подчеркнем, что На и Ша были добавлены к клеткам в концентрации, на порядок большей, чем реагенты в типичных экспериментах. Из данных табл. 2 видно, что при использовании реагентов И и НІ в условиях отмывки происходит незначительное и согласующееся с расчетным алкилирование биополимеров реагентами, внесенными в гомогенат.
class3 Экспериментальная частьclass3
Вспомогательные материалы и методики
Взрослые беспородные белые мыши и мыши линии CC57BR предоставлены виварием ИЦиГ СО АН СССР (г. Новосибирск). 199 среда была приготовления Свердловсокого НИИ вирусных инфекций, антибиотики - Красноярского завода медпрепаратов.
Буферные растворы готовили, используя 4-(2-гидроксиэтил)--1-ПИПераЗИНЭТансуЛЬф0КИСЛ0Ту (HEPES, Calbiochem, США) и
2-амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол (трис, Reanal, Венгрия) , предварительно перекристаллизованный из бидистилли-рованной воды.
Ферменты РНКаза А (КФ 3.1.4.22) и РНКаза Tj (КФ 3.1.4.8) - препараты фирмы Sigma, США; ДНКаза І (КФ 3.1.4.5) - фирмы Worthington, США.
В работе использованы краситель трипановый синий (Chema-poi, Чехословакия) и детергенты сапонин (Merck, ФРГ), тритон Х-100 (Schuchardt ,ФРГ) и додецилсульфат натрия (Sigma, США).
Poiy(u) и poiy(A) синтезированы полимеризацией уридин- и аденозин-5 -дифосфата, соответственно, с помощью полинукле-отидфосфорилазы Е.СОІІ в(КФ 2.7.7.8) описанным нами способом [137, 138]. Нуклеозид-б - дифосфаты фирмы Reanal (Венгрия) предварительно очищали ионообменной хроматографией [139] В расчетах концентраций и количеств полирибонуклеотидов использовали коэффициенты молярных экстинкций, определенные в работе [141].
Иммобилизация poiy(u) на BrCN-сефарозе 4В осуществлена по методу работы [141]обеспечивающему ковалентное связывание полинуклеотидов по реакции их терминальных фосфомоноэфирных групп реакционноспособными центрами активированного носителя. Преобработка сухой BrCN-сефарозы 4В выполнена в соответствии с рекомендациями фирмы [142]. Удельное содержание Р-1у(и) в приготовленных препаратах сорбента было 2,9 мкмоль на мл; емкость сорбента в отношении poly(А), определенная в условиях выделения роіу(А)+-мРНК (см. ниже), составляла 1,4 мкмоль на мл.
Бумажная хроматография выполнена на бумаге EN-і (Filtrak, ГДР), гель-хроматография - на биогеле А-1,5м (Bio-Rad, США). BrCN-сефароза 4В и голубой декстран 2 000 были фирмы Pharmacia .Швеция.
Органические растворители - диметилсульфоксид, хлороформ, этанол и другие - очищали стандартными способами, включающими перегонку [143]. Фенол перегоняли [144], непосредственно перед употреблением насыщали водой и оттитровывали КОН до рН 6, 7,5,или 8,3 [117].
Сахарозу очищали деионизуя ее 2 М раствор последовательным пропусканием через колонки с дауэксом-50 и дауэксом-1 [145] .
